一种耐酸铝胁迫的转基因大豆及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种耐酸铝胁迫的转基因大豆及其应用。

背景技术：

土壤ph对作物生长十分重要，大多数农作物喜爱中性或者微酸性的土壤。但在酸性土壤中，作物的根系生长发育首先受到损伤，继而影响水分和矿质营养元素的吸收，最终导致作物品质和产量降低，经济效益下降。

世界范围内酸性土壤和铝毒害严重影响约30％的可耕地面积，是制约粮食生产的主要因素之一。在我国南方地区广泛分布的砖红壤、红壤、赤红壤等典型的酸性土壤，约有2千万公顷，严重制约了农作物的生产。

大豆是我国传统的农作物，是重要的粮食和经济作物。大豆种植范围广泛，按地域可以分为北方大豆种植区、黄淮海大豆种植区和南方大豆种植区。而我国南方大部分的土壤都属于酸性的红壤土，易发生铝毒害胁迫，导致作物生长发育迟缓，品质和产量降低等问题。

植物进化出了多种多样的耐酸铝胁迫机制，一般认为在酸性土壤中植物耐铝的生理学基础分为质体外排斥和质体内螯合。其中，植物相应非金属毒害这类非生物逆境胁迫时，涉及基因在转录水平和转录后水平的精确调控，主要有ap2/erebp、myb、bhlh和c2h2锌指结构转录因子家族。

stop(senstivetoprotonrhizotoxicity)是在蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)突变体中发现的c2h2锌指结构转录因子蛋白(其核苷酸序列如seqidno.1所示)。该蒺藜苜蓿stop基因(以下简称mtstop)的突变和功能丧失引起植物对酸铝胁迫很敏感，分析stop1蛋白氨基酸序列长度为499aa，包含4个c2h2锌指结构域。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种产生耐酸铝胁迫的转基因大豆。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种耐酸铝胁迫的转基因大豆，该转基因大豆利用农杆菌侵染介导的遗传转化而得，且转基因大豆基因组中整合有外源的锌指蛋白转录因子(mtstop)，锌指蛋白转录因子编码的氨基酸序列如seqidno.1所示。

作为优选，锌指蛋白转录因子从蒺藜苜蓿中分离获得。

本发明还包括上述转基因大豆在作物抗酸铝胁迫方面的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种耐酸铝胁迫的转基因大豆的产生和应用，对于培育耐酸铝植物品种，在南方酸铝土壤中提高农作物产量具有重要意义，并且为进一步开展作物抗酸铝胁迫研究奠定基础。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例经酸溶液处理和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组根系表型对照。

图1中标记：a-c：酸溶液处理下，mtstop和对照组(gfp)根系表型；d-f：酸铝溶液处理下，mtstop和对照组(gfp)根系表型。

图2是本发明实施例经酸溶液和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组发根中部分gmalmt基因的表达量。

图2中标记：gfph+表示经酸溶液处理的对照组；mtstoph+表示经酸溶液处理的mtstop组；gfpal3+表示经酸铝溶液处理的对照组；mtstopal3+表示经酸铝溶液处理的mtstop组。

图3是本发明实施例经酸溶液和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组发根中gmalmt1a、gmalmt1b、gmalmt3、gmalmt4a基因的表达量。

图3中标记：gfp表示不经任何处理的对照组；gfp(h+)表示经酸溶液处理的对照组；gfp(al3+)表示经酸铝溶液处理的对照组；mtstop表示不经任何处理的mtstop组；mtstop(h+)表示经酸溶液处理的mtstop组；mtstop(al3+)表示经酸铝溶液处理的mtstop组。

图4是本发明实施例经过酸溶液和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组发根中部分gmmate基因的表达量。

图4中标记：gfph+表示经酸溶液处理的对照组；mtstoph+表示经酸溶液处理的mtstop组；gfpal3+表示经酸铝溶液处理的对照组；mtstopal3+表示经酸铝溶液处理的mtstop组。

图5是本发明实施例经酸溶液和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组发根中gmmate13、gmmate47/87、gmmate79基因的表达量。

