一种增强植物对缺铁耐受及积累的编码基因及应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及植物对耐缺铁胁迫相关蛋白的编码基因,同时，涉及利用该基因增强植物对缺铁环境的耐受能力，由此可能正向调节植物缺铁胁迫应答。

背景技术：

铁是一种金属元素，原子序数为26，位于元素周期表第四周期，是生活中最常用的金属之一。对于人、动物和植物的生存来说，铁是所必不可少的微量元素。在植物体内，铁元素是植物需求量最大的微量元素，在植物的生命活动中起到重要的作用，例如参与植物叶绿素的合成、光合作用和呼吸作用等。虽然铁元素在土壤中的含量高，但是由于铁的化学性质非常活泼，而且铁在土壤中的溶解度很低，导致植土壤中物很难从土壤中获取足够用于生长发育的铁，因此有大量的植物处于缺铁的状态。植物缺铁多发生在ph>7的碱性或石灰质土壤中。植物轻度缺铁会影响生长，导致叶绿素的合成缓慢、含量降低，从而影响光合作用；严重缺铁的情况下，会导致叶绿素无法合成，叶片颜色变黄，光合作用过程受阻，植物生物量会下降，导致植物无法生长。而植物是人和动物的主要食物，植物可食部位铁元素的缺乏会导致人和动物铁元素的摄取量达不到正常要求，导致人和动物免疫力的下降以及缺铁性贫血的频发，铁缺乏是世界上最常见的隐性饥饿之一，因为铁缺乏不易被觉察，但同样会不利于人和动物的生长发育和繁殖。

铁元素在生物的生长发育过程中所必不可少的，但是由于全球土壤结构的特点，以及铁元素自身化学性质的限制，导致植物缺铁现象的普遍发生，人类铁营养匮乏的情况严重。不同植物的铁吸收和转运机制不同，导致不同植物的缺铁耐受性差异较大。禾本科植物特有的铁吸收转运机制更利于植物在缺铁土壤中生长，而且人类膳食中的主食主要为大米、玉米和麦，这些作物都是属于禾本科。解决植物的缺铁情况，通过增加土壤中的铁含量这种方法不切实际，这种方法耗时耗力且功效不明显，依赖补铁剂的改善作用只能维持短期效果，所以利用分子育种技术，将在植物缺铁应答中起重要作用的基因导入作物中，提高作物的缺铁耐受性，从而改善作物的缺铁耐受能力，提高作物的铁含量，才能从根本上解决人类铁营养匮乏的问题。

利用模式生物拟南芥作为实验材料，研究植物缺铁响应中的相关基因的功能。首先，拟南芥只有5对染色体，数目很小；且个体小,可以大量培养。其次，拟南芥发育生长周期极快，在短期内就能繁育多代，满足对变异和进化的要求；第三，拟南芥每次可以产生数千枚种子，满足遗传上统计的要求。最重要的就是拟南芥还是严格的闭花自花传粉,可以保证稳定遗传。正因为上述优点,传统遗传学以拟南芥为材料进行了很多研究,累积了大量资料,对于现在从基因水平上研究提供了便利，拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此将拟南芥作为研究对象能够更快更好的达到实验预期目标，可以很大程度上缩短实验时间和简化实验条件。

拟南芥是目前世界上研究最为透彻的物种，大量的拟南芥基因功能得到阐明，这为利用模式物种信息进行栽培作物的改良奠定了良好的基础。通过对突变体的研究，发现了一些与植物相关的调控铁转运的基因,如nas、mate、myb10等。进一步了解拟南芥缺铁响应调控网络，为使用分子育种技术改善作物铁营养的农业生产方面提供更多的理论依据，从而改善提高人类铁营养，具有重大的现实意义。

面对土壤中铁含量缺乏的问题，寻找能够适应缺铁环境的功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种增强植物对缺铁耐受性并提升植物铁含量的编码基因；本发明的第二个目的是提供所述编码基因在增强植物耐缺铁环境以及增加植物中铁含量方面的应用。

