本发明涉及一种无血清培养体系及其在细胞培养肉中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
传统的细胞培养阶段都使用动物血清提供细胞贴壁、增殖和维持生长所需的营养成分和生物因子，由于批量使用的动物血清来源于自然生物体本身携带和采集加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，存在生物安全风险。此外，由于血清成份复杂、批间稳定性差、供应量受限和纯化难度高等因素，含血清培养体系无法实现大规模产业化应用。
无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长增殖的合成培养基，由于是人工合成成分明确，产品批间稳定，细胞培养的重复性高，同时也减少了由于使用动物血清所带来的内外源病毒、细菌和支原体等微生物污染的风险，且工业化生产保证供应充足，也有利于生物制品的下游纯化。
无血清培养基是化学组分限定的无血清培养基，这类培养基完全不含血清、无蛋白或蛋白含量极低的培养基。与传统的动物血清培养基相比，该类培养基具有无可比拟的优越性和安全性，其成分明确，且全部补充培养基成分均为化学或生物合成，降低无血清培养体系成本，应用于动物细胞培养肉生产过程，易于简化生物制品的纯化和下游加工流程。目前，无血清培养基有报道，但是一般应用于医学和药学领域，成本比较高，不适合大规模培养，因此，提供一种低成本、安全、适用于大规模产业化应用的无血清培养体系对于细胞培养有重要价值。
近年来，细胞培养人造肉(culturedmeat)因其来源可追溯，绿色安全，口感更接近传统肉类等特性引起了更为广泛的关注。科研人员通过提取可高效增殖的动物干细胞或组织并放入培养皿中繁殖，进而分化成肌肉组织的原始纤维。细胞培养肉在生产过程中不耗费饲料和水，不需要进行垃圾废物处理，在满足人类对肉类的需求同时也解决了传统养殖业带来的社会环境问题，包括无激素抗生素、环境可持续性、是否道德地对待动物等。细胞培养肉在营养、口感和风味方面更接近真实肉制品，是未来人造肉的主要研究发展方向，但是在理论与技术层面，特别是大规模肌肉细胞低成本获取与食品化等方面，还存在诸多挑战。大规模体外培养细胞面临着被微生物污染或受自身代谢物质影响的难题，因此，在进行体外细胞培养时，要及时清除细胞产生的代谢废物，为体外培养细胞提供无菌无毒的生存环境。传统的细胞培养阶段都使用动物血清提供细胞贴壁、增殖和分化所需的营养成分和生物因子，并且往往需要添加抗生素或抗有丝分裂剂，不能满足食品安全要求。因此，如何优化培养条件是实现安全、大规模体外动物细胞组织培养的重要影响因素。随着动物细胞无血清培养技术的发展，无血清培养在细胞生物学、药理学、肿瘤学和细胞工程领域已得到广泛的应用，但是仍然存在成本较高、安全性低的问题。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种无血清培养体系，所述培养体系包含基础培养基和外源添加补充成分，所述基础培养基含以下成分：nacl125～135mm，kcl2.0～4.0mm，d-葡萄糖4.0～6.0mm，nahco310～14mm，nah2po40.3～0.7mm，mgcl20.5～1.5mm，cacl21.0～3.0mm，盐酸丁二氨0.3～0.7mm；所含的外源添加补充成分含以下成分：细胞生长因子100～300mm，磷脂生长因子2.0～6.0mm，转铁蛋白0.08～1.02g/l，脂质0.3～0.7mg/l，氨基酸4～6g/l，生物素4～6mm，维生素b124～6mm，维生素b68～12mm，维生素c0.1～0.3mm。
在本发明的一种实施方式中，所述基础培养基含以下成分：nacl130mm，kcl3.0mm，d-葡萄糖5.0mm，nahco312mm，nah2po40.5mm，mgcl21.0mm，cacl22.0mm，盐酸丁二氨0.5mm；所含的外源添加补充成分含以下成分：细胞生长因子130mm，磷脂生长因子3.0mm，转铁蛋白0.1g/l，脂质0.5mg/l，氨基酸5g/l，生物素5mm，维生素b125mm，维生素b610mm，维生素c0.2mm。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞生长因子、脂质、氨基酸或维生素通过微生物发酵或全细胞转化方法产生。
