一种自转录序列的检测方法与应用和鉴定方法及其应用与流程

本发明涉及基因组学技术领域，尤其是涉及一种自转录序列的检测方法与应用和鉴定方法及其应用。

背景技术：

人类基因组计划的完成，开启了对dna序列功能的全面深入研究。然而，对于人类基因组序列中高达98％的非编码dna而言，相关的功能研究进展缓慢，对于这部分基因组序列的功能认识严重缺乏。如何分析并确定基因组序列的功能是基因组学领域的重大问题，该问题的解决也将为合成生物学和其他实践应用打下扎实的基础。

真核基因组内重要的调控元件类型主要有增强子、沉默子、隔离子和启动子等，目前对增强子的研究最为全面，功能性鉴定的方法也较多。而其它如隔离子也发展出了具有一定相似性的鉴定方法。在上述的鉴定方法中，使用的都是插入片段的自转录文库，即将所要分析的dna片段插入启动子下游，由于插入片段影响启动子的转录活性，使得插入片段调节着自身的转录水平。插入片段下游有通用序列和polya加尾信号，所转录的rna通过使用和插入片段下游通用序列互补的反转录引物来获得第一条cdna链，再通过上游一致序列的引物来pcr扩增，获得插入片段的自转录信号。

从上述方法的设计思路可见，全面地获得所有自转录的mrna信号是重要的环节之一，自转录信号的获得程度直接影响所得结果的可靠性。一般地，转录后加工过程的加尾会使用插入片段下游的通用序列后的pa位点(多聚腺苷酸位点)形成相应的polya序列以稳定mrna，这种情况下，设计的反转录引物互补于通用序列，使其能够正常反转录从而获得相应的自转录信号。但实际情况是，相当比例的插入片段本身就会带有pa位点，而在这种情况下，转录后进行加尾时，polya无法加到原先预计的通用序列后的pa位点，而是会使用插入片段自带的加尾信号加到插入片段下游通用序列之前，这就导致现有方法中使用的反转录引物无法对这类插入片段的mrna进行反转录和相应的扩增。所以，这类检测方法在实际的检测过程中可能会丢失大量信息，进而使得到的结果的可靠性偏低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何提供一种能够减少信息丢失、提高可靠性的自转录dna序列的检测方法与应用和真核调控元件的鉴定方法及其应用。

根据本发明的第一个方面，本发明提供一种自转录序列的检测方法，根据本发明的实施例，该检测方法包括以下步骤：

构建报告载体，报告载体包括依次设置的启动子、orf序列和插入的dna片段；

将报告载体转录为mrna，并进行加尾；

使用反转录引物对mrna进行反转录以获得cdna；

反转录引物包括：5′-z-tm-xn-3′；其中，z为测序引物序列，x选自碱基a、t、c、g中的任一种，12≤m≤20，4≤n≤8，m、n为整数。

其中，dna片段包括但不仅限于动物源性的基因片段或是植物源性的基因片段，对于启动子而言，至少能够正常启动相应基因的转录过程。反转录引物5′-z-tm-xn-3′中，tm表示在引物的该位置有m个与腺嘌呤a互补的胸腺嘧啶t，xn表示在引物的该位置有n个任意独立选自a、t、c、g的随机碱基，对于测序引物序列z，具体可以根据不同测序平台的要求来选用相应的测序(扩增)引物。

本发明的有益效果在于：

针对于部分自转录报告载体的dna插入片段内含有pa位点以及部分自转录产物不使用报告载体插入片段下游的pa位点的情况，对传统的方法进行了改动。本发明采用新的反转录引物对转录过程中得到的mrna进行反转录，与现有技术相比，其除了能够转录在加尾过程中使用通用序列后的pa位点的mrna外，对于将polya序列加到插入片段自带pa位点的mrna也能够实现良好的转录，使该部分插入片段能够顺利反转录出cdna，保证检测过程的顺利进行，确保在整个检测过程中插入片段信息的完整传递，避免信息的大量丢失，从而提高检测结果的可靠性，有效克服漏检、误检的发生。

根据本发明的实施例，该检测方法还包括通过特异性引物对cdna进行至少两轮扩增。

本方案中采用的引物相比于现有技术在特异性上可能会有所不足，这可以通过使用上游引物针对特定的cdna序列进行两轮pcr扩增，从而获得特异性更强的自转录产物。

根据本发明的实施例，16≤m≤20，5≤n≤7。

根据本发明的实施例，报告载体以文库方式转入细胞内进行转录的表达。

根据本发明的实施例，orf序列和插入的dna片段之间还包括内含子序列。其可以是天然的内含子序列或是人工合成的内含子序列，该内含子序列在转染的细胞中被剪切。

根据本发明的第二个方面，本发明提供上述的检测方法在鉴定真核调控元件中的应用。

根据本发明的实施例，真核调控元件为增强子、隔离子、沉默子中的任一种。

根据本发明的第三个方面，本发明提供一种真核调控元件的鉴定方法，根据本发明的实施例，该鉴定方法包括上述的自转录dna的检测方法，插入的dna片段为真核调控元件的候选序列。

