一种餐厨垃圾降解菌及应用的制作方法

本发明属于垃圾处理技术领域，尤其是一种餐厨垃圾降解菌及应用。

背景技术：

海洋是除了陆地之外生物体最大的栖息地，在海洋环境中生活着数以亿计的生物体。随着人类的进步和发展，人们开始在海上进行更多的生产和开发活动，人类在海上获得资源的同时也给海洋环境造成了巨大的破坏。近年来，海上餐厨垃圾逐渐进入人们的视野，其处理方式也引起越来越多的关注。在其处理过程中不仅要考虑到处理成本问题和时效问题，还要考虑到占地面积问题，因此寻找到一种适合处置海洋平台餐厨垃圾的方法变得越来越重要。

餐厨垃圾是一个外延非常广泛的概念，priceet等认为食物生产、运输、分配及消费中产生的废弃部分都属于餐厨垃圾。常见的餐厨垃圾是指居民家庭、餐饮行业以及企事业单位食堂在食品加工和用餐过程中产生的食物废料和残余，是城市生活垃圾的主要组成成分，具有含水率高(可高达60％～80％)、有机质占比大(占到干重的95％～98％)、含盐多等特点。其状态一般呈现为固液混合态，化学组成比较复杂，主要包括水、无机盐以及淀粉、蛋白质、纤维素、脂类等有机化合物，同时还含有大量营养元素，如氮、磷、钾、钙等。

因为海上餐厨垃圾的成分与陆地餐厨垃圾成分基本类似，本着就近的原则，所以期望从陆地餐厨垃圾中筛选出高效的微生物菌群来应用于海上餐厨垃圾，使其达到最大的减量化。

通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、一种高效降解餐厨垃圾的复合菌剂和制备方法及用途(cn102533718a)，复合菌剂是由淀粉降解菌、油脂降解菌、蛋白质降解菌、纤维素降解菌和载体组成；制备：各单一菌株富集培养，筛选，制备载体，再将优质复合菌剂与载体混合；本发明充分利用自然界多种微生物的协同关系，建立以微生物为基础的调控方法，达到利用复合菌剂耦合发酵餐厨垃圾进行加快沼气发酵进程、改善传统发酵工艺、提高沼气产率。

2、一种餐厨垃圾快速降解就地处理工艺(cn109382394a)，其包括以下步骤：分拣分离出餐厨垃圾中的生活垃圾和渗滤液，并将分离出的生活垃圾破碎成直径为10～30mm的颗粒物；搅合颗粒物，并对搅合后的颗粒物进行挤压脱水，使含水率在40％～60％之间；通过微生物降解菌产生多种酶，以对挤压脱水后的颗粒物中的餐厨废弃物进行生物降解并产生供回收利用的有机肥；将分拣分离出的渗滤液、破碎产生的稀释水、挤压脱水产生的液体混合成混合液，对混合液电解、气浮、水解酸化以及生化工艺处理以油水分离混合液，使油水分离产生的废水达标排放，并回收再利用油水分离产生的油脂。本发明可以充分利用餐厨垃圾的剩余价值，节省运输成本，同时及时地对餐厨垃圾进行了快速的降解。

3、一种用于降解中国餐厨垃圾的微生物菌剂及其制备方法(cn102586112a)，包括以下质量比的组分：蛋白质降解菌∶淀粉降解菌∶脂肪降解菌∶纤维素降解菌＝1～2∶1～2∶1～2∶2～3。同时，本发明还公开了上述微生物菌剂的制备方法。本发明针对国内餐厨垃圾的组分，采用相应的微生物菌来逐步降解，最后达到完全消纳的目的，避免了传统填埋方式的不彻底、耗时长，焚烧方式的二次污染大、耗能高，适合当前低碳、环保、节能的要求。