图5中标记：gfp表示不经任何处理的对照组；gfp(h+)表示经酸溶液处理的对照组；gfp(al3+)表示经酸铝溶液处理的对照组；mtstop表示不经任何处理的mtstop组；mtstop(h+)表示经酸溶液处理的mtstop组；mtstop(al3+)表示经酸铝溶液处理的mtstop组。

具体实施方式

本实施例通过异源过表达豆科模式作物蒺藜苜蓿的锌指转录因子(c2h2)基因，得到能显著提高酸铝耐受性的mtstop转基因大豆植株。

一、材料

1、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)：r108；大豆(g1ycinemax)：天隆一号(pi1578450，12w12)；

2、大肠杆菌：dh5α；发根农杆菌：k599；

3、载体：pgem-teasy、pdonr221、pb2gw7；

4、lb培养基：称取10g的nac1，5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，加入950ml去超纯水搅拌溶解，加水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌15min，即获得lb液体培养基，lb固体培养基为在lb液体培养基中加入15g的琼脂粉即可。

5、氨苄青霉素母液(amp+，50mg/ml)：称取0.5g氨苄青霉素amp，溶于10ml灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；卡那霉素母液(kan+，50mg/ml)：称取0.5g卡那霉素kan，溶于10ml灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；大观霉素母液(spec+，50mg/ml)：称取0.5g大观霉素spec，溶于10ml灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存。

6、酸处理溶液(ph＝4.0)：使用1m盐酸溶液调节无菌水ph＝4.0即可；酸铝处理溶液：称取26.67galcl3粉末，加入950ml无菌水溶液，调节ph＝4.0，再定容至1l即可。

二、mtstop的克隆、过表达载体、k599工程菌株及mtstop转基因大豆植株的构建，具体步骤如下：

1、根据mtstop基因的核苷酸序列，设计特异性引物。

如seqidno.2所示的mtstop基因的核苷酸序列：

如seqidno.3和seqidno.4所示的特异性引物的核苷酸序列：

mtstop-f：cacgatgtcttaccctaaccca

mtstop-r：ctagctacgacgaaatcccaaaac

2、按照植物总rna提取试剂盒和m-mlvcdna合成试剂盒说明书，提取蒺藜苜蓿野生型r108的总rna，并反转录为cdna。

3、以反转录的cdna为模板，用上述引物进行扩增，扩增程序为98℃预变性10s，98℃变性10s，57℃退火温度30s，68℃延伸1min，35个循环，68℃继续延伸5min，获得的pcr产物置于4℃保存。

4、将pcr产物利用pcr纯化试剂盒纯化，并连接到pgem-teasy后转化dh5α，进行菌落pcr验证，获得阳性菌落，提取菌落质粒，获得含有mtstop基因的t载体，同时将菌液送至测序公司进行测序。

5、设计带有attb接头序列的特异性引物，其引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示：

f：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttccacgatgtcttaccctaaccca

r：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctagctacgacgaaatcccaaaac

以步骤4得到的且测序正确的单克隆菌落质粒为模板，以步骤3方法进行pcr扩增，以步骤4方法纯化pcr产物，置于-20℃保存。

6、利用gateway克隆技术，加入1μ1经步骤5得到的pcr产物，与其质量相当的pdonr221中间载体，最后加入1μlbpclonasemix，室温过夜后转化dh5α，按步骤4的操作方法进行验证阳性克隆。

7、提取测序正确的步骤6得到的阳性克隆的质粒，取1μl质粒并加入等量pb2gw7过表达载体，最后加入1μllrclonasemix，室温过夜后转化dh5α，按步骤4的操作进行验证阳性克隆，提取质粒。

8、按k599发根农杆菌感受态转化说明书所记载的方法，转化步骤7得到的pb2gw7-mtstop过表达质粒，利用菌落pcr验证阳性克隆。

9、大豆幼苗下胚轴农杆菌转化法：

(1)将植物营养土与蛭石以3：1混合均匀，121℃高温高压灭菌40min，待其冷却后以少量无菌水伴匀平铺于盆中备用。大豆种子表面消毒后，播于事先备好的方盆中，覆膜后置于光照培养室(16h光照，8h黑暗，23℃)中萌发备用。