其中，真核调控元件包括但不仅限于具有调控基因转录起始与转录效率的顺式作用元件或其它转录调节元件。

根据本发明的实施例，真核调控元件的候选序列通过基因文库构建。

基因文库的构建方式可以参考现有方法制备，其包括但不仅限于采用如下方式：

抽提纯化基因组dna，超声打断并回收500-600bp大小范围的片段，修复后通过同源重组的方式克隆进入质粒载体。小批量转化大肠杆菌，在确定转化效率达到约10⁷-10⁸/μg(克隆数/质粒量)后进行大批量转化大肠杆菌，于液态培养基中增长到对数扩增前期收集细菌并抽提质粒。以少量质粒扩增插入片段区进行测序确定质粒库的复杂性和对基因组覆盖程度(超过85％或更高)。达到要求的质粒文库可以用来下一步实验。

根据本发明的实施例，真核调控元件为增强子、隔离子、沉默子中的任一种。

优选的，orf序列可以包括荧光蛋白基因、显色酶基因中的至少一种。

通过荧光或底物的显色反应，可以对候选序列是否具有相应的调控功能做出简单的初步判断。

根据本发明的第四个方面，本发明提供上述的鉴定方法在基因工程中的应用。根据本发明的实施例，该应用的非限制性实例可以是通过上述方法鉴定得到一系列经过功能性验证的包括但不仅限于转录调控元件的序列，将其构建为重组表达载体、重组工程菌、改良品种等，通过这些功能序列调整其中一个或多个基因的表达以使产物获得更优异的性状、产率产量等。

附图说明

图1是本发明的原理示意图。

图2是本发明的另一个实施例的对比实验的果蝇反转录信号的部分对比结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。

实施例1

以下结合图1对本发明的原理进行说明，图1是本发明的原理示意图。如图1所示：

(1)基因组dna经随机片段化后选择合适的大小并进行修复，并经处理得到插入片段的基因文库。按照启动子-orf序列-内含子(图中未示出)-插入的dna片段构建报告载体，其中，转弯箭头为启动子，插入的dna片段下游还有通用序列和pa位点。

(2)起始转录，如果插入的dna片段插入的真核调控元件的候选序列具有沉默子功能，其会抑制启动子的转录活性，导致转录出的rna的拷贝数下降，随后反转录的拷贝数与载体拷贝数之间没有正相关性。而如果不具有沉默子功能，转录出的rna拷贝数以及反转录的cdna拷贝数与载体的拷贝数正相关。由于真核调控元件候选序列会存在于转录出的rna内部，所以整个过程相当于自我转录并充当自己的序列标记，以此可以得知其中的一一对应关系。这其中，转染细胞，报告质粒的转录后加工过程中，可能会有两种加尾的可能性：一种是使用预期pa位点，具体是使用插入的dna片段下游的pa位点(即pasite)并将polya序列加在插入片段的下游通用序列(即图中插入片段后的黑色短片段)之后。而另外一种是一部分比例的插入片段带有pa位点(图中未示出)，这种情况其可以使用第一种pa位点，也可以使用插入片段自带的pa位点(即图中部分自转录dna片段中使用替代pa位点)，这种情况下，polya序列直接加在插入的dna片段后。

(3)纯化转录的mrna后，传统的方法使用的下游引物(rvprimer)互补于插入片段下游的通用序列，很显然，利用该引物做第一轮反转录只能转录第一种情况下加尾的mrna，而对于第二种情况下使用插入片段自带的pa位点加尾的mrna无法进行转录，这也就会造成大量信息的丢失，很大一部分可能的功能元件会被漏检或误检。而本发明设计的新的下游引物，其3′端是6个随机碱基和18个与腺嘌呤a相互补的胸腺嘧啶t，5′端为pcr扩增用的引物序列，利用该引物进行反转录，无论转录产物使用第一种还是第二种情况下的pa位点进行加尾都能够被反转录和扩增。反转录后，还包括通过特异性引物对cdna进行至少两轮扩增。本发明的反转录引物相比于现有技术在特异性上可能会有所不足，通过使用上游引物针对特定的cdna序列进行两轮pcr扩增加以完善，从而获得特异性更强的自转录产物。

实施例2

分别按照传统的以通用序列的互补序列作为反转录下游引物以及采用实施例1中的方法从3′端起为6个随机碱基和18个胸腺嘧啶t以及通用扩增引物序列构建的反转录下游引物按照常规的文库构建方法来构建果蝇基因组反转录文库，部分基因的反转录文库见图2。图2是本发明的另一个实施例的对比实验的果蝇反转录信号的部分对比结果。如图2所示，上方是传统方法测出的反转录信号，中间是以实施例1提供的方法测出的反转录信号，下方是以中间的信号减去上方的信号得出的信号强度差，横轴表示果蝇基因组不同的位点，纵轴表示对应位点的cdna的丰度。其中，中间的反转录信号区域内，方块用于示意相对于传统方法而言，采用实施例1中的方法后反转录信号的强度发生显著性改变的位点，即在这些位点，传统的方法由于前述原因加尾异常，使得反转录过程无法顺利进行，构建的反转录文库中对应的拷贝数减少，丰度(信号强度)发生明显的变化；而本方法则能够使这些加尾异常的位点正常反转录，反转录的信号表现出应有的强度，也就会比原有的方法明显能够检测到更强的信号，从而使整个检测过程中插入片段的信息能够完整地传递，避免了信息的大量丢失，提高了检测结果的可靠性。

以上是对本发明的较佳实施例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。