4、一种微生物复合菌剂及其处理方法和应用(cn103756941a)，该微生物复合菌剂包括分解餐厨垃圾的复合菌体和固体发酵辅料，其中：分解餐厨垃圾的复合菌体包括纤维素降解菌10～15份，淀粉降解菌15～30份，蛋白质降解菌15～20份，油脂降解菌15～20份，枯草芽孢杆菌10～15份，铜绿假单胞菌5～15份；固体发酵辅料配比为麸皮50～60kg、豆粕15～20kg、硫酸镁0.4～0.6kg、磷酸二氢钾0.4～0.6kg、磷酸氢二钠0.1～0.2kg、葡萄糖8～10kg；该分解餐厨垃圾的复合菌体接种固体发酵辅料时接种量为0.8％～1％，经固体发酵得到该微生物复合菌剂。该复合微生物菌剂，不仅对油脂、蛋白、纤维类物质具有良好的分解效果，而且可以耐受一定浓度的盐分。最优时，降解率可达到90％以上。

通过对比，首先在混合菌剂的制备过程中，各降解菌的比例与上述专利的比例不同；其次，菌株d1是首次应用到餐厨垃圾中，之前没有应用过，且d1的单菌减量化能达到41.27％，在加入其它菌种后，与其它三株菌产生协同作用，使餐厨垃圾的减量化达到80％。

因此，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种餐厨垃圾降解菌及应用，该d1菌株是首次应用到餐厨垃圾中，且单菌的减量化能达到41.27％，在其他三株菌的协同作用下，能减量80％。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种餐厨垃圾降解菌，名称为d1，分类名称为芽孢杆菌bacillllussp.，保藏编号为：cgmccno.17861，保藏日期：2019年5月28日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

而且，所述餐厨垃圾降解菌筛选自餐厨垃圾中。

而且，所述餐厨垃圾的基本理化性质为：

而且，所述餐厨垃圾降解菌d1的最适生长温度、ph、盐度、最佳接种时间为：30℃、6、1％、9～12，酶活为：2832.4576iu/ml。

如上所述的餐厨垃圾降解菌在餐厨垃圾降解方面中的应用。

如上所述的餐厨垃圾降解菌在制备具有降解能力的餐厨垃圾微生物菌剂方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明d1菌株是首次应用到餐厨垃圾中，且单菌的减量化能达到41.27％，在其他三株菌的协同作用下，能减量80％。

2、本发明d1菌株应用在餐厨垃圾中进行降解时，与常规堆肥相比，在堆肥过程中没有恶臭味的产生。

3、本发明d1菌株应用在餐厨垃圾中进行降解时，明显地缩短了常规堆肥的时间，在18天左右的时候，就能达到很好的减量化效果。

附图说明

图1为本发明中餐厨垃圾降解前后对比图；其中，a为降解后的餐厨垃圾，其中右侧为降解前餐厨垃圾；b为餐厨垃圾的俯视图；

图2为本发明中麦芽糖溶液标准曲线图；

图3为本发明中淀粉酶活测定结果图；

图4为本发明中酪氨酸溶液标准曲线图；

图5为本发明中蛋白酶活测定结果图；

图6为本发明中葡萄糖溶液标准曲线图；

图7为本发明中纤维素酶活测定结果图；

图8为本发明中脂肪酶活测定结果图；

图9为本发明中p-np标准溶液曲线图；

图10为本发明中降解菌株的最适生长温度图；其中，(a)为d1，(b)为db26，(c)为x2，(d)为z7；

图11为本发明中降解菌株的最适生长ph图；其中，(a)为d1，(b)为db26，(c)为x2，(d)为z7；

图12为本发明中降解菌株的最适生长盐度图；其中，(a)为d1，(b)为db26，(c)为x2，(d)为z7；

图13为本发明中降解菌株的生长曲线图；其中，(a)为d1，(b)为db26，(c)为x2，(d)为z7；

图14为本发明中混合菌及单菌的餐厨垃圾降解效果图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种餐厨垃圾降解菌，名称为d1，分类名称为芽孢杆菌bacillllussp.，保藏编号为：cgmccno.17861，保藏日期：2019年5月28日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