(2)挑选k599菌株接种于5mllb培养基(培养基中含相应抗生素)，28℃过夜振荡培养，待od600＝1.0左右，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌水重悬至od600＝0.2左右。

(3)选取生长良好，子叶刚要展开的大豆幼苗，选取下胚轴距离根系1-2cm处，用一次性注射器轻轻将菌液注入下胚轴内部，可围绕幼茎一周注射2-4处，保证菌液侵染充分。将幼苗移至装有1/3体积土壤的花盆中，覆盖薄膜使伤口处于温热湿润的环境中，利用伤口处愈伤产生及后续发根的生长，置于光照培养室培养。

(4)约2周后可在伤口处长出发根，无明显的向地性，此时可除去薄膜，用蓬松湿润的土壤覆盖至花盆的4/5，置于光照培养室继续生长，继续生长2周即可获得耐酸铝胁迫的mtstop转基因大豆植株。

三、逆境胁迫处理

将gfp及过表达mtstop转基因大豆植株，分别用酸溶液和铝溶液处理，一周后处理第二次，于光照培养室培养1月统计表型，并测定相关生理指标。

四、mtstop转基因大豆植株的生理指标测定方法

1、株高测定：

随机取实验处理mtstop转基因大豆植株(三次重复)，测量子叶节点与主茎生长点之间的高度。

植株株高测量结果见表1。

2、相对含水量测定：

随机取实验处理mtstop转基因大豆植株的根系和三出复叶(三次重复)，称量其鲜重(fw)，之后将其放入盛水的培养皿中，浸泡24h，用吸水纸擦干其表面水分，称量其饱和鲜重(sfw)，之后将所有样品放入烘箱中，105℃处理30min，再80℃烘干24h，待样品冷却至室温之后称其干重(dw)，并按下式分别计算根系和叶片的相对含水量(％)：rwc％＝(fw-dw)/(sfw-dw)x100％。根系含水量测量结果见表2，叶片含水量测量结果见表3。

3、铝离子含量测定：

取mtstop转基因大豆样品，在研钵(提前预冷)中加入液氮充分研磨，称取0.1g样品，分别加3ml优级纯硝酸和1ml优级纯高氯酸，放在加热板上加热，待大量白烟出现时，将样品从加热板上取下，冷却至室温，加去离子水定容至10ml，再用0.22μm有机相滤膜过滤，使用电感耦合等离子体光谱仪(icp)检测。

铝离子含量测量结果见表4。

4、柠檬酸含量测定：

取液氮研磨的样品粉末，加入0.5ml的1.25m盐酸-甲醇溶液在50℃下将有机酸甲基化8小时。将样品在氮气下干燥并加入100μl吡啶溶液。使用与5973msd偶联的agilent6890gc定量有机酸，设定进样量为1μl，进样口温度设定为280℃，分流比为15∶1，载气为氦气，流速设置为1ml/min。gc程序为80℃2min，以5℃/min升温至315℃，并保持12min。质谱仪设置为j接口温度280℃，质谱源230℃，扫描质范围为50-550m/z。

柠檬酸含量测量结果见表5。

四、结果

以下是如seqidno.1所示mtstop基因编码的氨基酸序列：

在图1中，(a)～(c)为酸溶液处理下mtstop和对照组根系表型，(d)～(f)为酸铝溶液处理下mtstop和对照组根系表型。从图1中(a)～(f)可以看到，在铝胁迫条件下，mtstop过表达植株株高明显高于gfp对照植株，生长发育并未受到太多胁迫，且下胚轴侵染处的转基因发根和主根的根系发达，颜色洁白；对照组根系死亡衰老严重，仅剩受损的主根和少许侧根，根系呈褐色。

