本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及rit1在肝细胞癌的诊断和治疗中的应用。
背景技术：
：：肝细胞癌在所有肿瘤中发病率排名第六，肝细胞癌每年新发病例将近80万。目前肝细胞癌的治疗手段有很多种，包括手术切除、肝脏移植、肿瘤消融、经动脉肿瘤栓塞术、系统性治疗等，但中晚期肝细胞癌患者从治疗中获得的受益较低，生存期较短，预后差。现在针对肝细胞癌一线靶向药较少，并且具有耐药性。因此，本领域迫切需要开发具有诊断或预后预测和治疗作用的新靶点以及克服耐药的新方法。技术实现要素：本发明的目的就是提供具有诊断或预后预测和治疗作用的新靶点以及克服耐药的新方法。本发明第一方面提供了一种rit1基因、mrna、cdna、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测肝细胞癌肝细胞癌的组织分级的标志物；和/或(ii)用作检测肝细胞癌发生转移风险的标志物；和/或(iii)用作判断肝细胞癌患者预后和生存期的标志物；和/或(iv)用于制备检测肝细胞癌的组织分级的诊断试剂或试剂盒；和/或(v)用于制备检测肝细胞癌发生转移风险的诊断试剂或试剂盒；和/或(vi)用于制备用作判断肝细胞癌患者预后和生存期的诊断试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如dna芯片)或蛋白质芯片。在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。在另一优选例中，所述的rit1基因、mrna、cdna、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人，更佳地，来源于被诊断患有肝细胞癌的患者。在另一优选例中，所述rit1基因、mrna、cdna、或蛋白来源于肝细胞癌患者。在另一优选例中，所述rit1基因的登录号为6016。在另一优选例中，所述rit1mrna的登录号为nm_001256821.2。在另一优选例中，所述rit1蛋白的登录号为np_001243750.1。在另一优选例中，所述检测是组织样本检测。在另一优选例中，所述的检测包括免疫组化、免疫印迹和荧光定量pcr方法检测。在另一优选例中，所述转移包括肝内转移和肺转移。在另一优选例中，所述的检测是测定肝细胞癌组织、或一般肝组织样品。在另一优选例中，所述的一般肝组织包括癌旁组织。在另一优选例中，所述检测试剂包括rit1的特异性抗体、rit1的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。在另一优选例中，所述的rit1蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。在另一优选例中，所述rit1的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在另一优选例中，所述肝细胞癌的组织分级包括ⅰ期，ⅱ期，ⅲ期，ⅳ期。在另一优选例中，所述的转移风险指n年的转移风险，其中n为1-5的任意数字(包括小数)。本发明第二方面提供了一种用于(i)检测肝细胞癌的组织分级；和/或(ii)检测肝细胞癌发生转移风险；和/或(iii)判断肝细胞癌患者预后和生存期的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测rit1基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测(i)检测肝细胞癌的组织分级；和/或(ii)检测肝细胞癌发生转移风险；和/或(iii)判断肝细胞癌患者预后和生存期。在另一优选例中，所述的检测肝细胞癌发生转移风险指检测肝细胞癌是否已发生、发生的转移部位，和/或判断发生肝细胞癌转移的可能性(易感性)大小。在另一优选例中，所述肝细胞癌的组织分级包括ⅰ期，ⅱ期，ⅲ期，ⅳ期。在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。在另一优选例中，所述的检测rit1基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂包括：(a).抗rit1蛋白的特异性抗体；和/或(b).特异性扩增rit1的mrna或cdna的特异性引物。在另一优选例中，所述检测是组织样本检测。在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：(a)当检测对象的肝细胞癌细胞或组织中rit1表达量e1与一般肝细胞或组织的rit1表达量e2之比≥2，则提示该检测对象肝细胞癌发生肝内转移风险的几率高于一般人群；(b)当检测对象的肝细胞癌细胞或组织中rit1表达量e1与一般肝细胞或组织的rit1表达量e2之比≥2，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群；其中，所述的e2是一般人群的一般肝细胞或组织的rit1的表达量。在另一优选例中，所述的一般肝细胞或组织包括癌旁的肝细胞或组织。本发明第三方面提供了一种(i)检测肝细胞癌发生转移风险；和/或(ii)判断肝细胞癌患者预后和生存期的方法，所述方法包括：a)提供来自受试者的测试样品；b)检测测试样品中rit1蛋白的表达量e1；和c)将步骤b)中所测定的rit1蛋白的表达量与对照进行比较，其中与所述对照相比，所述样品中rit1蛋白的表达量高于参比值，表明受试者发生转移风险的几率高于一般人群(对照组人群)；和/或rit1蛋白的表达量低于参比值，表明受试者发生肝内转移风险的几率低于一般人群(对照组人群)；和/或与所述对照相比，所述样品中rit1蛋白的表达量高于参比值，表明受试者的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(对照组人群)；和/或rit1蛋白的表达量低于参比值，表明受试者的预后不良和生存期缩短的几率低于一般人群(对照组人群)。在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述测试样品为肝细胞癌细胞或组织。在另一优选例中，所述参比值为截断值(cut-off值)。在另一优选例中，所述参比值为样品中rit1的相对表达水平。在另一优选例中，所述参比值为3.5。在另一优选例中，所述检测步骤(ii)包括检测rit1mrna的量、或rit1cdna的量；和/或检测rit1蛋白的量。在另一优选例中，通过荧光定量pcr或免疫组织化学检测样品中的rit1蛋白的表达水平。在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。本发明第四方面提供了一种确定治疗方案的方法，包括：a)提供来自受试者的测试样品；b)检测测试样品中rit1蛋白的表达水平；和c)基于所述样品中的rit1蛋白的表达水平来确定治疗方案。在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。在另一优选例中，当所述样品中rit1蛋白的表达水平高于参比值，表明受试者发生肝细胞癌转移风险的几率高于一般人群(对照组人群)；或受试者所患肝细胞癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)；或受试者的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(对照组人群)，所述治疗方案包括rit1抑制剂疗法、rit1抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联用的疗法。