本发明的第二个目的是提供上述无血清培养体系在培养动物干细胞、动物肌肉细胞或动物脂肪细胞中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述动物干细胞包括胚胎干细胞、成肌肉干细胞、间质干细胞或成脂肪干细胞。
在本发明的一种实施方式中，培养时细胞接种量为103-105个/ml无血清培养体系。
在本发明的一种实施方式中，所述培养是指在19-24℃下培养40-100h。
在本发明的一种实施方式中，所述培养是指在19-24℃下培养40-50h。
本发明的第三个目的是提供一种制备动物细胞培养肉的方法，是将动物干细胞接种到上述无血清培养体系中培养。
本发明的第四个目的是提供上述无血清培养体系在食品领域中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的无血清培养基是一种人工合成培养基，不需要外源动物血清的添加，所有外源添加成分均为化学合成或生物合成，成分明确，可有效避免动物血清在细胞培养过程中带来的污染。本发明提供用于培养动物干细胞的成分确定的无血清培养体系，特别是动物胚胎干细胞、肌肉干细胞等。此外，本发明还提供相应的动物细胞组织培养方法，包括在无血清培养体系中孵育干细胞和肌肉细胞分化，用于人造肉的生产。该方法可以有效降低传统含血清培养基在成本高等方面存在的问题。
具体实施方式
(一)外源添加补充成分的获得
细胞生长因子与磷脂生长因子的微生物重组表达：利用真核表达载体pgapzαa表达生长因子蛋白(gf)。从genebank上找到不同类型动物细胞生长因子、磷脂生长因子的全长基因序列作为目的基因。将目的基因和pgapzαa质粒连接转化，构建穿梭载体pgapzαa-gf，测序后将穿梭载体进行线性化，然后电转化入毕赤酵母gs115进行表达。将得到的蛋白进行亲和层析纯化，利用westernblot检测并分析gf蛋白的生物学活性。
牛转铁蛋白的微生物重组表达：以牛肝脏组织为试验材料，根据牛基因组中转铁蛋白序列设计引物，利用pcr技术克隆获得牛转铁蛋白基因编码区序列，并通过基因工程手段，构建牛转铁蛋白原核重组表达载体，在e.colibl21(de3)中异源表达并对其生物活性进行检测。
脂肪酸与氨基酸类的生物合成：以酿酒酵母为底盘细胞，通过对脂肪酸/氨基酸合成途径的整合和合成调控，实现由葡萄糖到脂肪酸、氨基酸的高效微生物合成，通过后续生物分离技术，获取高纯度脂肪酸和氨基酸成分，作为无血清培养体系的营养添加成分。
维生素c的生物合成：以氧化葡萄糖酸杆菌为底盘细胞，生物合成维生素c的前体2-酮基-l-古龙酸，通过一步化学催化，合成维生素c，作为无血清培养基的外源添加补充成分之一。
维生素b6与维生素b12为化学合成。
实施例1无血清培养体系成分
表1基础培养基
表2外源添加补充成分
无血清培养体系包括基础培养基(表1)和外源添加补充成分(表2)。
将1～5×104个的bhk21细胞(乳仓鼠肾细胞)接种于2ml无血清培养体系中，然后在19-24℃下无菌培养48h，以定量法计数细胞，评价无血清培养体系，结果如下：细胞形态饱满，稳定；可在所需生长周期内实现正常细胞生长数量。
基础培养基成分不变(见表1)，调整外源添加补充成分中不同成分的含量，设置a组、b组、c组、d组、e组培养体系培养bhk21细胞，不同组的细胞生长能力如表3所示。在19-24℃培养条件下，培养48h，a组细胞数量达6×105，b组细胞数量达3.6×105，c组细胞数量达6×105，d组细胞数量达3.9×105，e组细胞数量达6×105。
表3外源添加补充成分的优化
细胞相对生长能力：在19-24℃培养条件下，培养48h，将细胞生长数量最高的定义为100％，根据细胞数量计算与最高值的比例，计算细胞相对生长能力。
实施例2无血清培养体系在生产人造肉中的应用
本发明以添加外源合成细胞生长因子、磷脂生长因子、转铁蛋白、氨基酸、维生素等物质，与基本培养基复配，形成一种新型无血清培养基。该培养体系能使肌卫星细胞(肌肉干细胞)快速增殖。6-12小时换液一次，细胞在19-24℃条件下，培养48h。与dmem+5％新生牛血清培养基(gibcotmadvanceddmem，12491015)有相同效果。因此，本发明中的无血清培养基可以用来完全替代含血清培养基，可以低成本大规模培养不同动物细胞，并应用于动物细胞培养肉中。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。