一种调控水稻株型的方法与流程

本发明涉及一种调控水稻株型的方法，特别涉及来源于水稻的蛋白质在调控水稻株型中的应用。

背景技术：

跟据联合国经济和社会事务部的预测，到2050年，世界人口将增长到98亿左右，对粮食产量的需求也将增加60％以上。因此，培育更高产量的作物品种仍是当前育种工作的主要目标之一。澳大利亚学者donald于1968年提出了作物理想株型(ideotype)的概念，即由有利于植物光合作用、生长发育和籽粒产量形成的多个农艺性状所组成的理想化株型。具有理想株型的植株能够最大限度地降低个体间竞争强度，从而提高群体的光能利用率、增加生物学产量。理想株型在水稻育种中的应用被认为是继矮化育种和杂交育种后提高水稻产量的新引擎。

因此，鉴定和发掘控制水稻株型的新基因对当前水稻育种具有重要的指导意义，对提高水稻产量、保证粮食安全具有重要的生产应用价值。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供osofp21蛋白的新用途。

本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质为osofp21蛋白，来源于水稻(oryzasatival.)，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)的蛋白质：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)在序列表中序列2所示的氨基酸序列的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

(a4)与(a1)-(a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列表中序列2由310个氨基酸残基组成。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

本发明蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明提供了上述蛋白质在调控植物株型中的应用。

本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与上述蛋白质相关的生物材料在调控植物株型中的应用。

所述与上述蛋白质相关的生物材料为下述b1)-b10)中的任一种：

b1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；

b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

b9)含有b1)所述核酸分子的转基因细胞系；

b10)含有b2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述应用中，b1)所述核酸分子为如下(c1)-(c4)中任一所示：

(c1)编码序列是序列表中序列1的第22-954位所示的dna分子；

(c2)序列表中序列1所示的dna分子；

(c3)与(c1)或(c2)限定的dna分子序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性，且编码权利要求1中所述的蛋白质的dna分子；

(c4)在严格条件下与(c1)或(c2)或(c3)限定的dna分子杂交，且编码权利要求1中所述的蛋白质的dna分子。

其中，序列表中序列1由1215个核苷酸组成，编码序列由933个核苷酸组成。

所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述应用中，所述重组载体是将上述核酸分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白质的重组载体。使用所述核酸分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述调控株型具体表现为如下(d1)-(d8)中任一种：

(d1)调控植物株高；

(d2)调控植物叶色；

(d3)调控植物节间长度；

(d4)调控植物茎秆直径；

(d5)提高或降低植物株高；

(d6)加深或变浅植物叶色；

(d7)增加或缩短植物节间长度；

(d8)加粗或变细植物茎秆直径。

本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料在培育株高变矮、叶色变深、节间变短和/或茎秆变粗的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种培育株高变矮、叶色变深、节间变短和/或茎秆变粗的转基因植物的方法。

本发明提供的培育株高变矮、叶色变深、节间变短和/或茎秆变粗的转基因植物的方法，包括提高受体植物中上述蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物比受体植物的株高变矮、叶色变深、节间变短和/或茎秆变粗。

上述方法中，所述提高受体植物中上述蛋白质的含量和/或活性的方法为通过在所述受体植物中到导入上述蛋白质的编码基因来实现的。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1中第22-954位所示的dna分子。

上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物可为水稻，具体为水稻tp309。

本发明通过在水稻品种tp309中超量表达osofp21基因后获得了株高变矮、叶色变深、节间缩短和茎秆粗壮的水稻植株，表明osofp21基因在调控水稻株型方面发挥着重要的生物学功能，同时该基因在水稻理想株型育种中拥有巨大的应用潜力，在水稻分子设计育种中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为osofp21基因的表达量检测。

图2为osofp21基因过表达转基因植株和野生型tp309的整株表型。

图3为osofp21基因过表达转基因植株和野生型tp309的茎秆表型。

图4为osofp21基因过表达转基因植株和野生型tp309的各节间的长度和直径统计；其中，a为长度统计图；b为直径统计图；i、ii、iii、iv分别代表第一节、第二节、第三节、第四节。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的水稻tp309(也称为野生型水稻，用wt表示)，记载在如下文献：chen，x.，hao，l.，pan，j.，zheng，x.，jiang，g.，jin，y.，gu，z.，qian，q.，zhai，w.，andma，b.(2012).spl5，acelldeathanddefense-relatedgene，encodesaputativesplicingfactor3bsubunit3(sf3b3)inrice.molbreed30，939-949。由中国科学院遗传与发育生物学研究所江光怀研究员保存。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pcambia1300-ubi购自camia公司，澳大利亚。

下述实施例中的农杆菌eha105购自camia公司，澳大利亚。

ms诱导培养基：用于诱导tp309产生愈伤组织。4.4g/l的ms基础培养基，2mg/l的2，4-d，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，2.0g/l的脯氨酸，0.5g/l的谷氨酰胺，调ph至5.8后加入3.8g/l的植物凝胶。

共培养培养基：4.4g/l的ms基础培养基，2mg/l的2，4-d，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，0.5g/l的脯氨酸，100μm/l乙酰丁香酮，调ph至5.2后加入3.8g/l的植物凝胶。