在另一优选例中，所述rit1抑制剂疗法、rit1抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联用的疗法选自下组：rit1抑制剂疗法：抗体、小分子化合物、microrna、sirna、shrna、或其组合；酪氨酸激酶抑制剂疗法：小分子化合物，选自下组：索拉菲尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、或其组合。在另一优选例中，当受试者发生肝细胞癌转移风险的几率高于一般人群(对照组人群)；或受试者所患肝细胞癌的恶性程度的级别高于一般人群(对照组人群)；或受试者的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群(对照组人群)时，所述治疗方案还包括rit1抑制剂疗法、rit1抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联用的疗法；和其他治疗肝细胞癌药物的联用。在另一优选例中，所述其他治疗肝细胞癌的药物选自下组：5-氟尿嘧啶、阿霉素、奥沙利铂、或其组合。本发明第五方面提供了一种rit1基因或其蛋白抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)抑制肝细胞癌细胞的生长或增殖；和/或(b)抑制肝细胞癌细胞的转移；和/或(c)预防和/或治疗肝细胞癌；和/或(d)提高肝细胞癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。在另一优选例中，所述rit1基因或其蛋白抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microrna、sirna、shrna、或其组合。在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制rit1基因或其蛋白表达的抑制剂。在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于降低p-erk和/或p-akt的水平。在另一优选例中，所述抑制肝细胞癌细胞的转移包括肝细胞癌细胞的肝内转移和肺转移。在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。在另一优选例中，所述的组合物包括治疗有效量的rit1基因或其蛋白的抑制剂，和药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。在另一优选例中，所述的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。本发明第六方面提供了一种药物组合物，包括：(a1)rit1基因或其蛋白的抑制剂；(a2)任选的，酪氨酸激酶抑制剂；和(b)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物还包括：(c)其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物。在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：索拉菲尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、或其组合。在另一优选例中，所述组分(a1)与组分(a2)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a2)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(c)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)和任选的组分(a2)和任选的组分(c)占所述药物组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。本发明第七方面提供了一种药盒，包括：(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的rit1基因或其蛋白的抑制剂，或含有rit1基因或其蛋白的抑制剂的药物；(b1)任选的第二容器，以及位于所述第二容器中的酪氨酸激酶抑制剂，或含有酪氨酸激酶抑制剂的药物。在另一优选例中，所述药盒还包括：(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物，或含有其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物的药物。在另一优选例中，所述药盒还含有(d1)第四容器，以及位于所述第四容器的rit1的检测试剂。在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：索拉菲尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、或其组合。在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器、第三容器、第四容器是相同或不同的容器。在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含rit1基因或其蛋白的抑制剂的单方制剂。在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含酪氨酸激酶抑制剂的单方制剂。在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物的单方制剂。在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：(a)将rit1基因或其蛋白的抑制剂用于(i)抑制肝细胞癌细胞的生长；和/或(ii)抑制肝细胞癌细胞的转移；和/或(iii)预防和/或治疗肝细胞癌；和/或(iv)提高肝细胞癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的方法；(b)将rit1基因或其蛋白的抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌药物联用来(i)抑制肝细胞癌细胞的生长；和/或(ii)抑制肝细胞癌细胞的转移；和/或(iii)预防和/或治疗肝细胞癌；(c)检测肝细胞癌患者的rit1蛋白的表达水平，同时施用rit1基因或其蛋白的抑制剂来(i)抑制肝细胞癌细胞的生长；和/或(ii)抑制肝细胞癌细胞的转移的方法；和/或(iii)预防和/或治疗肝细胞癌；和/或(iv)提高肝细胞癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性的方法；(d)检测肝细胞癌患者的rit1蛋白的表达水平，同时联用riti1基因或其蛋白的抑制剂；和酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌药物来(i)抑制肝细胞癌细胞的生长；和/或(ii)抑制肝细胞癌细胞的转移的方法；和/或(iii)预防和/或治疗肝细胞癌的方法。本发明第八方面提供了一种本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的药盒的用途，用于(a)抑制肝细胞癌细胞的生长；和/或(b)抑制肝细胞癌细胞的转移；和/或(c)预防和/或治疗肝细胞癌。