较优地，所述餐厨垃圾降解菌筛选自餐厨垃圾中。

较优地，所述餐厨垃圾的基本理化性质为：

较优地，所述餐厨垃圾降解菌d1的最适生长温度、ph、盐度、最佳接种时间为：30℃、6、1％、9～12，酶活为：2832.4576iu/ml。

如上所述的餐厨垃圾降解菌在餐厨垃圾降解方面中的应用。

如上所述的餐厨垃圾降解菌在制备具有降解能力的餐厨垃圾微生物菌剂方面中的应用。

具体的操作可以如下：

1材料与方法

1.1餐厨垃圾

餐厨垃圾取自天津科技大学第二学生食堂。餐厨垃圾(筛菌所用餐厨垃圾是从食堂取回在实验室堆放数天的餐厨垃圾)的基本理化性质如表1所示：

表1餐厨垃圾理化性质

1.2培养基及主要试剂

1.2.1富集分离培养基

淀粉、蛋白质富集分离培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

纤维素降解菌富集培养基：羧甲基纤维素钠20.0g，na2hpo42.5g，kh2po40.5g，胰蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

脂肪降解菌富集培养基：nacl5.0g，蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，豆油10ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4。

1.2.2斜面固体培养基

斜面固体培养基为lb培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

1.2.3分离筛选培养基

(1)淀粉降解菌

初筛培养基：可溶性淀粉2.0g，nacl5g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml。

复筛培养基：nacl10g，胰蛋白胨10g，米饭500g，土豆去皮切成丝500g(灭菌后含水量为65.41％)，取该培养基30g+70g即作摇床培养液。

(2)蛋白降解菌

初筛培养基：干酪素5.0g，葡萄糖1.0g，mgso4·7h2o0.2g，k2hpo41.0g，kh2po40.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

复筛培养基：去掉初筛培养基中的琼脂。

(3)脂肪降解菌

初筛培养基：nacl5.0g，kh2po40.3g，mgso4·7h2o0.1g，k2hpo41.5g，(nh4)2so41.0g，豆油5ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml

复筛培养基：胰蛋白胨1.0g，nh4no30.2g，k2hpo40.5g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.1g，豆油3ml，蒸馏水1000ml

(4)纤维素培养基

初筛培养基：kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.25g，羧甲基纤维素钠2.0g，刚果红染料0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

复筛培养基：kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.3g，nacl0.1g，fecl30.01g，nano32.5g，羧甲基纤维素钠30.0g，蒸馏水1000ml。

1.2.4淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶种子培养液

淀粉酶种子培养液：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，k2hpo42g，nacl1g，cacl20.1g，mgso4·7h2o0.1g，蒸馏水1000ml

蛋白酶种子培养液：k2hpo47g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.2g，干酪素4g，酵母膏6g，nacl0.5g，甘油7g，cacl0.067g，蒸馏水1000ml

脂肪酶种子培养液：nano32g，mgso4·7h2o0.3g，nacl10g，橄榄油20g，cacl0.3g，nh4cl0.3g，蒸馏水1000ml。

纤维素酶种子培养液：cmc-na5g，蛋白胨5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl1g，kh2po41g,蒸馏水1000ml

1.3降解菌的分离、筛选和形态观察

(1)称取1.0g餐厨垃圾置于250ml锥形瓶中，无菌条件下加入99ml无菌水，密封后将锥形瓶放置在30℃、150r/min的恒温震荡培养器中震荡培养48h。培养完毕后，即得到10^-1的稀释液，在无菌超净工作台中取1ml上清液加入到50ml的比色管中，再加入9ml无菌水，制得10^-2稀释液，以此类推，配制10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8等一系列浓度梯度的稀释液。制得的稀释液置于4℃冰箱中保存备用。下面以蛋白降解菌为例说明菌株的筛选和分离纯化步骤，纤维素降解菌和淀粉降解菌同蛋白降解菌。

(2)取上述稀释液100μl于固体富集培养基中并在37℃下培养24h，配制若干50ml的富集培养液，然后从固体富集培养基中挑取不同形态的单独菌落分别接种于液体培养液中，密封后将锥形瓶放在37℃，150r/min的恒温培养箱中培养24h，然后接种于初筛培养基中。