筛选培养基：用于转化后筛选抗性愈伤组织。4.4g/l的ms基础培养基，2mg/l的2，4-d，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，0.5g/l的脯氨酸，0.5g/l的谷氨酰胺，调ph至5.8后加入3.8g/l的植物凝胶。倒培养基前，加入无菌的潮霉素b(终浓度50mg/l)和羧苄青霉素(终浓度400mg/l)。

分化培养基：用于筛选后抗性愈伤组织的再分化。4.4g/l的ms基础培养基，30g/l的山梨醇，0.5g/l的水解酪蛋白，0.5g/l的脯氨酸，0.5g/l的谷氨酰胺，18.35mg/l的铁盐(乙二胺四乙酸铁钠盐)，10m1(100×)的b5有机溶液，0.1g/l的肌醇，调ph至5.8后加入3.5g/l的植物凝胶。倒培养基前，加入无菌的kt(终浓度0.2mg/l)、naa(终浓度0.1mg/l)、6-ba(终浓度2mg/l)和潮霉素b(终浓度40mg/l)。

生根培养基：2.2g/l的ms基础培养基，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，调ph至5.8后加入3.2g/l的植物凝胶。

发明人从水稻中发现了与水稻的株高、叶色、节间长度和茎秆直径等株型相关的基因，将该基因命名为osofp21，其核苷酸序列如序列1所示，由1215个核苷酸组成；其编码序列为序列1第22-954位，编码序列2所示的蛋白，将所述蛋白命名为osofp21。

实施例1水稻osofp21基因过表达转基因植株的获得与表型鉴定

一、水稻osofp21基因的克隆

根据水稻基因注释数据库(ricegenomeannotationproject，rgap)公布的osofp21(loc_os05g36990)基因的基因组序列，以水稻tp309的基因组dna序列为模板，用osofp21-genome-f和osofp21-genome-r组成的引物对进行pcr扩增，得到了如序列表中序列1的第1-1042位核苷酸所示的大小为1042bp的扩增产物片段a，回收备用。

osofp21-genome-f：5′-aaatcttctccttcccctat-3′

osofp21-genome-r：5′-agcacaaagacaaacggaat-3′

以上述回收的1042bp片段a作为扩增模板，用osofp21-gene-f和osofp21-gene-r组成的引物对进行pcr扩增，获得了含有osofp21基因完整编码区序列的片段b，回收备用。

osofp21-gene-f：5′-ggtgttacttaagcttatgcatgtcctcttctgttc-3′

osofp21-gene-r：5′tgtagtccatggtaccttaccttagcctgaaagag-3′

二、水稻osofp21基因过表达载体的构建

1、用限制性内切酶hindiii和kpni酶切过表达载体pcambia1300-ubi(简称pubi1300)，回收10kb左右的载体骨架。

2、将含有osofp21基因完整编码区序列的片段b通过同源重组的方式整合到步骤1回收的pcambia1300-ubi载体骨架上，得到了用于过表达osofp21基因的重组质粒pubi：：osofp21。

3、重组质粒pubi：：osofp21的测序结果表明，osofp21基因完整的933bp编码区序列已整合到玉米泛素基因ubiquitin启动子驱动的过表达载体上。

三、osofp21基因过表达转基因植株与转空载pubi1300载体植株的获得

(一)osofp21基因过表达转基因植株的获得

1、将重组质粒pubi：：osofp21通过电击转化的方法导入到根癌农杆菌eha105中，得到了重组农杆菌。

2、用含150μm乙酰丁香酮的悬浮培养液将步骤1中的重组农杆菌稀释至od600在0.1-0.2之间，得到侵染液。

3、挑选形状规则、淡黄色、颗粒状的预培养的野生型tp309的愈伤组织于50ml无菌的三角瓶中，加入步骤2中的侵染液浸泡15-20min，吸干残余菌液后将愈伤组织转移到共培养培养基上，23℃黑暗条件下共培养48h。

4、挑选无菌、颜色鲜亮的颗粒状愈伤组织，将其放置于筛选培养基中，30℃黑暗培养2-3周。将长出的新的愈伤颗粒放置于新的筛选培养基上，继续培养2-3周，进行第二次筛选。

5、经过两次筛选的抗性愈伤会产生新的愈伤颗粒，从每个独立的胚性愈伤中挑选3颗到分化培养基上，每皿放置5个区域；30℃光照条件下(16h光照/8h黑暗)，培养3-4周至幼苗长出。

6、将步骤5中的幼苗转移到生根培养基中，30℃光照培养(16h光照/8h黑暗)3-4周，练苗后移栽至转基因试验田，得到t0代植株。

(二)转pubi1300载体植株的获得

用pubi1300载体代替重组质粒pubi：：osofp21，按照步骤(二)进行操作，得到t0代空载植株。

(三)转基因植株的鉴定

1、分别提取步骤(一)和步骤(二)中t0代植株和t0代空载植株幼苗的基因组dna，采用hpt-f和hpt-r组成的引物对进行pcr鉴定，有48株t0代植株幼苗和36株t0代空载植株幼苗中得到目的条带为845bp大小的特异性条带，pcr鉴定中扩增得到目的条带的植株即为osofp21基因过表达转基因植株和转空载pubi1300载体植株，共得到48株osofp21基因过表达转基因植株和36株转空载pubi1300载体植株。