在另一优选例中，所述药物组合物中，rit1基因或其蛋白的抑制剂的作用浓度为100-2000ng/ml，较佳地，500-1500ng/ml，更佳地，800-1000ng/ml。在另一优选例中，所述药物组合物中，所述酪氨酸激酶抑制剂的作用浓度为1000-5000ng/ml，较佳地，2000-4000ng/ml，更佳地，3000-3500ng/ml。在另一优选例中，所述药物组合物中，所述其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物的作用浓度为500-4000ng/ml，较佳地，1500-3500ng/ml，更佳地2000-3000ng/ml。在另一优选例中，所述药物组合物或药盒包括(a)rit1基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的酪氨酸激酶抑制剂；和(c)任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物；和(d)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物或药盒中，所述rit1基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的酪氨酸激酶抑制剂；和(c)任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物占所述药物组合物或药盒总重的0.01-99.99wt％,较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。本发明第九方面提供了一种预防和/或治疗肝细胞癌的方法，包括：给需要的对象施用rit1基因或其蛋白的抑制剂；或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的药盒。在另一优选例中，所述对象包括患有肝细胞癌的人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。在另一优选例中，所述riti基因或其蛋白的抑制剂的施用剂量为0.5-5mg/kg体重，较佳地为1-4mg/kg体重，最佳地为2-3mg/kg体重。在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂的施用剂量为10-60mg/kg体重，较佳地为20-50mg/kg体重，最佳地为30-40mg/kg体重。在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物的施用剂量为5-70mg/kg体重，较佳地为10-50mg/kg体重，最佳地为20-40mg/kg体重。在另一优选例中，所述rit1基因或其蛋白的抑制剂的施用频率为1-4次/周，较佳地为2-3次/周。在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂的施用频率为1-5次/周，较佳地为2-3次/周。在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物的施用频率为1-6次/天，较佳地为3-4次/周。在另一优选例中，所述rit1基因或其蛋白的抑制剂的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。在另一优选例中，所述rit1基因或其蛋白的抑制剂与任选的酪氨酸激酶抑制剂、和任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌癌的药物同时或先后施用。本发明第十方面提供了一种体外非治疗性的抑制肝细胞癌细胞的生长或增殖的方法，包括步骤：在rit1基因或其蛋白抑制剂的存在下，培养肝细胞癌细胞，从而抑制肝细胞癌细胞的生长或增殖。在另一优选例中，所述rit1基因或其蛋白抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microrna、sirna、shrna、或其组合。在另一优选例中，所述肝细胞癌细胞高表达rit1蛋白。在另一优选例中，所述方法还包括向肝细胞癌细胞的培养体系中添加酪氨酸激酶抑制剂；和/或其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物，从而抑制肝细胞癌细胞的生长或增殖。在另一优选例中，所述肝细胞癌细胞为体外培养的细胞。本发明第十一方面提供了一种筛选预防和/或治疗肝细胞癌的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中rit1的表达量(e1)和/或活性(a1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中rit1的表达量(e0)和/或活性(a0)；其中，如果测试组中细胞的rit1的表达量(e1)和/或活性(a1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对rit1的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗肝细胞癌的候选化合物。在另一优选例中，所述的rit1的表达量是通过荧光定量pcr或免疫组织化学检测而得出的。在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对肝细胞癌细胞生长或增殖的抑制作用；和/或进一步测试其对rit1基因是否有下调的作用。在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤：测试组中，肝细胞癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察肝细胞癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在肝细胞癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肝细胞癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中肝细胞癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对肝细胞癌细胞的生长或增殖有抑制作用的预防和/或治疗肝细胞癌的候选化合物。在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。在另一优选例中，所述哺乳动物为患有肝细胞癌的哺乳动物。在另一优选例中，所述“显著低于”指e1/e0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。在另一优选例中，所述“显著低于”指a1/a0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。在另一优选例中，所述细胞包括肝细胞癌细胞。在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了肝细胞癌组织中rit1的表达及临床意义，其中，atcga数据库中50对肝细胞癌组织和癌旁肝组织中rit1的表达。b本实验室90对肝细胞癌组织和癌旁肝组织中rit1的表达。ctcga数据库分析不同病理分级的肝细胞癌组织中rit1的表达。d利用kaplan-meier法分析rit1的表达与肝细胞癌患者总体生存期的关系。e肝细胞癌组织中rit1的免疫组化染色代表性图(左：40×；右：400×)。**指p<0.001。***指p<0.0001。