本发明所述增强植物对缺铁耐受性并提升植物铁含量的编码基因，命名为bzip44(at1g75390)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，所述编码基因的名称与基因编号来源于拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）。

所述增强植物对缺铁耐受性并提升植物铁含量的编码基因的dna序列如序列表seqidno：l所示。

所述增强植物对缺铁耐受性并提升植物铁含量的编码基因的多核苷酸序列如序列表seqidno：2所示。

所述增强植物对缺铁耐受性并提升植物铁含量的编码基因包括与序列表中seqidno：l限定的dna序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的dna序列。

将所述序列表seqidno：l所示的增强植物对缺铁耐受及积累的编码基因转入植物中，使植物中的增强植物对缺铁耐受及积累的编码基因过量表达，所述植物为拟南芥。

本发明的具体应用是利用基因工程技术构建35s:bzip44过量表达载体，通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为对缺铁环境耐受。将bzip44基因构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，使其具有抗性的抗生素标记物（卡那霉素）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如:水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明bzip44基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明所述增强植物对缺铁耐受及积累的编码基因可为农作物耐缺铁环境育种和增加农作物中的铁积累提供基因资源和技术支持。

根据拟南芥数据库公布的基因组序列，bzip44(at1g75390)是拟南芥bzip转录因子家族中的成员，bzip是近年来在植物体内普遍存在的转录调控因子，属于bzip家族转录调控因子。申请人发现缺铁处理bzip44基因缺失植株表现为对缺铁敏感，这表明bzip44基因涉及对缺铁耐受性的调控。为此，我们研究了该基因功能，研究结果表明，在bzip44基因缺失时缺铁处理会抑制nas2基因及基因转录表达，且bzip44突变体中茎中的铁含量显著低于野生型，这说明基因bzip44基因通过调控拟南芥中烟酰胺合成酶nas编码基因的表达从而调控铁在拟南芥体内的转运，进而调节植物对缺铁耐受及积累。

附图说明

图1为t-dna插入位点示意图；

图2为bzip44植株qrt-pcr分析图；

图3为qrt-pcr分析不同时间处理下bzip44基因的表达变化图；

图4为bzip44突变体植株在加铁和缺铁下表型分析图；

图5为bzip44过表达植株在加铁和缺铁下表型分析图；

图6为wt，bzip44和bzip44过表达植株叶绿素含量检测图；

图7为野生型与bzip44的铁含量比较图；

图8为在不同时间缺铁胁迫下野生型和bzip44植株体内atnas2基因表达图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。

序列表seqidno：1所示的一种增强植物对缺铁耐受及积累的编码基因为从美国拟南芥种质资源库获得的拟南芥突变体种子筛选响应植物缺铁胁迫的突变体。

实施例1、bzip44转基因植株转录水平鉴定及其对缺铁响应

比较使用不含有铁的ms培养基对拟南芥种子突变体库进行筛选，获得了一株对缺铁敏感的突变体，筛选鉴定发现该突变体为bzip44基因功能缺失突变体，命名为bzip44。因为该种子为t-dna插入突变，通过特异引物进行pcr扩增并测序，测序结果在ncbi数据库blast比对，综合分析得出t-dna插入位点信息，参见图1。利用qrt-pcr，对bzip44突变体进行转录水平鉴定，发现这两个突变体中bzip44基因的表达水平均显著低于野生型，见图2。参见图3为了进一步确定bzip44基因是否响应植物缺铁胁迫，我们提取了不同时间缺铁处理的野生型拟南芥rna并反转录成为cdna，利用qrt-pcr进行bzip44基因的转录分析，发现bzip44基因被缺铁胁迫显著诱导。