(3)在超净工作台中挑取初筛培养基中单独菌落不断进行分离纯化，直到得到形态一致的单一菌体，将得到的单一菌体分别接种于装有50ml的复筛培养液的150ml锥形瓶中，密封后将锥形瓶放在37℃，150r/min的恒温培养箱中培养24h后接种于斜面固体培养基中，置于4℃冰箱中保存。

(4)使用光学显微镜进行菌株的形态观察。

1.4优势菌种的筛选

1.4.1透明圈法

(1)淀粉降解菌的筛选方法

淀粉降解菌能分泌淀粉酶而将平板培养基中的淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，水解后的淀粉遇碘不再变为蓝色，并在菌落周围出现无色的透明圈。透明圈直径(d)与菌落直径(d)的比值(d/d)可以用于判断淀粉降解菌株酶活力的大小，其大小直接反映了淀粉酶浓度的相对高低。

(2)蛋白降解菌的筛选方法

蛋白降解菌能分泌蛋白酶以促进蛋白质的分解从而使菌落周围出现透明圈。透明圈直径(d)与菌落直径(d)的比值(d/d)可以用于判断蛋白降解菌株酶活力的大小，其大小直接反映了蛋白酶浓度的相对高低。

(3)脂肪降解菌的筛选方法

脂肪降解圈采用罗丹明平板法进行观察，罗丹明平板法判断原理：罗丹明b能与脂肪酶水解的各种可能的底物(单、二油酸甘油酯，油酸，油酸钠)结合为聚合体，该聚合体受紫外光激活，产生橘黄色荧光。依据有无橘黄色、颜色深浅和水解圈大小来判断是否产脂肪酶和对所产脂肪酶活力大小进行初步判断。

(4)纤维素降解菌的筛选方法

纤维素降解菌能分泌纤维素酶而将平板培养基中的纤维素降解成小分子的低聚糖及纤维二糖、葡萄糖等。水解后的糖类与刚果红染粒形成红色沉淀。因此在纤维素刚果红培养基上，纤维素降解菌菌落周围均能形成红色的水解圈，水解圈直径(d)与菌落直径(d)的比值(d/d)可以用于判断纤维素降解菌株酶活力的大小，其大小直接反映了纤维素酶浓度的相对高低。1.4.2酶活测定

(1)淀粉降解菌的酶活测定方法

利用dns法测定淀粉酶活力。取0.5ml经离心后的菌液上清液加入试管中，首先置于40℃水浴中保温5min，而后加入0.5ml质量浓度为1％淀粉溶液(预先40℃水浴5分钟)，混匀后在40℃水浴中反应10分钟，反应结束后在每个试管中加入2mldns试剂，接着沸水浴5min，反应完成后待试管冷却到室温，定容至25ml。空白对照中先在试管中加入2mldns试剂，再加入1ml质量浓度为1％淀粉溶液，然后沸水浴5min，后续操作同样品管，以空白为对照，在520nm处测定吸光值。一个淀粉酶活力单位定义为1ml酶液每分钟生成1μg麦芽糖所需的酶量。用麦芽糖溶液作标准曲线。

(2)蛋白降解菌的酶活测定方法

按folin-phenol试剂法测定中性蛋白酶活力，步骤为：试样经离心机离心分离后的上清液即粗酶液，取0.1ml酶液加入试管中，于40℃水浴锅中预热3～5min，接着向管中加入0.9ml质量浓度为2％酪蛋白溶液，40℃保温20min后立即加入2ml0.4m三氯乙酸溶液终止反应，15min后用滤纸过滤。吸取1ml滤液，依次加入5ml0.4m碳酸钠和1ml福林—酚试剂，充分摇匀，于40℃水浴中反应20min。实验采取三次测定取均值的方法，空白对照中先加入2ml0.4m三氯乙酸溶液，再加入1ml质量浓度为2％酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤，后续操作同样品管。以空白为对照，于680nm处测其吸光值。一个酶活单位规定为1ml酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。以标准100μg/ml酪氨酸浓度梯度作标准曲线。

