一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法与流程

发明涉及细胞定量分析技术领域，具体为一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法。

背景技术：

流式细胞术是以单个细胞为基础的一项技术，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，如可以进行小鼠血管细胞膜免疫表型分析，而制备小鼠血管组织单细胞悬液是流式细胞分析的前提。现有的血管组织单细胞悬液的制备较为困难，很难获得产率高、活性高及功能强的单细胞，阻碍了进一步的实验研究，并且细胞数量不足、细胞碎片过多、细胞黏连成团等均可导致实验的失败。因此如何制得质量更好的单细胞悬浮液是目前需要解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，发明提供如下技术方案：一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法，具体包括以下步骤：

首先，准备好1ml的酶混合液、存活的健康野生小鼠、整个桌面为平整冰面的操作台及若干仪器；

然后，用200～500ul的水合氯醛将准备好的所述野生小鼠腹腔注射麻醉致死，并立即用20ml的磷酸缓冲盐溶液对所述野生小鼠的血管进行灌注冲洗，再用体积分数为75％的酒精对死亡的所述野生小鼠进行整体消毒，完成消毒后进行开胸腹手术，并暴露心脏和主动脉，整个操作过程于所述操作台上完成；

然后，从完成开胸腹手术的所述野生小鼠体内取下11mm长的主动脉血管，置于装有1ml2％fcs溶液的1.5ml的第一离心管中，并将所述主动脉血管完全浸泡在溶液内，操作完成后将所述第一离心管放置于所述操作台上；

然后，在显微镜的辅助下，迅速的清除浸泡于所述第一离心管中的主动脉血管周围的脂肪和结缔组织，操作过程中保持所述主动脉血管完整，整个操作过程于所述操作台上完成；

然后，将脂肪及结缔组织分离过后的所述主动脉血管从第一离心管中取出并置于1.5ml的第二离心管中，加入100ul的所述酶混合消化液至第二离心管中，将所述主动脉血管完全浸泡在溶液内，并将所述主动脉血管用眼科剪剪碎，整个操作过程于所述操作台上完成；

然后，用900ul的所述酶混合液将所述眼科剪及第二离心管的内壁冲洗干净，将所述第二离心管盖紧并完全置于37度的水浴锅中放置30min，过程中不断用吸管吹打；

然后，待放置30min后，在所述第二离心管中的混合液中加等体积2％fcs的磷酸盐缓冲液终止酶的消化作用，并检测组织是否消化完全，若消化完全进行下一步；若未消化完全，则继续将所述第二离心管置于37度的水浴锅中10min，过程中不断用吸管轻柔吹打；

最后，待消化完全，将置于所述水浴锅中的第二离心管取出，并将第二离心管中的混合液经过滤网过滤后倒入15ml的第三离心管中，所述第三离心管中所得液体即为单细胞悬液。

优选的，步骤1中1ml的所述酶混合液是由880ml的hank′s缓冲液、100ul的25u/ml的胶原酶i、10ul的60u/ml的透明质酸酶、10ul的60u/ml的脱氧核糖核酸酶和10ul的450u/ml的胶原酶xi混合而成，同时配置所述酶混合液时还可以适当加入2％的fcs。

优选的，步骤3中取下的所述主动脉血管上包含主动脉弓上的窦、主动脉弓、头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。

优选的，步骤5中使用所述眼科剪剪碎主动脉血管的过程控制在10min以内。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、应用剪碎和混合酶联合消化法制备小鼠血管组织单细胞悬液简便可行，且免疫细胞较多，为血管免疫细胞的研究提供了有效的组织单细胞悬液制备方法。

2、本技术方案相对于机械剪及研磨血管组织而言，单细胞产率高、活性高及功能强细胞数量足、细胞碎片少、细胞黏连成团现象较轻，为后期血管免疫细胞进行流式检测奠定了基础。

3、由于细胞离开组织容易死亡，为了保证细胞的活性，整个过程要泡在2％fcs中，且在冰上迅速进行，进而保证完成操作后，细胞任然具有较高的活性。

4、本技术方案将机械发和酶消化法结合，利用酶活性最适温度以及采用胶原蛋白及透明质酸，dna酶进行处理。经过反复消化，能够较好的处理血管组织在操作过程中容易黏连成团的问题，进而获得形态完整、分散度较好、背景较干净、杂质少、细胞大小不一、形态多样的细胞。