图2显示了肝细胞癌细胞系中rit1和组织中的突变，其中，awesternblot检测rit1在肝细胞癌组织和配对癌旁肝组织中的表达。bwesternblot检测rit1在肝细胞癌细胞系中的表达。crit1在肝细胞癌组织和白细胞中的突变情况。dqpcr检测rit1在肝细胞癌细胞系中的表达。图3显示了肝细胞癌细胞系中rit1过表达及干扰效率检测。其中，aqpcr和westernblot检测过表达rit1细胞系中rti1的表达。bqpcr和westernblot检测干扰rit1细胞系中rti1的表达。图4显示了rit1促进肝细胞癌细胞的生长。其中，acck8法明确过表达rit1对肝细胞癌细胞生长的作用。b克隆形成实验检测rit1对肝细胞癌细胞生长的作用。ccck8法检测干扰rit1对肝细胞癌细胞生长的影响。d克隆形成实验检测干扰rit1对肝细胞癌生长的影响。*指p<0.05；**指p<0.001。***指p<0.0001。图5显示了rit1促进软琼脂糖克隆形成。其中，a过表达rit1e11、rit1q11和rit1isoform2对nih3t3和li-7细胞软琼脂糖克隆形成能力的影响。b敲减rit1对mhcc-97l和hcc-ly10细胞软琼脂糖克隆形成能力的影响。c裸鼠肝原位接种smmc-7721-pwpxl、smmc-7721-rit1q11、li-7-pwpxl和li-7-rit1q11细胞成瘤(左)及荷瘤肝重的统计结果图(右)。dwesternblot检测成瘤组织中rit1的表达。***指p<0.0001。图6显示了rit1促进肝细胞癌细胞体外迁移和侵袭。其中，a稳定过表达rit1促进肝细胞癌细胞smmc-7721、li-7和huh7的迁移和侵袭能力代表图及统计结果图。b稳定干扰rit1抑制肝细胞癌细胞系hcc-ly10和mhcc-97l的迁移和侵袭能力代表图及统计分析结果。c裸鼠肝原位接种smmc-7721-pwpxl、smmc-7721-rit1q11细胞的肝原位瘤及肺转移代表图。dwesternblot检测过表达rit1e11、rit1q11和rit1isoform2以及干扰rit1后akt、p-akt、erk和p-erk的水平。*指p<0.05；**指p<0.001。***指p<0.0001。图7显示了索拉菲尼处理上调mhcc-97l和hcc-ly10细胞中rit1的表达。其中，aqpcr检测索拉菲尼处理的mhcc-97l和hcc-ly10中rit1的表达。bwesternblot检测索拉菲尼处理的mhcc-97l和hcc-ly10中rit1的表达。图8显示了干扰rit1增加mhcc-97l和hcc-ly10对索拉菲尼的敏感性。其中，a在mhcc-97l和hcc-ly10稳定干扰rit1后检测索拉非尼的ic50。bcck8检测联合索拉菲尼处理和稳定干扰rit1对mhcc-97l和hcc-ly10增殖的影响。crit1干扰和相应对照细胞皮下接种裸鼠，当肿瘤长至50mm3左右的时候，每周5天腹腔注射索拉菲尼(20mg/kg/d)和相应溶剂，20天后牺牲小鼠取瘤称重并分析。d代表性图。e索拉菲尼和溶剂处理期间每周2次量瘤径计算肿瘤体积并分析作图。*指p<0.05。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在肝细胞癌细胞或组织中的rit1的基因或其蛋白的表达显著高于正常组织中的rit1的基因或其蛋白的表达，并且，申请人还发现，rit1的表达会随着肝细胞癌组织病理分级进展而增高，并且kaplan–meier生存期分析提示rit1高表达的肝细胞癌患者生存期明显短于rit1低表达的肝细胞癌患者，因此，rit1基因或其蛋白可用作(i)检测肝细胞癌的组织分级；和/或(ii)检测肝细胞癌发生肝内转移风险；和/或(iii)用作判断肝细胞癌患者预后和生存期的标志物。并且，申请人还意外的发现，rit1基因或其蛋白的抑制剂可有效(a)抑制肝细胞癌细胞的生长或增殖；和/或(b)抑制肝细胞癌细胞的转移；和/或(c)预防和/或治疗肝细胞癌；和/或(d)提高肝细胞癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性，并且，rit1基因或其蛋白的抑制剂可与酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物联用，并且对肝细胞癌的治疗有显著的协同效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。肝细胞癌肝细胞癌在所有肿瘤中发病率排名第六，肝细胞癌每年新发病例将近80万。目前肝细胞癌的治疗手段有很多种，包括手术切除、肝脏移植、肿瘤消融、经动脉肿瘤栓塞术、系统性治疗等，但中晚期肝细胞癌患者从治疗中获得的受益较低，生存期较短，预后差。目前尚无很好的肝细胞癌的治疗方法。在本发明中，肝细胞癌组织分级指tnm分期，包括ⅰ期，ⅱ期，ⅲ期，ⅳ期。肝内转移在本发明中，所述肝内转移指(1)门静脉瘤栓；(2)在原发肿瘤所在肝叶以外的其他肝叶上的肿瘤；(3)同一肝叶中在原发肿瘤周围的肿瘤，其有多个卫星结节并且其周围有肝组织；或者周围的微小孤立肿瘤，其组织学上与原发肿瘤相似或分化程度更低。肺转移在本发明中，所述肺转移指原发性干细胞癌经血液或淋巴液转移到肺脏组织。样品本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本
技术领域：
：的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。表达如本文所用，术语“表达”包括mrna从基因或基因部分的产生，并且包括由rna或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cdna，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。参比值如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较rit1白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。在本发明中，所述参比值指截断值(cut-off值)，指肝细胞癌细胞或组织中的rit1的相对表达水平，优选相对表达水平为0.043(荧光定量pcr)或3.5(免疫组化)。非肝细胞癌的样品如本文所用，术语“非肝细胞癌样品”包括但不限于未患有肝细胞癌的人群，肝细胞癌患者的非肝细胞癌组织。rit1蛋白和多核苷酸在本发明中，术语“本发明蛋白”、“rit1蛋白”、“rit1多肽”可互换使用，都指具有rit1氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的rit1蛋白。此外，该术语还包括全长的rit1及其片段。本发明所指的rit1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。rit1(raslikewithoutcaax1)定位于染色体1q22，基因包括6个外显子，4个内含子，mrna包括三个亚型即isoform1、isoform2和isoform3。isoform2编码的蛋白由236个氨基酸组成，其空间结构和小g蛋白类似，包括switchi结构域和switchii结构域，当其处于gtp结合状态时，其能通过调整蛋白的构象使其处于激活状态，与下游的效应分子结合，发挥信号转导的功能；而当gtp水解向gdp转化时，信号转导停止。rit1本身就有gpt酶活性，能将gtp水解成gdp，当rit1编码的蛋白释放gdp后，又可以结合新的gtp而再次激活。