其中，所述引物如下：

hpt-f：5′-taggagggcgtggatatgtc-3′

hpt-r：5′-tacacagccatcggtccaga-3′

2、osofp21表达水平分析

将t0代转基因植株自交繁殖的种子进行种植，获得t1代osofp21基因过表达转基因植株和t1代转空载pubi1300载体植株。

1)trizol法提取10株t1代osofp21基因过表达转基因植株、10株t1代转空载pubi1300载体植株和10株水稻tp309的rna，将提取的rna用反转录试剂盒反转录为cdna，以反转录获得的cdna为扩增模板，以水稻actin基因作为内参基因，采用荧光定量pcr检测osofp21基因的相对表达量。

用于鉴定actin基因表达量的引物序列如下：

actin-qrt-f：5′-cctgacggagcgtggttac-3′

actin-qrt-r：5′-ccagggcgatgtaggaaagc-3′

用于鉴定osofp21基因表达量的引物序列如下：

osofp21-qrt-f：5′-gtcctctacaccatcaactcg-3′

osofp21-qrt-r：5′-gaacggaaggaatgagctctag-3′

2)osofp21基因的表达量检测结果显示：与10株水稻tp309和10株转空载pubi1300载体植株相比，t1代osofp21基因过表达转基因植株中osofp21基因的表达水平有显著升高。

如图1所示：以t1代osofp21基因过表达转基因株系oe-1、oe-2(图中以“oe-1”“oe-2”表示)为例，其平均表达量分别为34.6和19.82，而10株水稻tp309(图中以“wt”表示)和10株t1代转空载pubi1300载体植株(图中以“pubi1300”表示)的平均表达量分别为1.00和1.23。

3、表型鉴定

将30株t1代osofp21基因过表达转基因植株定植于大田，在平行条件下培养，以30株水稻tp309为对照，观察整个生长期内30株t1代osofp21基因过表达转基因植株和30株水稻tp309的表型。结果表明，30株t1代osofp21基因过表达转基因植株的株高为105±1.20cm(平均值±标准差)，30株水稻tp309的株高为117±1.16cm(平均值±标准差)。灌浆期的整株照片如图2所示，与水稻tp309(图中以“wt”表示)相比，以t1代osofp21基因过表达转基因株系oe-1(图中以“oe-1”表示)为例，t1代osofp21基因过表达转基因植株表现出株高变矮、叶色变深的表型特征。

灌浆期茎秆各节间的照片如图3所示，与水稻tp309(图中以“wt”表示)相比，以t1代osofp21基因过表达转基因株系oe-1(图中以“oe-1”表示)为例，t1代osofp21基因过表达转基因植株表现出节间缩短和茎秆变粗的表型特征。

灌浆期茎秆各节间的长度和直径统计结果如图4所示，与水稻tp309(图中以“wt”表示)相比，以t1代osofp21基因过表达转基因株系oe-1(图中以“oe-1”表示)为例，t1代osofp21基因过表达转基因植株茎秆各节间均有缩短和变粗，其中第1节间和第2节间的变化最为显著。

上述结果表明，osofp21基因参与调控水稻株型，更具体地与水稻的株高、叶色、节间长度和茎秆直径有关。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

sequencelisting

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种调控水稻株型的方法

<130>gncfy191186

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1215

<212>dna

<213>水稻（oryzasatival.）

<400>1

aaatcttctccttcccctatcatgcatgtcctcttctgttccgactcccgtaggacactt60

caaaatcaaactaacacctgcacaacttcgaccgaagaaaatccgacttcaaaggcgcac120

atacacacaaacaaacaccctcctagtgcggctagtgcggctgcactcgcttcaactgcc180

acgccaatggtgaggaagctgccgctaagctccgtcctctacaccatcaactcggccagg240

gacatcccaccctcgtcgcctccccctccggcggccactccaccggcatggatgtggcct300

tcttgcaagcaccctagagctcattccttccgttcaccgtccgccgcctcggcagccgca360

gcggccaagaccatcgcgtcgatcttcctcgactccggcgagtcctccttcgccaactca420

tccgcgcgcatgcaccacgactgcgcctccgacagcctctccaccgagtccgacgtctcc480

gccacggccgaggacatggccgacgccatagtccgcgggctccgctccgaccgcctcctc540

ttcgagccccgcgcgccctccagctccatcctcgataagaagcccgtgcgccgcgccgca600

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ttcgactcggaggatccgtacgaggacttccgggcgtccatggcggagatgctggccgcg720

cacggcgtgggcgactggggctggctggaggccatgctagggtggtacctccgcgccaac780

ggcaaggagacgcacgccgccatcgtcgcggcgttcgtcgaccttgtcgtctccacggcg840

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agtgtaagtgtgtaa1215

<210>2

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<212>prt

<213>水稻（oryzasatival.）

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