一株用于黄酒制曲的高糖化力、迟产孢子的米曲霉及应用的制作方法

本发明涉及一株用于黄酒制曲的高糖化力、迟产孢子的米曲霉及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

黄酒是我国的民族特产，其“用曲制酒、复式发酵”的酿造工艺是我国古代劳动人民智慧的结晶。“曲为酒之骨”，麦曲在黄酒酿造中起着十分重要的作用。黄酒酿造所用麦曲分为自然培养生麦曲和纯种培养熟麦曲，熟麦曲是在经过蒸煮灭菌的原料中接种优良糖化菌、采用通风培养法制成，具有糖化力高的优点，适应机械化黄酒生产要求，因此机械化黄酒生产中均需添加一定比例的熟麦曲。

黄酒制曲菌种要求糖化力强，目前黄酒行业的制曲菌种有米曲霉苏-16和米曲霉3800，其中苏-16是从自然培养的绍兴黄酒生麦块曲中筛选出的优良糖化菌，该菌株糖化力强、容易培养，且酿造的黄酒具有绍兴黄酒的风味特色，因此在黄酒行业得到普遍应用。然而，无论是米曲霉苏-16还是米曲霉3800，在制曲过程中都会产生大量孢子，给酿制的黄酒带来苦味，且装卸和投料铲曲时孢子飞扬，不利操作工人健康。因此，选育糖化力强且产孢子时间比苏-16和3800迟的新菌种，使制曲期内不产或少产孢子，大幅减少熟麦曲中的孢子量，提高麦曲品质，降低机械化黄酒苦味，是黄酒产业的现实需求。

近年来，有研究以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，选育出了比原出发菌株产孢子少且蛋白酶活力更高的菌株。但沪酿3.042为酱油生产菌株，蛋白酶活力高而糖化力低，不适用于黄酒制曲。以沪酿3.042制黄酒熟麦曲表明，熟麦曲糖化力不到350，而以苏-16制成的熟麦曲糖化力为900左右。迄今为止，尚未见有关产孢子迟的黄酒制曲用米曲霉的报道。

技术实现要素：

为了解决熟麦曲孢子多且产孢子早给黄酒带来苦味和孢子多有损操作工人健康等问题，本发明提供一株高糖化力、迟产孢子的制曲菌株sr-201，与苏-16和3800菌株相比，菌丝较长，斜面培养产孢子时间延迟1天；在纯种麦曲生产中，与苏-16相比，麦曲中孢子减少80％以上，且糖化力比苏-16提高15％以上。

本发明所述的米曲霉(aspergillusoryzae)菌株sr-201，已于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019225，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明提供的米曲霉sr-201在pda培养基上形成的菌落初始为白色，圆形，之后菌落中间开始逐步变成黄色，最后变为褐色至淡绿褐色，菌落背面无色，质地疏松；孢子在pda培养基上30℃萌发，生长快，培养3天菌落直径达到32～35mm，5天菌落直径达60～70mm，产孢子量与苏-16相当；sr-201菌株分生孢子头球状，密集，直径50～80μm，顶囊全部表面可育，分生孢子梗表面粗糙有刺突，单层瓶梗上串生4～6个分生孢子，分生孢子球形或近球形，孢子表面粗糙，直径一般2.0μm左右。

本发明的第二个目的是提供所述米曲霉sr-201在饮品酿造中的应用，所述饮品为黄酒或包含黄酒的饮料。

本发明的第三个目的是提供所述米曲霉sr-201的斜面菌种培养方法，所述培养方法为30℃培养5天，培养基为12～13°bx麦芽汁或米曲汁。

本发明的第四个目的是提供所述米曲霉sr-201制备得到的麦曲，所述麦曲为熟麦曲或生麦曲。

本发明的第五个目的是提供所述米曲霉sr-201制备得到的麦曲在黄酒酿造中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述米曲霉sr-201在黄酒酿造中的应用。

本发明的第七个目的是提供包含所述米曲霉sr-201的微生物菌剂。

本发明取得的有益技术效果

在12°bx麦芽汁斜面培养基上30℃下分别培养sr-201菌株、苏-16和3800菌株，本发明提供的米曲霉sr-201菌株与苏-16和3800菌株相比，菌丝相对较多，但是产孢时间延迟1天，即苏-16和3800菌株培养3天开始产孢子，5天孢子丛生丰满，而sr-201菌株4天开始产孢子，5天孢子丛生丰满；在载玻片上以pda培养基30℃下培养，48小时后sr-201开始产孢子，而苏-16在36小时已产大量孢子；在纯种麦曲生产中，与苏-16和3800菌株相比，由米曲霉sr-201制备得到的麦曲中孢子减少80％以上，且糖化力和淀粉酶活力分别比苏-16制备得到的麦曲提高约15％和13％，能够明显的降低熟麦曲孢子多给黄酒带来苦味并解决孢子多有损操作工人健康等问题。