gtp酶激活蛋白(gaps)能使大多数gtp酶失活，而鸟苷酸活化因子(gefs)能通过加速gdp向gtp的转变，能够促进gtp酶的再激活。人的rit1蛋白全长为236个氨基酸(登录号为np_001243750.1)。鼠的rit1蛋白全长为219个氨基酸(登录号为np_033095.1)。在本发明中，术语“rit1基因”、“rit1多核苷酸”可互换使用，都指具有rit1核苷酸序列的核酸序列。人rit1基因的基因组全长13541bp(ncbigenbank登录号为nm_001256821.2)，其转录产物mrna序列全长3324bp(ncbigenbank登录号为nm_001256821.2)。鼠rit1基因的基因组全长14207bp(ncbigenbank登录号nm_009069.4)，其转录产物mrna序列全长2509bp(ncbigenbank登录号为nm_009069.4)。人和鼠rit1，在dna水平的相似性为85.89％％，蛋白序列相似性为94.98％％。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。在得到了rit1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的rit1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的rit1多肽。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码人rit1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，rit1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含rit1编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。特异性抗体在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗rit1的特异性抗体”可互换使用。本发明还包括对人rit1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人rit1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人rit1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人rit1蛋白的分子，也包括那些并不影响人rit1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人rit1基因产物结合的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab’或(fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子(ladner等人，美国专利no.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人rit1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人rit1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见kohler等人,nature256；495,1975；kohler等人,eur.j.immunol.6：511,1976；kohler等人,eur.j.immunol.6：292,1976；hammerling等人,inmonoclonalantibodiesandtcellhybridomas,elsevier,n.y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人rit1蛋白功能的抗体以及不影响人rit1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人rit1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人rit1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如e.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗人rit1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人rit1蛋白。由于rit1蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的rit1胞外区就可成为血清检测的靶对象。检测方法利用rit1存在于肝细胞癌细胞或组织中，且与肝细胞癌的危险度密切相关这一特点，本发明还提供了检测肝细胞癌的方法。在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测rit1的高通量二代测序法以及sanger测序、荧光定量pcr(qpcr)、原位免疫荧光法(fish)和免疫组化等。检测试剂盒基于rit1与肝细胞癌的相关性，即rit1存在于肝细胞癌组织中，因此rit1可以作为肝细胞癌的一种诊断标志物。本发明还提供了一种(i)检测肝细胞癌的组织分级；和/或(ii)检测肝细胞癌发生肝内转移风险；和/或(iii)判断肝细胞癌患者预后和生存期的试剂盒，它含有检测rit1基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测(i)检测肝细胞癌的组织分级；和/或(ii)检测肝细胞癌发生肝内转移风险；和/或(iii)判断肝细胞癌患者预后和生存期。其中，所述的标签或说明书注明以下内容：(a)当检测对象的肝细胞癌细胞或组织中rit1表达量e1与一般肝细胞或组织的rit1表达量e2之比≥2，则提示该检测对象肝细胞癌发生肝内转移风险的几率高于一般人群；(b)当检测对象的肝细胞癌细胞或组织中rit1表达量e1与一般肝细胞或组织的rit1表达量e2之比≥2，则提示该检测对象的预后不良和生存期缩短的几率高于一般人群；其中，所述的e2是一般人群的一般肝细胞或组织的rit1的表达量。检测方法和试剂盒本发明涉及定量和定位检测人rit1蛋白水平或mrna水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人rit1蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)肝细胞癌的组织分级；和/或肝细胞癌发生转移风险；和/或肝细胞癌患者预后和生存期。一种检测样品中是否存在rit1蛋白的方法是利用rit1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与rit1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在rit1蛋白。rit1蛋白或其多核苷酸可用于rit1蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或dna芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗rit1的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的rit1蛋白。