(3)脂肪降解菌的酶活测定方法

吸取4mlp-npp作为底物溶液，水浴40℃预热5min，然后加入1ml酶液反应10min，立即加入5ml0.5mol·l^-1的三氯乙酸，混匀后放置5min终止反应，再加入5.15ml0.5mol·l^-1naoh调节ph值至与反应前一致(空白将酶液换成蒸馏水)，于405nm处测定吸光值。一个酶活单位定义为lml酶液每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量。取一系列p-np标准溶液呈适当的浓度梯度，绘制吸光度一浓度关系曲线。

(4)纤维素降解菌的酶活测定方法

采用3,5一二硝基水杨酸比色定糖法(dns)测定。具体方法为：取菌液放入离心管，离心后移取上清液0.5ml于试管中，加入含质量浓度为0.5％cmc-na的柠檬酸缓冲液0.5ml，然后在50℃水浴30min后，立即在每试管内加1.5mldns试剂，然后煮沸5min后，立即用流水冷却，定容至25ml。空白对照中，先在试管中加入1.5mldns试剂，然后加入1ml含质量浓度为0.5％cmc-na的柠檬酸缓冲液，沸水浴5min，后续操作同样品管。以空白为对照，在540nm处测定吸光值。再对比标准曲线，求得其糖含量。一个纤维素酶单位定义为1ml酶液每分钟水解纤维素生成lmg葡萄糖所需的酶量。用葡萄糖溶液作标准曲线。

1.5菌种的鉴定

细菌采用16srna基因分析的方法鉴定到属，真菌采用its基因分析的方法鉴定到属。分别用真菌和细菌的dna提取试剂盒对筛选出的菌种的dna进行提取。以提取的dna为总模板进行pcr扩增，细菌的pcr过程为：采用的引物为27fprimer

agagtttgatcmtggctcag，1492rtacggytaccttgttacgac，pcr扩增反应体系如下表所示：

反应过程如下表：

然后送到北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行纯化测序。真菌的pcr过程为：引物：its1tccgtaggtgaacctgcgg，its4tcctccgcttattgatatgc，pcr扩增反应体系如下表所示：

反应过程如下表所示：

然后送到北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行纯化测序。

1.6优势菌种的生长条件测定

将活化后的菌种分别接种到装有50mllb培养液的150ml锥形瓶中，采用单因素实验方法，在其他条件相同的情况下，分别改变温度、ph、盐度进行摇床培养，培养2d，利用比浊法，用紫外分光光度计在600nm条件下测定吸光值，确定每种菌的最适生长条件。

温度、ph、盐度分别设定为以下几个梯度：(1)温度：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；(2)ph：4、5、6、7、8、9、10、11、12；(3)盐度：0.5％、1％、2％、3％、4％、5％。

1.7优势菌种的生长曲线测定

定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气等条件下，该菌群就会由小到大，发生有规律地增长。采用比浊法测定，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，可绘制一条平滑曲线，该曲线称为菌株的生长曲线。本实验中，取100μl菌液于装有200mllb培养液的锥形瓶中，在30℃，150r/min的恒温震荡箱中连续培养48h，每隔2h在600nm条件下测定吸光度，得到一系列数据，将这些数据连接成一条平滑的曲线，即得到该菌株的生长曲线。

1.8复合微生物菌剂的制备

将四株菌株在适宜的温度、盐度和ph条件下培养到各自的对数增长期，然后按餐厨垃圾中各营养成分的比例即淀粉：蛋白质：纤维素：脂肪的质量比为2.65:1.78:1:1.14，吸取不同的菌液混合到一起配制成具有高效降解能力的餐厨垃圾微生物菌剂。

