一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法与流程

本发明涉及植物保护技术领域，具体地，涉及一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法。

背景技术：

植物炭疽病(anthracnose disease)是由刺盘孢属真菌(Colletotrichum spp.)引起的植物病害的总称。目前已报道的刺盘孢属真菌有190余种，有些复合种(如胶孢刺盘孢复合种C.gloeosporioides complex)的种内分类还不是十分清楚，为病害鉴定带来一定困难。相关研究表明，刺盘孢属真菌存在复合侵染的情况，即不同种的刺盘孢属真菌可以侵染同一个植株或同一个部位，因此，分离获得大量高纯度的刺盘孢菌显得尤其重要。

传统的植物病原真菌分离纯化方法包括组织分离法、孢子稀释分离法及显微镜下直接挑单孢法，均存在一定缺陷：(1)前人多采用植物病斑组织分离法分离植物炭疽菌，是先切下病健交界处的植物组织，表面消毒后，放置于PDA培养基上培养。待长出菌丝后，挑取菌丝尖端，置于新的PDA培养基表面培养，从而得到病原真菌。但该方法分离出的炭疽菌存在不纯的情况，即获得的菌株可能由多种刺盘孢属真菌菌丝混合而成；另外，由于有些刺盘孢属真菌菌落形态类似，组织分离法还可能存在病原菌遗漏的情况，即仅分离获得一种刺盘孢属真菌，而不能反映真实侵染情况。(2)孢子稀释分离法是将发病植物组织处的分生孢子用灭菌水清洗下来，配置分生孢子悬浮液。用无菌水梯度稀释(10倍、100倍和1000倍)后，涂布在PDA培养基表面，待长出单菌落后，挑取菌落边缘菌丝，置于新的PDA培养基表面培养，从而得到病原真菌。但该方法无法确定单菌落是由单个孢子萌发形成的，分离获得的菌株可能不纯。(3)显微镜下直接挑单孢法是将发病植物组织处的分生孢子用灭菌水清洗下来，配置分生孢子悬浮液。将孢子悬浮液涂布到培养基(PDA或者WA)表面后，在解剖显微镜下，使用毛细管拉成的玻璃针挑取单个分生孢子，转移到PDA培养基上培养。但该方法需要特定的解剖显微镜，技术要求高，难度大，容易把孢子刺破，孢子成活率低。这些存在的问题均会严重影响后续的科学研究。

因此，需要找到一种能快速、高效、准确分离纯化植物炭疽菌分生孢子的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法，本发明是基于孢子稀释分离法，结合使用显微镜标记单菌落，以达到快速、高效的分离获得大量纯化的炭疽病菌单分生孢子后代菌株的目的。通过使用本发明的方法，能够从单一病斑上分离获得多种刺盘孢属真菌。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法，包括如下步骤：

S1.植物病斑组织炭疽病菌分生孢子的诱导；

S2.分生孢子悬浮液的配置；

S3.分生孢子悬浮液的浓度测定及稀释；

S4.分生孢子的培养；

S5.单孢子萌发形成的单菌落的标记；

S6.继代培养单菌落获得纯化的单分生孢子分离物。

优选地，步骤S1中所述分生孢子的诱导是将植物病斑组织置于铺有灭菌水湿润的滤纸的器皿中，用保鲜膜覆盖器皿表面，置于白炽灯下光照，诱导病斑组织产生分生孢子；诱导6～24h后，于光学显微镜下检测孢子产量，若在10倍物镜下一个视野内分生孢子的数量达20个，则进行下一步；否则继续进行诱导。

优选地，所述诱导时间为20h。

优选地，步骤S2中所述分生孢子悬浮液的配置是采用灭菌后的镊子夹取病斑组织上的分生孢子堆或分生孢子盘，放入装有灭菌水的灭菌离心管中，于800～1000rpm条件下震荡9～12min，即得分生孢子悬浮液。

优选地，所述震荡条件为900rpm，震荡时间为10min。

优选地，步骤S3中所述分生孢子悬浮液的浓度测定及稀释是吸取分生孢子悬浮液置于普通光学显微镜下观察，计数视野中分生孢子的数量并计算浓度；再用灭菌水将分生孢子悬浮液稀释50倍。

优选地，步骤S4中所述分生孢子的培养是将分生孢子悬浮液接种于弱酸性培养基中，于24～28℃培养18～24h。

优选地，所述培养温度为25℃，培养时间为20h。

优选地，步骤S5中所述单孢子萌发单菌落的标记是将培养器皿倒扣置于普通光学显微镜下观察，寻找单个分生孢子萌发形成芽管进而形成的单菌落，所选择的单菌落周围无其它菌落，在培养皿表面画圈标记萌发的单菌落。

优选地，步骤S6中所述继代培养是用灭菌后的接种针挑取标记的单菌落至新鲜的PDA平板上，封口膜封口，于25℃培养后即得纯化的单分生孢子分离物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的方法操作简单，将孢子液稀释法与显微镜相结合，通过一步法，能在48h内快速、高效的分离获得高纯度的植物炭疽病菌单分生孢子分离物，无需解剖显微镜，技术难度低，单孢分离物成活率高，获得的分离物能确定是纯化的单分生孢子后代。