本发明的主要优点包括：(1)本发明首次发现，在肝细胞癌细胞或组织中的rit1的基因或其蛋白的表达显著高于正常组织中的rit1的基因或其蛋白的表达，rit1的表达会随着肝细胞癌组织病理分级进展而增高，并且kaplan–meier生存期分析提示rit1高表达的肝细胞癌患者生存期明显短于rit1低表达的肝细胞癌患者,因此，rit1可作为(i)检测肝细胞癌的组织分级；和/或(ii)检测肝细胞癌发生肝内转移风险；和/或(iii)用作判断肝细胞癌患者预后和生存期的标志物。(2)本发明首次发现。rit1基因或其蛋白的抑制剂可有效(a)抑制肝细胞癌细胞的生长或增殖；和/或(b)抑制肝细胞癌细胞的转移；和/或(c)预防和/或治疗肝细胞癌；和/或(d)提高肝细胞癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性.(3)本发明首次发现，rit1基因或其蛋白的抑制剂可与酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗肝细胞癌的药物联用，并且对肝细胞癌的治疗有显著的协同效果。(4)本发明首次发现，rit1在肝细胞癌患者组织样品中高表达提示患者处于中晚期且预后差。(5)本发明首次发现，rit1促进肝细胞癌细胞的体内和体外生长。(6)本发明首次发现，rit1促进肝细胞癌细胞的转移潜能。(7)本发明首次发现，酪氨酸激酶抑制剂(如索拉菲尼)处理肝细胞癌细胞(肝细胞癌细胞肝细胞癌细胞能够上调rit1的表达(8)本发明首次发现，干扰rit1能提高肝细胞癌细胞对索拉菲尼的敏感性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。通用方法1.细胞培养研究所用的人肝细胞癌细胞系以及正常肝细胞系均放在恒温37℃、5％co2和湿度饱和的培养箱中，细胞培养液里包含10％的胎牛血清、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素。nunc聚苯乙烯材质平皿和多孔培养板是从thermoscientific公司购买。2.rna抽提1)当直径为6cm的细胞培养皿里的细胞密度为90％时，弃去上层培养基，加入1mltrizol反复吹打，然后吸取1ml至1.5ml离心管，静置5min。2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，在室温下静置2～3min。置于4℃、12000g条件下的离心机中离心15min。液体分三层：下层是蛋白质有机相，中层是dna固相，上层是rna水相。3)吸取上清液并移入新的1.5ml离心管，加入0.5ml异丙醇，轻吹混匀，室温静置10min，于4℃、12000g条件下的离心机中离心10min，rna沉淀至ep管底。4)吸弃上清，加入0.5ml75％乙醇，轻轻吹打rna沉淀。于4℃、7500g条件下的离心机中离心5min，rna沉积至ep管底。5)吸弃上清，于室温条件下干燥rna沉淀。加入20μl～50μldiethypyrocarbonate(depc)水，轻吹溶解(置于-80℃保存)。然后用nanodrop2000测rna浓度。3.逆转录逆转录试剂盒primescripttmrtreagentkit(perfectrealtime)20μl体系如下：反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，……4.荧光定量pcr逆转录的cdna用ddh2o按1:50稀释，荧光定量pcr实验20μl体系如下所示：每个样品于96孔板中设置3孔进行平行实验，在abi7500荧光定量pcr仪上进行pcr反应。pcr反应条件先是95℃，30s，然后95℃5s，60℃30s循环40次。以gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)作为参照。5.蛋白质抽提1)当细胞长到90％密度时，弃去培养皿中的培养基，用预冷的1×pbs清洗两遍，吸弃残留液体后，加入适量蛋白裂解液(1ml蛋白裂解液包括880μlt-per组织蛋白抽提试剂、20μl蛋白酶抑制剂和100μl磷酸酶抑制剂)，用刮刀刮取细胞。2)吸取适量细胞裂解液于1.5ml的离心管，冰浴裂解40min。3)4℃、12000g高速离心15min，小心吸取上清至新的1.5ml离心管。4)蛋白定量：吸取5μl样品或5μlpbs(空白对照)、200μlbca和20μl1×pbs混合液(bca：cuso4＝200：4)，37℃恒温金属浴30min。使用多功能酶标仪测量570nm波长处吸光光度值，根据标准浓度曲线计算蛋白浓度。5)剩余上清按比例加入5×loadingbuffer和10×dtt，轻轻吹匀，100℃沸水浴10min，立刻冰浴冷却10min，-20℃储存备用(长期保存需置于-80℃)。6.构建pwpxl-rit1过表达质粒1)pcr：根据上文所述的rit1e11/rit1q11/rit1isoform2基因的克隆引物(引入mlui/ndei酶切位点)，通过pcr扩增出rit1e11/rit1q11/rit1isoform的cds区。2)琼脂糖凝胶电泳：配制1％的琼脂糖凝胶和0.5×tbe电泳缓冲液；用微波炉加热使琼脂糖熔化，冷却至室温加入溴化乙啶，轻轻摇匀灌胶；拔出梳子，将凝胶放入tbe缓冲液中，上样后在140～160v电压下进行电泳；在紫外灯下，将目的位置的pcr产物的凝胶条带割下来，捣碎并置于1.5ml离心管中。3)纯化回收、酶切和连接：根据天根生化科技有限公司的dna纯化回收试剂盒说明书，进行纯化pcr扩增产物试验；按照酶切体系，用mlui/ndei对pwpxl和上述dna纯化回收产物进行双酶切，酶切12h完成后按照相同方法使用dna纯化回收试剂盒，进行酶切产物纯化回收；酶切的pwpxl和目的dna22℃金属浴连接3h，放置室温冷却。4)转化：10μl连接产物和50μldh5α感受态细菌混匀，冰浴30min，将管放入42℃的水浴锅中，90s勿摇动后(注意严格控制时间)，快速放到冰上冷却2～3分钟，然后将适量soc培养基加入到热激后的混合液，37℃摇床摇40min，将得到的混合液均匀涂抹于含氨苄青霉素(amp)抗性的lb平板上，倒置平板，于37℃培养箱培养过夜(12～16h)。5)挑单克隆：挑选lb平板中长出的单个克隆于5ml含有氨苄青霉素的lb液中，37℃250rpm振荡12～16h。6)质粒抽提：按照天根生化科技有限公司的质粒小抽试剂盒的说明书抽提质粒，将提取的质粒用nanodrop测定浓度。最后再用mlui/ndei进行双酶切3h，用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定，酶切鉴定正确的质粒送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序正确后保留相应菌种备用。7.蛋白电泳及蛋白质印迹试验1)配胶：按上述配方配制12％分离胶，混匀后将胶迅速加入到玻璃板中，高度为距薄玻璃板上缘1.5cm左右。立即加入适量的蒸馏水，在室温下静置30min；等待分离胶凝固后，用干净的滤纸吸干残余蒸馏水，再按照上文所述配制5％浓缩胶，混匀后迅速加到玻璃板中，随即插入10齿或者15齿的梳子，注意防止气泡产生，20～30min后待上层胶凝固完毕，备用。2)上样：取抽提的蛋白样品，使用移液器和加样枪头向加样孔加入蛋白marker及蛋白样品(上样量一般为30μg，用1×loadingbuffer补齐至每孔等体积)。3)电泳：恒压80v0.5h和恒压120v1h(根据目的分子量相应调整)，蓝线移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电源。4)转膜：转膜缓冲液按上文所述配方提前配制并置于4℃存储；组装转膜装置后，将转移槽倒满转移液，并放入冰块，将转移槽置于加满冰的的泡沫盒中，，接通电源，恒流220ma，65min进行转膜。