1.9降解菌对餐厨垃圾的减重率

先进行单菌降解餐厨垃圾的实验，取每种菌液10ml在其最适的条件下投入到50g的餐厨垃圾中，此后每天加入50g的餐厨垃圾，根据质量变化衡量餐厨垃圾的减重率。然后取上述制得的复合菌液10ml加入到50g餐厨垃圾中，同样此后每天加入50g餐厨垃圾，连续测定25天，以质量变化为指标衡量餐厨垃圾减重率。每2或3天测定一次，第三天餐厨垃圾和餐厨垃圾处理器的质量记为m3,加入的餐厨垃圾的质量记为m，餐厨垃圾处理器的质量记为m0，那么0～3d的减重率可以按以下公式进行计算：

m0-餐厨垃厨垃圾处理器的重量

m-投加的餐厨垃加的餐厨重量

mx-第n天餐厨垃圾和餐厨垃圾处理器的重量

n-天数。

2结果与讨论

2.1餐厨垃圾降解菌的分离与形态观察

从餐厨垃圾中分离出十几株淀粉、蛋白质、纤维素、脂肪降解菌，通过透明圈和酶活的测定，选出了4株降解效果最好的菌株，分别是淀粉降解菌1株，蛋白降解菌1株，纤维素降解菌1株，脂肪降解菌1株，分别编号为d1、db26、x2、z7。通过光学显微镜对单菌以及菌落的观察，结果如表2所示。

表2各菌株的形态观察

2.3降解菌透明圈结果

2.3.1淀粉降解菌

通过在长有淀粉降解菌的培养基中滴加碘液，可以观察到在菌落周围形成透明的水圈，根据水圈的大小来定性判断淀粉降解能力大小，测定结果如表3所示。

表3淀粉降解菌透明圈结果

根据透明圈直径与菌落直径的比值(d/d)，以大于1.5作为筛选淀粉降解菌株的标准。筛选出的具有淀粉降解能力的优势菌有5株，它们分别是d1、d2、d3、d9、d12，然后再根据测得的酶活进一步筛选出降解能力最强的菌株。

2.3.2蛋白降解菌

在蛋白降解菌周围会产生明显的透明水圈，可以根据水圈的大小来定性判断产蛋白酶能力的大小，测量结果如表4所示。

表4蛋白降解菌透明圈结果

根据透明圈直径与菌落直径的比值(d/d)，以大于4.00作为筛选蛋白降解菌株的标准。筛选出的具有蛋白降解能力的优势菌有5株，它们分别是db1、db16、db20、db21、db26，然后再根据测得的酶活进一步筛选出降解能力最强的菌株。

2.3.3脂肪降解菌

在脂肪降解菌的周围会产生模糊的晕圈，可以根据晕圈的大小来判断产脂肪酶活力的大小。

表5脂肪降解菌透明圈

根据透明圈直径与菌落直径的比值(d/d)，以大于2.00作为筛选脂肪降解菌株的标准。筛选出的具有脂肪降解能力的优势菌有5株，它们分别是z6、z7、z16、z21、z22，然后再根据测得的酶活进一步筛选出降解能力最强的菌株。

2.3.4纤维素降解菌

因为在纤维素培养基中加有刚果红染料，所以在纤维素降解菌的周围会产生一圈红色水圈，可以以此来判定降解能力的大小，测量结果如表5所示。

表5纤维素降解菌透明圈结果

根据透明圈直径与菌落直径的比值(d/d)，以大于1.60作为筛选纤维素降解菌株的标准。筛选出的具有纤维素降解能力的优势菌有5株，它们分别是x2、x3、x7、x12、x13，然后再根据测得的酶活进一步筛选出降解能力最强的菌株。

2.4降解菌株的酶活测定结果

2.4.1淀粉降解菌

淀粉降解菌的酶活测定结果如图2和图3所示，由图3可以看出在以透明圈直径与菌落直径的比值为标准筛选出的5株菌里，再进一步进行酶活测定，结果显示，d1的产酶能力最强，达到了2832.4576iu/ml，所以在接下来的实验中选择d1作为优势菌株进行下一步的研究。

2.4.2蛋白降解菌

蛋白降解菌的酶活测定结果如图4和图5所示，由图5可以看出，以透明圈为依据进行酶活测定，测定结果中显示db26的产酶能力最强，达到了185.2468iu/ml，所以接下来的实验中选择db26作为优势菌种进行研究。

