本发明涉及一种生产质粒的方法，特别是通过培养大肠杆菌生产质粒的方法。
背景技术：
质粒是能在细胞内独立复制的非基因组遗传物质，其携带的基因在塑造宿主细胞的某些特性时非常重要，比如携带抗生素抗性基因的质粒可以使宿主获得对相应抗生素的抵抗能力。在对生物进行工程改造时，用质粒的方式将外源dna导入细胞中是最常用的改造方法。因此如何获得目标质粒，尤其是高通量地获得足量的质粒是一种现实需求。
在大肠杆菌中，通常质粒的产量与3个因素相关：1)质粒的拷贝数；2)质粒的长度；3)菌体的密度。质粒在一个细胞内的数量即其拷贝数与质粒的复制子种类相关，基于puc19质粒的复制子，其拷贝数能够达到200个，而基于pbr322质粒的复制子，拷贝数一般在40个左右；基于f1因子复制子的质粒，则在细胞内一般就只有1-2个拷贝。所以质粒的拷贝数可以极大地影响质粒的产量。在质粒的复制子确定的情况下，质粒的产量与质粒的长度、菌体的密度都是线性相关的。在质粒的序列确定的情况下，提高菌体密度和增加培养液体积是仅有的两个选择。
培养大肠杆菌的液体容器有三角瓶、试管、384孔深孔板、96孔深孔板、48孔深孔板等。三角瓶的摇菌体积在10ml-1000ml之间，对于单个质粒需求量很大时适用；试管的摇菌体积在0.5ml-10ml之间，其获得的质粒量可以满足大部分下游需求；而深孔板是为高通量细菌培养开发的，其摇菌体积在0.01ml-1ml之间，获得的质粒仅能满足少量下游操作。
菌体的生长密度一般来说与生长环境密切相关，因素包括温度、氧气含量、ph值、培养基组成等。lb培养基是培养大肠杆菌时最常使用的，其组成是酵母浸出膏、胰蛋白胨和氯化钠，这是一种营养丰富的培养基，可以用于绝大多数场合下的细菌培养，包括质粒提取和蛋白表达。sob培养基在lb培养基的基础上增加了胰蛋白胨的用量和镁离子，相对lb培养基来说，可以提高菌体密度约60％；而soc培养基在sob培养基的基础上又添加了葡萄糖，营养更加丰富。不过添加镁离子和葡萄糖都为培养基的灭菌操作带来了额外的麻烦，镁离子在121度高温高压灭菌时容易产生沉淀，葡萄糖在高温下也容易分解产生有害物质，因此都需要额外添加，或者选择特殊的灭菌方法，导致这两种培养基没有得到普遍使用。还有一些培养基用到了磷酸作为缓冲液，经过测试，稳定性难以达到要求。
技术实现要素：
本发明通过在液体培养基中添加固体培养基的方法，可以使菌体密度提高2-4倍。从而将质粒的产量提高2-4倍。这使得用深孔板摇菌提取的质粒的量也能满足大部分下游应用的需求。实现了高通量获取中高产量质粒的目的。
本申请的一方面提供一种生产质粒的方法，其是一种高通量的在大肠杆菌中获得中高产量质粒的方法，所述方法包括用加入固体培养基的液体培养基培养含质粒的大肠杆菌。
在该方法中，在液体培养基中加入一定比例的固体培养基，固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，而液体培养基中的一些代谢废物可以扩散到固体培养基中，从而有效地提高菌体密度，增加质粒产量。
在一些实施方案中，所述的液体培养基包括但不限于lb液体培养基、soc液体培养基、2xyt液体培养基和tb液体培养基等，特别是指lb液体培养基。
在一些实施方案中，所述的固体培养基，是指含有琼脂的培养基，其琼脂的含量在0.5％-2％，特别是指0.7％-1％。
在一些实施方案中，所述固体培养基，其成分中除了琼脂，还含有1％-4.5％的酵母浸出膏，特别是含有2.5％的酵母浸出膏。
在一些实施方案中，所述固体培养基，其成分中除了琼脂，还含有1％-5％的胰蛋白胨，特别是含有3％的胰蛋白胨。
在一些实施方案中，所述的一定比例的固体培养基，是指固体培养基的体积是液体培养基体积的30％-200％，特别是指50％-100％，尤其是75％。
本发明的另一方面提供一种在48孔深孔板中培养大肠杆菌，并收获中高产量质粒的方法。其特征在于：
(1)在48孔深孔板的底部凝固0.3ml-2ml的固体培养基，优选是0.6ml的固体培养基；
(2)所述的固体培养基中含有0.5％-2％的琼脂和1％-4.5％的酵母浸出膏，优选是0.7％的琼脂和2.5％的酵母浸出膏；
(3)所述的固体培养基，在凝固时液面与深孔板底部有30度-80度的夹角，以增加液体培养基与固体培养基的接触面，优选是45-65度夹角；
(4)在固体培养基上再添加0.5ml-2ml的液体培养基，液体培养基包括但不限于lb液体培养基、soc液体培养基、2xyt液体培养基和tb液体培养基等，优选是lb液体培养基；
(5)在所述的液体培养基上接入需要培养的菌种，再将深孔板置于转速在100-300转/分钟、温度为20摄氏度-45摄氏度的恒温摇床上培养5-48小时，优选是转速在220转/分钟、温度为37摄氏度的恒温摇床上培养14-20小时，得到的菌液可用于常规质粒提取。
利用本发明的方法培养含质粒的大肠杆菌，在每株细菌的质粒需求量一定的情况下，可以降低每株细菌的培养体积，从而可以高通量地培养多株细菌，获得多个质粒。