(组装转膜夹子时，滤纸、凝胶和膜各接触面之间一定不能有气泡；pvdf膜使用前应用甲醇浸泡1min)5)抗体杂交：将转好的膜放在5％脱脂牛奶中进行封闭，室温孵育1h；弃去脱脂牛奶，用封闭液将一抗稀释至一定比例置于4℃中孵育过夜(12h)；使用pbst(pbsph7.4，0.1％tween20)洗膜共3次，每次10min；用5％脱脂牛奶稀释辣根过氧化物酶标记的二抗至一定浓度(注意区分种属)，室温孵育0.5～1h；使用pbst(pbsph7.4，0.1％tween20)洗膜共3次，每次10min。6)化学发光检测：将supersignal化学发光底物滴在膜上，使用化学发光荧光成像仪显色并对条带进行分析。所有的蛋白印迹实验均把β-actin作为参照。8.构建gv248-shrit1质粒含有shrit1片段的质粒由上海吉凯基因公司合成。其靶向的片段序列见表5：表5干扰rit1序列table5sequencesusedtosilencerit19.病毒包装1)将hek293t接种到10cm细胞培养皿中，培养过夜，待细胞长至80％左右的融合度时进行转染；2)配制jetprime脂质体和质粒转染液：将质粒和jetprime的混合液分别加入到0.5ml无血清培养基中，混匀放置室温10min后，将转染混合液缓慢加入10cm的293t细胞培养皿中，并添加细胞培养液至终体积为10ml，37℃恒温培养箱培养48h。3)之后用荧光显微镜观察细胞的绿色荧光强度和面积，拍照并判断转染效率，收集培养液上清，用微孔滤器过滤(0.45μm)，分装并置于-80℃储存备用。10.慢病毒感染第1天将人肝细胞癌细胞接种到4个6cm细胞培养板中，待细胞贴壁并长至约40％～50％融合度，细胞培养基和病毒液按1：3混合后加到培养皿中，同时加入1‰polybrene(sigma-aldrich)，终体积为5ml，培养6～8h后换液，加入新鲜细胞培养基并置于37℃恒温箱培养，48h后在荧光显微镜下，我们可观察到对照组中和实验组细胞的绿色荧光强度和百分比，初步判断感染效率。11.克隆形成实验1)用胰酶消化肝细胞癌细胞后计数，然后在6孔细胞培养板中，每孔接种约1000～3000细胞，每个样品要三孔平行重复，每孔补加培养液至2ml，并十字晃动使细胞分散均匀。2)6孔板放置于37℃恒温培养箱培养，当单个克隆长至最大50个细胞左右且肉眼可见时，终止培养，弃去培液。3)用1×pbs洗涤2次，用10％中性福尔马林固定30min，giemsa染色30min，自来水冲洗，空气干燥。扫描仪扫描并生成图像，统计克隆数目并做统计分析。12.细胞迁移与侵袭实验1)包被基底膜将无血清培养基进行预冷处理，然后按matrigel：无血清培养基(v/v)＝1：9比例稀释，将稀释的matrigel包被transwell小室底部微孔薄膜的上室面，室温风干(迁移实验无需进行此步骤)。2)肝细胞癌细胞计数与重悬常规消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，用无血清培养基清洗3遍，用无血清培养基重悬细胞并计数，取含有1×105个细胞的细胞悬液加入transwell小室的上室，用无血清培养基补至200μl，24孔板下室一般加入600μl含有胎牛血清的培养基，置于37℃培养箱中培养24～48h。3)固定和统计根据不同细胞的特性，一定时间后取出transwell小室，弃去小室的上室的培液，用1×pbs清洗两遍，并用10％中性福尔马林溶液固定30min，用结晶紫染色15min。用棉签轻轻擦除transwell小室内室的上层细胞，晾干后用刀片将小室底部微孔薄膜取下固定于载玻片上。室温干燥后置于显微镜下观察。随机选取6个视野拍照并计数以进行统计分析。13.细胞增殖实验(cck8assay)1)用胰酶消化细胞皿中的肝细胞癌细胞后计数，以每孔约800～3000细胞接种于96孔细胞培养板，用振荡器摇匀，每个样品要三孔平行重复。2)将接种好的96孔细胞放在37℃培养箱中培养24h后，换液加入新鲜细胞培养基(换液时注意动作要轻柔，避免操作不当造成细胞损失)，每孔加入10μlcck8溶液，37℃恒温培养箱孵育2h，然后用酶标仪测定吸光度a450nm的值。3)用cck8检测要持续7天，记录数值并做分析。14.肝细胞癌组织微阵列本研究所用236例肝细胞癌组织及相应癌旁肝组织标本均来自启东肝癌防治研究所。以4％中性缓冲福尔马林溶液固定及石蜡包埋72h后制成供体蜡块，随后在供体蜡块中选择位点取样，嵌入已完成打孔的微阵列蜡块。微阵列蜡块上每个组织芯直径约为1.5mm，排列齐整，且基本无移位脱点。综合考虑免疫组织化学染色强度(3：棕褐色；2：棕黄色；1：淡黄色；0：无颜色)以及阳性细胞的百分数(4：>75％；3：50～75％；2：25～50％；1：10～25％；0：<10％)计算免疫组化得分为0，1，2，3和4。所有样本和患者数据收集的过程均在患者知情同意下进行，且经过启东人民医院启东肝癌防治研究所伦理审查委员会的批准。15.裸鼠肝原位接种实验用胰酶消化生长状态良好的10cm培养皿中的smmc-7721-pwpxl和smmc-7721-rit1q11细胞，计数后，用20μl无血清dmem将1×106个细胞重悬，并与matrigel1:1配成40μl混合液，混匀置于冰上(不要有气泡)；将20只6-8周龄的裸鼠随机分为实验组和对照组，每组各10只，将细胞接种于裸鼠左肝叶。接种后在spf级动物房中饲养小鼠，约42天后无痛苦牺牲小鼠，采集小鼠的肝、肺组织，进行病理组织学实验，分别统计实验组和对照组裸鼠肝重、肝内肿瘤转移和肺转移情况。li-7-pwpxl和li-7-rit1q11的裸鼠肝原位实验操作同上。本研究中所用的balb/c裸鼠均由本研究所实验动物平台提供，所有动物实验均在spf(specificpathogenfree)级动物实验室中进行。所有动物实验均经过上海市肿瘤研究所动物伦理委员会审查与批准。16.索拉菲尼处理肝细胞癌细胞当细胞融合度达到60％时，向每皿肝细胞癌细胞中加入适量索拉菲尼，使其最终浓度分别为0、3、6、9μm分别处理24h、48h后，分别收取蛋白质和rna进行检测；17.肝细胞癌细胞中索拉菲尼的ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)向96孔板中接种稳定干扰rit1的hcc-ly10和mhcc-97l细胞，每孔3000个细胞，接种48h后向其中加入适量的索拉菲尼，使其最高浓度为40μm，进行倍比稀释，48h然后测cck8，绘制ic50曲线，注意每个浓度需要3孔平行重复。实施例1rit1在肝细胞癌患者组织样品中高表达提示患者处于中晚期且预后差利用tcga数据库分析50对肝细胞癌癌组织及其配对癌旁肝组织中rit1mrna水平的表达差异，结果发现，rit1mrna在肝细胞癌组织中的表达明显高于配对癌旁肝组织(图1a)。本发明收集的90对肝细胞癌组织及其配对癌旁肝组织的qpcr检测结果与tcga数据库一致，rit1在肝细胞癌组织中的mrna表达水平明显增高(图1b)。进一步分析tcga数据库发现，rit1的表达会随着肝细胞癌组织病理分级进展而增高(图1c)。kaplan–meier生存期分析提示rit1高表达的肝细胞癌患者生存期明显短于rit1低表达的肝细胞癌患者(图1d)为进一步分析rit1的表达在肝细胞癌中的临床意义，我们用免疫组织化学的方法检测了236例肝细胞癌组织中rit1的表达，根据免疫组织化学染色强度和阳性细胞百分比将rit1的表达评分为0，1，2，3和4，其中把评分0，1和2作为rit1低表达组(103例，43.64％)，评分3和4作为rit1高表达组(133例，56.36％)(图1e)。