生物材料保藏

米曲霉sr-201(aspergillusoryzaesr-201)，分类命名为：aspergillusoryzae，已于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019225，保藏地址为中国武汉武汉大学。

附图说明

图1米曲霉(aspergillusoryzae)菌株sr-201的孢子的电镜图。

图2本发明sr-201菌株和苏-16在载玻片上以pda培养基30℃下培养36小时、48小时产孢子情况，其中(a-1)和(a-2)分别为sr-201培养36小时和48小时产孢子情况，(b-1)和(b-2)为苏-16培养36小时和48小时产孢子情况。

图3本发明sr-201菌株和苏-16制备得到的熟麦曲的孢子数量的显微镜观察图片，其中，(a)为sr-201麦曲孢子，(b)为苏-16麦曲孢子。

具体实施方式

麦曲评价方法：

1.麦曲中孢子数测定方法：取5g的熟麦曲，加入100ml的水，浸提30min，每隔10min摇一次，用4层擦镜纸过滤，得到滤液，涡旋震荡30s，用血球计数板计数并显微拍照，并在600nm下测od值，因孢子呈黄绿色，孢子悬液中孢子多则od值高，反之则od值小。

2.麦曲糖化力测定方法：按赵光鳌编著《黄酒生产分析检验》中麦曲糖化力测定方法进行测定，糖化力为1g绝干麦曲在30℃糖化1小时所产生的葡萄糖的质量(mg)。

3、淀粉酶活力的测定方法：采用3，5-二硝基水杨酸(dns)法测定，在40℃条件下每分钟水解可溶性淀粉产生lmg麦芽糖，定义为1个淀粉酶活力单位。

实施例1

本发明所述sr-201菌株以从绍兴黄酒自然培养麦曲中筛选出的米曲霉再经诱变育种得到，选育方法如下：

(1)采样

选取不同车间和不同批次的优质自然培养生麦曲作分离米曲霉用；

(2)米曲霉的分离

将适量生麦曲放入试管中，加入无菌水稀释适当倍数，再用无菌吸管吸取1ml稀释液注入无菌培养皿中，然后倒入10～15ml灭菌冷却至45℃左右的培养基，迅速旋转培养皿，使混合均匀，等冷却凝固后，倒置，于30℃培养箱中培养3～4天，挑取单菌落，移植于麦芽汁斜面试管，在30℃下培养并于60小时后观察孢子生长情况，挑选未长孢子的菌株继续培养，4～5天后孢子丛生丰满时，取出保藏于冰箱备用；

其中，所述培养基为：13°bx糯米饭糖液，0.1％去氧胆酸钠，2％琼脂，121℃灭菌20min。在培养基中加入去氧胆酸钠可防止菌丝蔓延，以利于挑取菌落。

(3)初筛

经纯化后的米曲霉，用透明圈法进行初筛，用于黄酒制曲的米曲霉要求其糖化力高，因此初筛培养基以可溶性淀粉作为唯一碳源，淀粉被米曲分泌的糖化酶分解后，用稀碘液显色，菌落周围产生透明圈，淀粉分解越多，透明圈越大，表明该菌株产糖化酶能力越强；反之则越弱；由此可快速初筛出产糖化酶能力较强的米曲霉。

培养基为：可溶性淀粉4g，蛋白胨10g，nacl5g,牛肉膏3g，琼脂20g，水1000ml，ph7.2，121℃灭菌20min；将培养基配制好后，装于20×200mm试管中，每支管20ml，灭菌后倒入直径为9cm的培养皿中，使培养基厚度相等。平置凝固后，在培养皿中点植待测米曲霉孢子，于30℃下培养6天，把稀碘液倒于菌落周围，并测量透明圈大小，挑选出透明圈最大的菌株sr-20。