以下的5个表是mtstop组和对照组分别经过酸溶液处理和酸铝溶液处理后的测量数据，表中的gfp为对照组，mtstop为实验组。

表1是分别经酸溶液处理和酸铝溶液处理后，mtstop转基因大豆植株高度(cm)测量结果。

表1：植株高度测量结果数据单位：cm

表2是分别经酸溶液处理和酸铝溶液处理后，mtstop转基因大豆植株根系含水率(％)测量结果。

表2：根系含水量测量结果数据单位：％

表3是分别经酸溶液处理和酸铝溶液处理后，mtstop转基因大豆植株叶片含水率(％)的测量结果。

表3：叶片含水量测量结果数据单位：％

表4是分别经酸溶液处理和酸铝溶液处理后，mtstop转基因大豆植株和对照组发根中铝离子含量(ng/g)测定结果。

表4：铝离子含量测定结果数据单位：ng/g

表5是分别经酸溶液处理和酸铝溶液处理后，mtstop转基因大豆植株和对照组发根中柠檬酸含量(μg/g)测定。

表5：柠檬酸含量测定数据单位：μg/g

从表1～表5的测量结果发现，对mtstop转基因大豆植株的生理性状测定发现，mtstop转基因大豆植株株高显著高于对照组，且根系含水量和叶片含水量均显著高于gfp对照组，根系内积累的铝离子含量极显著高于gfp对照组；同时，mtstop转基因大豆植株的根系含水量的和叶片含水量在两种处理条件下均显著高于gfp对照。mtstop转基因大豆植株根系在两种处理条件下，根系内积累的铝离子含量均显著低于gfp对照。mtstop转基因大豆植株根系中的柠檬酸含量均极显著高于gfp对照。

表6是经酸溶液和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组(gfp)发根中脱落酸(aba)、生长素(iaa)、水杨酸(sa)和茉莉酸(jaile)含量(ng/g)测定结果。

表6：脱落酸、生长素、水杨酸和茉莉酸含量测定结果数据单位：ng/g

表6的结果表明，经酸溶液处理后，mtstop组中发根中脱落酸(aba)、生长素(iaa)、水杨酸(sa)含量均大于对照组(gfp)发根中含量。mtstop组中发根中茉莉酸(jaile)含量与对照组(gfp)发根中含量相似。

经酸铝溶液处理后，mtstop组中发根中脱落酸(aba)高于对照组(gfp)发根中含量，水杨酸(sa)和茉莉酸(jaile)与对照组(gfp)发根中含量相似，生长素(iaa)含量低于对照组(gfp)发根中含量。

图2表明，经酸溶液处理后，mtstop组中gmalmt6b、gmalmt6a、gmalmt2、gmalmt5a、gmalmt5b基因表达量升高；经酸铝溶液处理后，mtstop组中gmalmt4b、gmalmt1b、gmalmt6b、gmalmt6a基因表达量升高。

图3表明，经酸溶液和酸铝溶液处理后，mtstop和对照组发根中gmalmt1a、gmalmt1b、gmalmt3、gmalmt4a基因的表达量。特别是gmalmt1a/b在gfp发根中能显著被铝诱导上调表达，而在mtstop发根中的表达量在不同处理条件下均低于gfp对照组。

图4表明，在铝胁迫条件下，gmmate13，gmmate15和gmmate75在mtstop发根中的表达水平显著高于gfp对照；而gmmate47和gmmate101的表达低于gfp对照组。

图5表明，gmmate13能被酸铝诱导上调表达，又可以被mtstop显著上调表达；gmmate47/87在gfp发根中表现为被酸铝诱导下调表达，而在正常条件下mtstop抑制gmmate47/87的表达，但在酸铝胁迫处理后，能被mtstop激活表达；gmmate79基因在gfp发根中能被酸铝诱导上调表达，但在mtstop发根中的表达水平被下调。

综上所述，mtstop蛋白及其编码基因mtstop与植物耐酸铝相关，能显著提高提高植物的耐酸性和耐铝性。本实施例利用农杆菌侵染向大豆中导入mtstop基因而得到mtstop转基因大豆植株，对于培育耐酸铝植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种耐酸铝胁迫的转基因大豆及其应用

<130>no

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>333

<212>prt

<213>蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)

<400>1

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151015

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<210>2

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<212>dna

<213>蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)

<400>2

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acccagatacttcaaccacaacaaaatccaagtaacacccccgaccctcaggttccgctt120

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ttgaaatcggtgatttgtgtgaagacccatttcaagaggagtcattgtccgaagatgtat660

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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