(2)本发明方法能从单一病斑或发病组织上分离到多种刺盘孢菌，分离到的种类更多，更能反映出田间实际侵染情况，对研究植物炭疽菌的侵染流行和防治方法有重要意义。

附图说明

图1为4个菜豆树炭疽病菌菌株的菌落形态图。

图2为4个苦瓜炭疽病菌菌株的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法，具体包括如下步骤：

1、植物组织上炭疽病菌分生孢子的诱导

植物炭疽病在病斑上易产生大量分生孢子堆，肉眼可见呈橘色或橘粉色的粘液团，显微镜下可观察到大量分生孢子，这种病样材料不需要诱导产孢，可直接进行下面的分离步骤。而有些病斑处于发病初期，分生孢子产量较少，需要在光学显微镜下观察分生孢子产生情况。

切取小块病斑组织置于载玻片上，滴一滴灭菌水，盖上盖玻片，在普通光学显微镜下检测发病组织上的孢子量，如果仅看到少量分生孢子，或者植物组织不新鲜、太干导致分生孢子死亡，则需要诱导分生孢子的产生。

诱导方法：将植物组织置于铺有灭菌水湿润的滤纸的瓷盘或者玻璃培养皿中，用保鲜膜覆盖器皿表面以保湿，置于白炽灯下光照，诱导发病组织产生分生孢子。诱导20h后，光学显微镜检测孢子产量，在10倍物镜下一个视野内存在20个以上分生孢子即可进行下一步试验。

2、弱酸性培养基平板制备

配置马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min后，备用。以下试验操作(除显微镜使用过程)均在无菌工作台中进行。

每150mL PDA培养基中加入200μL灭菌的25％乳酸，混合均匀后，每个直径9cm培养皿中倒入10mL PDA培养基，制作弱酸性培养基平板。

注意：培养基量很重要，不能倒太厚，影响后续显微镜观察。

3、分生孢子悬浮液的配置

吸取500μL灭菌水装入1.5mL的灭菌离心管中，用火焰灼烧灭菌的镊子夹取病斑上的分生孢子堆或黑色小点(分生孢子盘)，放入灭菌水中，用转速为900rpm的振荡器震荡10min，配置分生孢子悬浮液。

4、显微镜下检测分生孢子浓度，将分生孢子悬浮液稀释至适宜浓度

吸取10μL分生孢子悬浮液滴到干净的载玻片上，盖上盖玻片。置于普通光学显微镜下使用10倍物镜观察分生孢子数量，一个视野下约5个分生孢子为宜。用灭菌水将分生孢子悬浮液稀释50倍。

注意：孢子浓度很重要，浓度太高会导致分离不出来纯的单分生孢子后代，浓度太低则没有菌长出来。

5、培养

吸取50μL稀释后的分生孢子悬浮液，用火焰灼烧灭菌的玻璃棒均匀涂布到弱酸性培养基平板表面，在工作台中吹干表面水分后，用封口膜封口，置于25℃恒温培养箱中培养。

6、显微镜下标记单孢子萌发的单菌落

培养20h后，掀开培养皿盖子，将培养皿倒扣在显微镜的载物台上面，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋，在物镜10倍镜下观察分生孢子萌发情况。寻找单个分生孢子萌发形成芽管进而形成的单菌落，以周围无其它菌落为宜，用中性笔画圈在培养皿表面画圈标记萌发的单菌落，每个样品标记10个单菌落。

7、继代培养单菌落，获得纯化的单分生孢子分离物

在无菌工作台上用火焰烧灼的接种针挑取标记的单菌落至新鲜的PDA平板上，每个样品挑取10个单菌落，用封口膜封口，置于25℃恒温培养箱中培养。从而得到纯化的植物炭疽菌单分生孢子分离物。

本实施例所提供的方法操作简单，将孢子液稀释法与显微镜相结合，通过一步法，能够在48h内快速、高效的分离获得高纯度的植物炭疽病菌单分生孢子分离物，无需借助解剖显微镜，技术难度低，获得的分离物能确定是纯化的单分生孢子后代。

实施例2

由于植物炭疽病菌存在复合侵染的情况，即一个病斑上可能存在2种或2种以上的刺盘孢属真菌，而传统分离刺盘孢属真菌时多采用植物组织分离法，一般只能分离到1种刺盘孢菌。采用实施例1的方法，分别对菜豆树和苦瓜病斑组织上的炭疽菌进行分离纯化。结果表明，实施例1的方法能够分离到多种刺盘孢菌，分离到的种类更多，更能反映出实际侵染情况。

具体结果如下：(1)从1个菜豆树发病叶片上分离获得4个单分生孢子分离物，属于2种刺盘孢属真菌，如图1所示。(2)从1个苦瓜发病叶片上分离获得4个单分生孢子分离物，属于3种刺盘孢属真菌，如图2所示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。