(4)诱变处理

①制备孢子悬液

将出发菌株米曲霉sr-20在麦芽汁斜面培养基上30℃恒温培养5天，用无菌生理盐水洗下孢子，经过无菌脱脂棉过滤后，振荡10分钟，获得均匀的孢子悬液；采用血细胞计数板，将孢子悬液浓度调整为10⁸个/ml；通过无菌操作，取5ml孢子悬液置于无菌小培养皿内。

②紫外诱变

除去培养皿的皿盖，将小培养皿放在磁力搅拌器上缓慢搅拌，采用30w、10分钟的紫外线诱变剂量进行诱变，将诱变后的孢子悬液做10倍系列稀释，选取合适浓度涂布在淀粉培养基平板上，以上操作在暗室中完成。

③避光培养

将上步骤涂布好的平板用黑色布袋妥善包扎，30℃恒温倒置培养5天。

④菌株筛选

在培养平板上加入适量碘液，观察淀粉培养基平板上存活菌株的透明圈形成情况，以出发菌株作为对照，根据透明圈大小和长孢子时间挑取正向突变菌株转接入麦芽汁斜面，经纯化后保藏。

⑤菌株复筛

将正向突变菌株在麦芽汁斜面上连续转接7代，以出发菌株作为对照进行制小型制曲试验并生产试验验证，获得稳定正向突变菌株米曲霉，编号为sr-201。分类命名：aspergillusoryzae，已于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019225，保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例2

对筛选的菌株sr-201按照《微生物分类学》进行生理特性鉴定，可知，本发明提供的米曲霉sr-201在pda培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml、自然ph)上形成的菌落初始为白色，圆形，之后菌落中间开始逐步变成黄色，最后变为褐色至淡绿褐色，菌落背面无色，质地疏松。孢子在pda培养基上30℃萌发，生长快，培养3天菌落直径达到32～35mm，5天菌落直径达60～70mm，产孢子量与苏-16相当；sr-201菌株分生孢子头球状，密集，直径50～80μm，顶囊全部表面可育，分生孢子梗表面粗糙有刺突，单层瓶梗上串生4～6个分生孢子，分生孢子球形或近球形，孢子表面粗糙，直径一般2.0μm左右。

图2为本发明的sr-201菌株和苏-16在载玻片上以pda培养基30℃下培养36小时、48小时产孢子情况，其中(a-1)和(a-2)分别为sr-201培养36小时和48小时产孢子情况，(b-1)和(b-2)为苏-16培养36小时和48小时产孢子情况，可见，本发明的sr-201菌株与苏-16和3800菌株相比，菌丝较长、产孢子时间明显延迟，sr-201在培养48小时后开始产孢子，而苏-16在36小时已产大量孢子。

实施例3

将本发明sr-201菌株的itsrdna序列如seqidno.1所示，在genbank中进行blast比对确定其种属，与其序列同源性最高的菌株为米曲霉(aspergillusoryzae)，相似度为99％。

实施例4

sr-201菌株采用斜面菌种培养方法，所述培养方法为30℃培养5天，培养基为12～13°bx麦芽汁或米曲汁。

将sr-201菌株制备成熟麦曲，种曲和熟麦曲按《黄酒酿造技术(第2版)》(谢广发，中国轻工业出版社出版，2016-09-01)书中所述熟麦曲制备方法制备。

按照同样的方法制备得到苏-16熟麦曲，对sr-201和苏-16熟麦曲进行麦曲评价，结果见表1、图3，可见，sr-201菌株制成的熟麦曲外观无明显黄绿色孢子，与现有技术使用苏-16制成的熟麦曲相比，孢子数减少80％以上(见图3)，糖化力提高了15％以上，sr-201菌株的淀粉酶活力为169.7u·g^-1干曲，比苏-16提高了13％。

可见，本发明的sr-201菌株制得的麦曲糖化力和淀粉酶活力明显提高，且孢子数量大幅减少，能够明显减少熟麦曲孢子多给黄酒带来苦味问题，避免了大量孢子的存在对操作工人健康的损害，较现有的米曲酶菌株更适合黄酒的生产。

表1本发明sr-201菌株和苏-16制备得到的熟麦曲的特性比较

实施例5

将实施例4制备得到熟麦曲用于机械化绍兴加饭酒酿造，制备得到的黄酒的苦味明显降低，经5名国家黄酒评酒委感官品评，得分均高于苏-16制成的熟麦曲酿制的黄酒。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>浙江树人学院（浙江树人大学）

<120>一株用于黄酒制曲的高糖化力、迟产孢子的米曲霉及应用

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