分析rit1在肝细胞癌组织中的表达与患者临床病理特征的相关性，纳入统计分析的临床病理指标包括年龄、性别、血清甲胎蛋白(afp)、乙肝病毒(hbv)感染状况、肿瘤大小、组织学分级、是否伴发肝内转移以及是否伴发肝硬化，结果表明rit1的表达水平与患者的组织分级、是否伴发肝内转移呈显著正相关(表1)。综上所述，rit1在肝细胞癌组织中的表达显著增高，并与肝细胞癌患者的组织分级、是否发生肝内转移呈正相关，rit1高表达提示肝细胞癌患者预后不良且生存期较短。表1rit1表达量与肝细胞癌临床病理特征的关系p值表示来自可变亚组之间的rit1表达水平的χ2检验的概率。afp，甲胎蛋白。*表示p<0.05。实施例2rit1促进肝细胞癌细胞的体内和体外生长rit1有3个剪切变异体：isoform1、isoform2和isoform3，其中isoform2比ras在n端多18个氨基酸，isoform1比isoform2在n端多一个包含17个氨基酸的外显子，isoform3起始在g1结构域下游的翻译起始位点，因此其缺乏关键的核苷酸结合位点。已有的研究主要基于在isoform2这一变异体，而根据我们的westernblot结果，在肝细胞癌细胞系和组织中rit1isoform1和isoform2均有表达(图2，a和b)。利用tcga数据库分析rit1在肝细胞癌组织中的突变情况(http://www.cbioportal.org)，未发现isoform2存在突变，亦未见之前报道的e81q突变。tcga数据库只提供了rit1isoform2的数据，因此我们利用本实验室收集的21例肝细胞癌组织检测了isoform1的突变情况，序列以4名健康人的白细胞的rit1isoform1序列为标准，结果发现，相对于健康人白细胞rit1isoform1序列，有5例肝细胞癌组织存在q11e的突变(图2c)。应用qpcr和westernblot检测rit1在肝细胞癌细胞系中的表达水平，结果表明rit1在肝细胞癌细胞系mhcc-97h、mhcc-lm3、mhcc-97l中表达较高，在肝细胞癌细胞系hcc-ly10和hepg2中中度表达，在肝细胞癌细胞系li-7、mhcc-7721、huh7中表达较低(图2，b和d)。为研究rit1在肝细胞癌细胞中的功能，在rit1低表达的肝细胞癌细胞系smmc-7721、li-7和huh7过表达rit1e11，rit1q11和rit1isoform2，建立稳定过表达细胞系；在rit1高表达的肝细胞癌细胞系mhcc-97l和中度表达的肝细胞癌细胞hcc-ly10干扰rit1的表达，建立rit1稳定干扰细胞系。使用qpcr和westernblot检测rit1的过表达和干扰效率(图3，a和b)。克隆形成实验及cck8实验，结果显示，过表达rit1e11、rit1q11和rit1isoform2均能显著促进肝细胞癌细胞系体外的增殖，且三者之间并无显著差别(图4，a和b)。干扰内源性rit1表达能显著抑制肝细胞癌细胞的体外生长(图4，c和d)。之前有文献报道，rit1能够转化nih3t3细胞，我们将过表达rit1e11、rit1q11和rit1isoform2的nih3t3和li-7细胞进行软琼脂糖克隆形成实验，发现rit1e11、rit1q11和rit1isoform2都可以促进nih3t3和li-7细胞软琼脂克隆的形成；而在mhcc-97l和hcc-ly10中敲减rit1，软琼脂克隆形成能力受到抑制(图5，a-b)。为进一步明确rit1在肝细胞癌细胞裸鼠体内成瘤中的功能，我们肝原位接种过表达rit1q11的肝细胞癌细胞系及相应对照，约6周后无痛牺牲小鼠，取荷瘤肝组织并称重，结果表明与相应对照组相比，过表达rit1q11能够明显促进smmc-7721和li-7细胞的增殖(图5，c-d)。实施例3rit1促进肝细胞癌细胞的转移潜能如前所述，rit1的表达水平与患者是否发生肝内转移密切相关，亦有报道表明，过表达rit1可以促进细胞迁移和侵袭。体内外实验检测rit1对肝细胞癌转移潜能的影响。结果表明过表达rit1e11、rit1q11和rit1isoform2均能显著促进肝细胞癌细胞系smmc-7721、li-7和huh7的迁移和侵袭能力(图6a)。干扰rit1表达能显著抑制肝细胞癌细胞系hcc-ly10和mhcc-97l的迁移和侵袭能力(图6b)。肝原位接种过表达rit1q11的肝细胞癌细胞系及相应对照，约6周后无痛牺牲小鼠并采集肝、肺组织，进行连续切片及he染色，观察实验组和对照组裸鼠肺转移的情况(图6c)。结果显示，在smmc-7721细胞中，对照组中有1只裸鼠(10％)出现了肺转移，而在过表达rit1isoform1(rit1q11)组中有6只裸鼠(60％)出现了肺转移。综上所述，rit1能够显著促进肝细胞癌细胞体外迁移侵袭及裸鼠体内的肺转移。和其他ras家族成员类似，rit1将细胞信号转导到特定的效应分子，激活不同的信号通路，包括mapk和pi3k/akt通路，westernblot检测过表达rit1和干扰rit1细胞系p-erk和p-akt的表达(图6d)，结果表明，rit1能够提高p-erk和p-akt的水平。实施例4索拉菲尼处理肝细胞癌细胞能够上调rit1的表达索拉菲尼是一种多种激酶抑制剂，是肝细胞癌治疗的一线药，它能延长患者的生存期。利用不同浓度0、3、6、9μm的索拉菲尼处理mhcc-97l和hcc-ly10细胞24h和48h后，qpcr和westernblot检测rit1的表达，结果表明索拉菲尼处理后，rit1mrna和蛋白水平均明显增高，并且具有时间和浓度依赖性(图7，a和b)。rit1与其他ras家族成员类似，可以将膜信号转导到特定的效应分子，激活不同的信号通路，包括mapk信号通路和pi3k/akt信号通路。如前所述，rit1能够上调p-erk和p-akt的水平。rit1是否通过调控mapk信号通路和pi3k/akt信号通路影响索拉非尼药物敏感性，仍需进一步研究。综上所述，肝细胞癌细胞经过索拉菲尼处理后，rit1mrna和蛋白水平均明显升高。实施例5干扰rit1能提高肝细胞癌细胞对索拉菲尼的敏感性为了确定rit1是否与肝细胞癌细胞索拉菲尼耐药相关，在mhcc-97l和hcc-ly10细胞中检测了索拉菲尼的ic50(图8a)。从结果可以看出，mhcc-97l和hcc-ly10的ic50均超过10μm，说明两种细胞本身对索拉菲尼都不敏感。但当敲减rit1之后，ic50均明显降低。cck8实验表明索拉菲尼(3μm)联合干扰rit1组与单独索拉菲尼(3μm)或单独干扰rit1组相比，更显著地抑制了mhcc-97l和hcc-ly10细胞的增殖能力(图8b)。rit1干扰和相应对照肝细胞癌细胞皮下接种裸鼠，当肿瘤长至50mm3左右的时候，每周5天腹腔注射索拉菲尼(20mg/kg/d)和相应溶剂，每周2次量瘤径计算瘤体积，20天后牺牲小鼠取瘤称重并分析。结果表明，干扰rit1能够明显提高索拉菲尼抑制肿瘤生长的效果(图8，c-e)。综上所述，干扰rit1的表达可以提高肝细胞癌细胞对索拉菲尼的敏感性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海市肿瘤研究所<120>rit1在肝细胞癌的诊断和治疗中的应用<130>p2019-0812<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttctccgaacgtgtcacgt19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcgaagtttccatgaagtt19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agatcatgatcccaccatt19当前第1页12当前第1页12