具体实施方式
本发明涉及一种高通量的在大肠杆菌中获得中高产量质粒的方法。通过在液体培养基中添加固体培养基，可以提高细菌生长密度2-4倍，从而从相同体积的菌液中获得2-4倍的质粒产量。
固体培养基一般是用于单克隆菌落的培养。琼脂在凝固时形成的是多孔状的网络结构，其孔径大小允许蛋白质等营养物质的通过，细菌由于体积太大只能在固体培养基表面的某个点附近活动，而固体培养基中的营养物质通过扩散被细菌吸收利用。
通过控制琼脂的浓度可以实现营养物质释放的速度，从而为细菌生长提供稳定的环境。而细菌代谢产生的有害物质也可以通过扩散进入固体培养基，缓解了过高浓度的代谢产物对细菌生长的抑制作用，提高菌体生长密度的上限。
在一个测试中，我们以一个含长度为2800碱基的羧苄青霉素抗性的高拷贝质粒(记为hp)的dh5alpha菌和一个含长度为3177bp的卡那霉素抗性的低拷贝质粒(记为lp)的dh5alpha菌为测试对象，在这个测试中，固体培养基的体积为1.5ml，液体培养基为2mllb标准培养基，摇菌是在15ml试管中进行的，摇床被设置为270转/分钟，温度为37度，接种后摇菌时间为16小时。得到的2ml菌液用天根质粒小提试剂盒提取，提取过程按相应说明书进行。其测试结果见表1。表1中最后两行是直接在lb标准培养基上添加酵母浸出膏，没有固体培养基。可以看到，在0.7％琼脂的条件下，固体培养基中存在1.5％-5.5％酵母浸出膏都能使高拷贝质粒产量提高3倍或以上，尤其是添加2.5％酵母浸出膏的固体培养基可以获得超过4倍的质粒产量。而对于低拷贝质粒而言，提升的效果没有那么明显，只有2.2倍左右。直接在lb培养基中添加酵母浸出膏也能获得一定程度的质粒产量，比如添加3.5％酵母浸出膏可以使高拷贝质粒产量提高2.5倍，对低拷贝质粒提高2.1倍。从这个角度来说，对于高拷贝的质粒，固体培养基的作用是在提供相同营养的条件下再增加62％的质粒产量。而对于低拷贝的质粒，则不是很明显，但也比对照要高很多。经过多次涉及其它质粒的测试，发现对于高拷贝质粒来说，0.7％琼脂+2.5％酵母浸出膏的组合，得到的质粒产量与对照之比始终在4左右，而对于低拷贝载体来说，这个比值是2.5左右。
表1：测试质粒产量
基于以上数据，进一步把液体培养基的体积缩小到0.8毫升，固体培养基的体积也同步减少到0.6毫升，总体是1.4毫升，固体培养基配方沿用0.7％琼脂+2.5％酵母浸出膏。理论上，0.8毫升菌液得到的质粒产量相当于2-3.2毫升标准lb培养基菌液所得的质粒产量，足以应付大多数应用的需求，包括限制性内切酶消化、测序、转化、转染等。1.4毫升体积的培养基可以被放入标准的2.2毫升96孔深孔板，不过由于液体太深导致氧气无法充分扩散，96孔深孔板的测试结果不是很理想。进一步地，测试了48孔深孔板，在摇床转速为220转/分钟时，获得的质粒产量增加值与在试管中的一致，即高拷贝质粒产量普遍提高了4倍，低拷贝质粒产量平均提高了2.5倍。进一步地，本发明测试了50毫升圆底离心管作为摇菌容器，液体培养基为6毫升，固体培养基为4.5毫升，也取得了类似的比值。
上述方法还可以延伸到更小体积或更大体积，而不影响提高的水平。
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
实施例1：48孔深孔板摇菌并提取质粒
1、在48孔深孔板中制备固体培养基，其步骤是
(1)配制100毫升液体a，由2.5克酵母浸出膏、0.7克琼脂粉末和97毫升水组成。
(2)在搅拌中，取0.6毫升液体a到48孔深孔板的每一个孔中。搅拌是为了使琼脂粉末分散均匀。
(3)将加了液体a的深孔板放入灭菌锅，121度高温高压灭菌20分钟。
(4)灭菌完成后，趁热将深孔板取出，在摇床上220转/分钟摇1分钟，并将深孔板的一个短边抬起，以45度的方式斜置在一个立面上。
(5)待琼脂凝固后待用。这样制作的深孔板可以在4摄氏度密封存放一个月而不影响使用。
2、选择8个含有质粒的大肠杆菌作为实施对象，这8个菌分别被标记为a/b/c/d/e/f/g/h，这8个菌的信息见表2。
表2：大肠杆菌所含质粒信息
3、取一个有固体培养基的48孔深孔板，在每个孔中加入0.8毫升标准lb培养基及相应的抗生素，并接入表2中的8个菌种。同时再取一个48孔深孔板，不加固体培养基，只加入0.8毫升标准lb培养基，也接入这8个菌种，作为对照。
4、将深孔板固定到恒温震荡培养箱的摇床上，温度为37摄氏度，转速为220转/分钟，培养时间16小时。
5、从深孔板上取各0.8毫升上述菌液提取质粒，质粒提取按照天根质粒小提试剂盒(天根编号#dp103-02)的说明书进行。
6、用紫外分光光度计测试其od260，并换算质粒产量(见表2)，
7、用紫外分光光度计测试其od260/od280,所得值都位于1.8-2.0之间。
8、对质粒进行ecori、hindiii酶切测试，条带位置符合预期。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。