附图说明

图1为流式细胞分析图之一；

图2为本技术方案制取细胞液后的流式细胞分析图之二；

图3为本技术方案制取细胞液后的检测结果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

发明提供一种技术方案：一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法，具体包括以下步骤：

s01、首先，准备好1ml的酶混合液、存活的健康野生小鼠、整个桌面为平整冰面的操作台及若干仪器；

s02、然后，用200～500ul的水合氯醛将准备好的所述野生小鼠腹腔注射麻醉致死，并立即用20ml的磷酸缓冲盐溶液对所述野生小鼠的血管进行灌注冲洗，再用体积分数为75％的酒精对死亡的所述野生小鼠进行整体消毒，完成消毒后进行开胸腹手术，并暴露心脏和主动脉，整个操作过程于所述操作台上完成；

s03、然后，从完成开胸腹手术的所述野生小鼠体内取下11mm长的主动脉血管，置于装有1ml2％fcs溶液的1.5ml的第一离心管中，并将所述主动脉血管完全浸泡在溶液内，操作完成后将所述第一离心管放置于所述操作台上；

s04、然后，在显微镜的辅助下，迅速的清除浸泡于所述第一离心管中的主动脉血管周围的脂肪和结缔组织，操作过程中保持所述主动脉血管完整，整个操作过程于所述操作台上完成；

s05、然后，将脂肪及结缔组织分离过后的所述主动脉血管从第一离心管中取出并置于1.5ml的第二离心管中，加入100ul的所述酶混合消化液至第二离心管中，将所述主动脉血管完全浸泡在溶液内，并将所述主动脉血管用眼科剪剪碎，整个操作过程于所述操作台上完成；

s06、然后，用900ul的所述酶混合液将所述眼科剪及第二离心管的内壁冲洗干净，将所述第二离心管盖紧并完全置于37度的水浴锅中放置30min，过程中不断用吸管吹打；

s07、然后，待放置30min后，在所述第二离心管中的混合液中加等体积2％fcs的磷酸盐缓冲液终止酶的消化作用，并检测组织是否消化完全，若消化完全进行下一步；若未消化完全，则继续将所述第二离心管置于37度的水浴锅中10min，过程中不断用吸管轻柔吹打；

s08、最后，待消化完全，将置于所述水浴锅中的第二离心管取出，并将第二离心管中的混合液经过滤网过滤后倒入15ml的第三离心管中，所述第三离心管中所得液体即为单细胞悬液。

步骤1中1ml的所述酶混合液是由880ml的hank′s缓冲液、100ul的25u/ml的胶原酶i、10ul的60u/ml的透明质酸酶、10ul的60u/ml的脱氧核糖核酸酶和10ul的450u/ml的胶原酶xi混合而成，同时配置所述酶混合液时还可以适当加入2％的fcs。

步骤3中取下的所述主动脉血管上包含主动脉弓上的窦、主动脉弓、头臂动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。

步骤5中使用所述眼科剪剪碎主动脉血管的过程控制在10min以内。

在另一个实施例中，小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法还可以通过以下步骤实现，具体包括以下步骤：

s10、首先，准备好1ml的酶混合液、存活的健康野生小鼠、整个桌面为平整冰面的操作台、若干仪器以及1ml的所述酶混合液；

s20、然后，将剥离好的主动脉血管置于第一消化管中，滴加100ul酶混合液添加到所述第一消化管，并将位于所述第一消化管中的主动脉血管中剪碎，整个过程在冰上操作，且时间控制在10min以内；

s30、然后，向所述第一消化管中添加900ul酶混合液，并使其与剪碎的所述主动脉血管充分混合；

s40、然后，将所述第一消化管盖紧并完全置于37度水浴锅中孵化40min，孵化过程中不断震荡所述第一消化管，直至所述主动脉血管组织完全消化；

s50、然后，将消化好的所述主动脉血管组织短暂离心，离心温度为4℃，离心力值为800，时间为5min，至完成离心；

s60、然后，将离心过后的所述主动脉血管组织用吸管混匀，之后过滤到15ml的离心管中，同时用1ml2％fcs洗涤所述第一消化管，洗涤完成后将溶液也加入到离心管中；

s70、然后，将所述离心管再次离心，4℃，离心力值为800，时间为5min，至完成离心，再重复上一步骤；

s80、最后，过滤离心液，即得到单细胞悬液。

步骤1中所述酶混合液包括胶原酶i、透明质酸酶、胶原酶xi以及脱氧核糖核酸酶。

工作原理：利用流式细胞技术对细胞或亚细胞结构进行分析和分选，并在操作的整个过程中将组织浸泡在2％fcs中，并在冰面上完成整个操作过程，通过低温来保持细胞的活性，血管取出后迅速将脂肪及结缔组织剥离干净，避免脂肪对细胞的毒害作用，进一步提高细胞活性，将机械法和酶消化法结合，将水浴的温度控制在37℃，使得酶的活性处于活跃温度，并且加入胶原蛋白及透明质酸，dna酶，加速弹性组织及结缔组织的消化，节省时间。采用反复消化的方式解决血管组织在处理过程中容易黏连成团的问题，从而得到产率高、活性高及功能强的单细胞。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。