2.4.3纤维素降解菌

纤维素降解菌的酶活测定结果如图6和图7所示，从图7中可以得到5株菌中，x2的酶活最好，达到了4.091iu/ml，所以选择x2作为优势菌种进行深入的研究。

2.4.4脂肪降解菌

脂肪降解菌的酶活测定结果如图8和图9所示，从图9中可以得到5株菌中，z7的酶活最好，达到了26.98iu/ml，所以选择z7作为优势菌种进行深入的研究。

2.5菌种的鉴定

通过dna测序实现了微生物的分子测序，测定了4株菌的属，如表6所示。

表6优势菌种的分子鉴定结果

由鉴定结果可知，d1是阿耶波多氏芽孢杆菌，x2是里氏木霉，db26是阿美氏曲霉，z7是枯草芽孢杆菌。鉴定结果显示d1、z7是细菌，db26和x2是真菌。在筛选出来的三株菌株里，有两株是第一次应用在餐厨垃圾中，即d1和db26，且这两株的产酶能力都很强，所以很有研究意义和价值。

2.6d1、db26、x2、z7四株降解菌的生长条件的研究.

2.6.1四株降解菌的生长温度

四株降解菌的最适生长温度如图10所示，从图10(a)中可以看出，d1淀粉降解菌的最适生长温度范围为25℃～30℃，从(b)中可以得到db26蛋白降解菌的最适生长温度范围为30℃～50℃，从(c)中可以得出x2纤维素降解菌的最适生长温度范围为20℃～40℃，从(d)中可以得出z7脂肪降解菌的最适生长温度为20℃。

2.6.2四株降解菌的生长ph

四株降解菌的最适生长ph如图11所示，图11所示的是四株菌株的最适ph的研究结果，从(a)、(b)、(c)、(d)中可以得到d1淀粉降解菌、db26蛋白降解菌、x2纤维素降解菌、z7脂肪降解菌的最适ph分别为5～9、6～8、5～8、8～10。

2.6.3四株降解菌的生长盐度

四株降解菌的最适生长盐度如图12所示，从图12中得到了四株菌株的最适生长盐度条件，可以得到d1、db26、x2、z7的最适盐度都为0.5％～1％。

2.7四株降解菌的生长曲线

四株降解菌的生长曲线如图13所示，从测得的生长曲线的结果可知，四株菌的生长曲线大致都分为3个过程：延滞期、对数增长期、稳定期，因为测得时间的原因，并没有观测到菌株的衰亡期。从图中可以看到d1的对数增长期出现在9～18h，db26的对数增长期出现在5～15h，x2的对数增长期出现在9～15h，z7的对数增长期出现在5～14h。对数增长期是菌体生长代谢最为旺盛的阶段，也是由种子培养基大规模接种到发酵培养基的最佳时期。因此进一步进行研究，得到四株菌的最佳接种时间，如下表所示：

表7四株菌株最佳接种时间

2.8降解菌株对餐厨垃圾的降解效果

结果如图1和图14所示，从图14中可以看到，混合菌对餐厨垃圾的降解效果要明显高于其他三株单菌的降解效果，在第25天的时间段里达到了80％。在4株单菌中，淀粉的降解效果最好，在第25天的时间段里达到41.27％，其次是蛋白降解菌，是29.33％，然后是脂肪降解菌15.34％，最差的是纤维素降解菌，仅为10.59％。

3结论

从餐厨垃圾中筛选出4株具有较强降解效果的菌株，并对其进行了分子水平的鉴定，分别是d1阿耶波多氏芽孢杆菌、db26阿美氏曲霉菌、x2里氏木霉、z7枯草芽孢杆菌。得到d1的最适生长温度、ph、盐度、最佳接种时间为分别是：30℃、6、1％、9～12；db26的最适生长温度、ph、盐度、最佳接种时间分别是：40℃、7、1％、5～8；x2的最适生长温度、ph、盐度、最佳接种时间为分别是：30℃、8、1％、10～13，z7的最适生长温度、ph、盐度、最佳接种时间分别为：20℃、8、1％、6～10。并测得4株菌的酶活分别为：2832.4576iu/ml、185.2468iu/ml、4.09iu/ml、26.98iu/ml。通过实验，得到4株混合菌25天对餐厨垃圾的降解率达到了80％。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种餐厨垃圾降解菌及应用

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