参见图4，将野生型(wt)与bzip44同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基为加铁和不加铁的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：bzip44突变体与野生型植株（wt）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于ms和-fe的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片图，见图4中a；其中ms培养基为对照在ms培养基上生长的wt和bzip44在根长（见图4中b）、鲜重（见图4中c）等方面均无显著差异。在植株直接点种在不含有铁的培养基上培养，bzip44表现出明显的缺铁敏感的性状。在缺铁胁迫下，bzip44的根长和鲜重明显比wt高。上述结果表明，bzip44较wt对缺铁胁迫表现出明显敏感。

实施例2、培育耐缺铁拟南芥

1、bzip44基因过量表达转基因株系bzip44-oe1、oe2的获得

为进一步验证该基因在植物缺铁胁迫调控中的功能，我们构建了bzip44基因过量表达载体（35s:bzip44）。首先进行目的片段扩增。将野生型拟南芥在ms培养基上正常培养两周，提取植株总rna，反转录合成cdna，以合成的cdna为模板，进行pcr，扩增出足够量的目的产物。再以pcr产物为模板，进行第二次扩增，目的是引入酶切位点。将pcr产物与载体pcambia1301进行酶切回收。再将回收纯化好的目的dna片段和载体用t4dna连接酶连接过夜。将上述连接液转入dh5a中，检测筛选出阳性克隆进行测序。测序结果确定无误后，利用电击转化法转入农杆菌gv3101。电击转化后的农杆菌gv3101，经活化后涂布于含双抗（kan，gen）的lb培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗（kan，gen）的lb培养液中扩培并抽提质粒。用ncoi和bsteⅱ双酶切鉴定重组载体无误，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，从而获得bzip44基因过表达转基因株系。

2、bzip44过表达转基因植株转录水平鉴定及与野生型植株的耐缺铁性比较

通过对bzip44过表达转基因植株进行了转录水平的鉴定，最终选择oe1和oe2进行下一步实验。参见图5，将野生型(wt)与bzip44-oe1和oe2同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基为加铁和不加铁的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：转基因植株bzip44-oe1和oe2与野生型植株垂直培养，直接点种于含有或不含有铁的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片图（见图5中a）；其中ms培养基为对照。在ms培养基上生长的wt和bzip44-oe1、oe2在根长（见图5中b）、鲜重（见图5中c）均比野生型要低；在植株直接点种在不含有铁的培养基上培养，bzip44-oe1、oe2都表现出明显的镉耐受的性状。在缺铁胁迫下，bzip44-oe1、oe2根长与野生型无明显变化，但是鲜重要显著高于wt。上述结果表明，bzip44-oe1、oe2较wt对缺铁胁迫表现出明显耐受。

3.bzip44相关材料的叶绿素含量检测

参见图6，bzip44突变体、过表达植株和野生型植株（wt）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于加铁和缺铁的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周。分别检测不同条件下各材料中的叶绿素含量，结果发现在加铁培养基上生长的bzip44突变体、过表达植株和野生型植株（wt）在叶绿素含量上均无显著差异；而在缺铁培养条件下，bzip44中的叶绿素含量（见图6中a）要显著低于野生型；而bzip44-oe1、oe2中的叶绿素含量（见图6中b）要显著高于野生型。

4.野生型和bzip44突变体中的铁含量分析

参见图7，bzip44突变体和野生型植株（wt）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于加铁和缺铁的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周。分别检测不同条件下各材料根和茎中的铁含量。结果发现，在正常条件下，bzip44根中的铁含量（见图7中a）与野生型无明显差异，而bzip44茎中的铁含量（见图7中b）要显著低于野生型；在缺铁条件下，bzip44茎和根中的铁含量均低于野生型。

5、缺铁胁迫下bzip44与野生型植株中nas2基因表达比较

参见图8，取在不同时间缺铁处理下的bzip44与野生型植株，提取rna，反转后进行rt-pcr，对相关基因表达水平进行测定，发现bzip44植株体内atnas2基因明显低于wt，表明bzip44植株对缺铁敏感可能与atnas2基因的抑制有关。

sequencelisting

<110>合肥工业大学

<120>一种增强植物对缺铁耐受及积累的编码基因及应用

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