胃腺癌分子标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及胃腺癌分子标志物及其应用，具体的涉及胃腺癌分子标志物rp11-366l20.2和rp4-724e16.2及其应用。

背景技术：

胃癌是消化系统肿瘤中发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，全球范围内，胃癌发病率位居第四位，胃癌相关死亡人数在癌症相关死亡中位居第三位(siegelrl,millerkd,ahmedinjemaldvmphd.cancerstatistics,2017[j].cacancerjclin,2017,67(1).)，是一种全球性的重大疾病负担。对于我国而言，胃癌是一个比较突出的公共卫生问题。我国男性胃癌发病率位于肺癌之后排在第二位，我国女性中，胃癌发病率仅低于乳腺癌、肺癌，居第三位，在整体的癌症发病率和癌症死因顺位中，胃癌均为我国第二高的恶性肿瘤(chenw,zhengr,baadepd,etal.cancerstatisticsinchina,2015[j].cacancerjclin,2016,66:115-132.)。尽管胃癌的手术治疗方式在不断完善，但我们面临的现状是我国多数胃癌患者确诊时已经处于进展期，五年生存率显著低于早期胃癌，深入研究胃癌发病机制，以发病机制为基础寻找胃癌标记物是提高胃癌早期诊断的重要途径。另外，虽然可供选择的化疗药物在不断增加，免疫疗法、基因治疗等技术手段在不断更新，但总体来说这些治疗方法对患者生存期的提高效果并不显著，需要我们通过加强对胃癌发生、发展分子机制的研究，并从中筛选潜在的理想的诊断和治疗靶点。

长链非编码rna(longnon-codingrnas,1ncrnas)是不编码蛋白质的长链rna。长度上，1ncrnas区别于我们熟知的短链rna，比如trnas,mirnas,核仁小分子rna(snornas)等，通常大于200个核苷酸；与编码蛋白的mrnas不同，1ncrnas不含开放读码框(orf)。lncrnas在真核生物中广泛存在，数量上多于蛋白编码基因，且得益于深度更深、覆盖度更宽的rna测序、不断更新的生物信息学技术，1ncrnas的发现在不断增加(clarkmb,mercertr,bussottig,etal.quantitativegeneprofilingoflongnoncodingrnaswithtargetedrnasequencing[j].natmethods,2015,12(4):339.)。多数1ncrnas的产生与mrnas相同，由rna聚合酶ii转录，通常具有5’帽子结构和3’端多聚a尾。

lncrnas可以作为不同细胞状态、不同生理病理阶段的标记物(wangkc,changhy.molecularmechanismsoflongnoncodingrnas[j].molcell,2011,43(6):904-914.)。大量研究揭示1ncrnas在肿瘤中存在差异性表达，1ncrnas对肿瘤的诊断、分型、预后评估、药物反应等方面具有重大价值。目前，lncrna在胃癌发生、发展中的具体作用与主从关系还不清楚，研究与胃腺癌相关的lncrna，对于胃腺癌的诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供可用于胃腺癌早期诊断的分子标志物，通过检测分子标志物的水平，可以判断受试者是否患有胃腺癌，从而为胃腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。

“分子标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“分子标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码dna和rna)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了用于检测分子标志物的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，所述分子标志物为rp11-366l20.2或rp4-724e16.2。

“rp11-366l20.2”位于12号染色体上，基因号为ensg00000197301，包括rp11-366l20.2基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的rp11-366l20.2，以及源自细胞中加工的任何形式的rp11-366l20.2。该术语涵盖rp11-366l20.2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。目前rp11-366l20.2存在四个转录本，转录本id分别为enst00000356215.2、enst00000439236.2、enst00000504038.2、enst00000536648.1。一种代表性的rp11-366l20.2的序列如enst00000356215.2所示。

“rp4-724e16.2”位于20号染色体上，基因号为ensg00000197670，包括rp4-724e16.2基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的rp4-724e16.2，以及源自细胞中加工的任何形式的rp4-724e16.2。该术语涵盖rp4-724e16.2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的rp4-724e16.2的序列如enst00000424252.1所示。

进一步，所述试剂为特异性结合rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的试剂。

进一步，所述特异性结合rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的试剂为特异性结合rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的核酸。

进一步，所述特异性结合rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的核酸选自：

特异性扩增rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的引物；

特异性识别rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的探针；或

特异性分析rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的芯片。

本文所用的“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如dna聚合酶并在合适温度和ph下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于rna、dna、蛋白、抗体、和有机分子。作为一种优选的实施方式，用作探针的分子包括rna、dna。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

许多表达检测方法使用分离的rna。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总rna。如果rna的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品中提取rna。

本文所用的“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是dna、rna或其中的任何排列。

上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pna、lna、ena、gna、tna等人工核酸置换得到的多核苷酸。

进一步，特异性扩增rp11-366l20.2引物序列如seqidno.1～2所示，特异性扩增rp4-724e16.2的引物序列如seqidno.3～4所示。

本发明提供了一种诊断胃腺癌的产品，所述产品包括检测rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的试剂。

进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。

进一步，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的探针。具体地，可根据本发明所述的lncrna，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

进一步，所述试剂盒包括：

特异性扩增rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的引物；

特异性识别rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的探针；或

特异性分析rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的芯片

进一步，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂、显色剂或指示剂、核酸分析软件或使用说明书。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了rp11-366l20.2或rp4-724e16.2基因的表达水平与胃腺癌相关，通过检测受试者样本中rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的表达水平，可以判断受试者是否患有胃腺癌，以及患胃腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，同时采用分子标志物进行诊断，相比传统诊断手段，更及时、更灵敏、更特异。

附图说明

图1是利用qpcr检测分子标志物在胃腺癌组织中的表达情况图；其中图a是rp11-366l20.2，图b是rp4-724e16.2。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1qpcr检测rp11-366l20.2或rp4-724e16.2在胃腺癌中的表达

1、收集的33例胃腺癌患者癌组织样本和相对应的癌旁组织样本，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，qpcr检测样本中rp11-366l20.2和rp4-724e16.2的表达水平。

2、rna提取

使用天根公司的动物组织总rna提取试剂盒(目录号为dp431)进行总rna的提取。

1)匀浆处理

每10-20mg组织加300μl裂解液rl，用研磨杵将组织彻底研磨；随后向匀浆液中加入590μlrnase-freeddh2o和10μlproteinasek，混匀后56℃处理10-20min。

2)12,000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。

3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5)向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室温放置15min。

6)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

8)重复步骤7)。

9)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱cr3转入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到rna溶液。

11)检测rna的完整性和纯度。

3、qpcr

根据rp11-366l20.2、rp4-724e16.2和gadph的基因序列设计引物，引物序列如下：

rp11-366l20.2：

正向引物：5′-agtgttcgtcctgttcat-3′(seqidno.1)

反向引物：5′-attgttcttcctctgtcattac-3′(seqidno.2)

rp4-724e16.2：

正向引物：5′-ctatgtgataaaggaagatg-3′(seqidno.3)

反向引物：5′-cttgacctgtatgtgtaa-3′(seqidno.4)

gapdh：

正向引物：5′-aatcccatcaccatcttccag-3′(seqidno.5)

反向引物：5′-gagccccagccttctccat-3′(seqidno.6)

使用天根公司的quant一步法反转录-荧光定量试剂盒(sybrgreen)试剂盒(目录号：ng105)进行pcr反应，反应体系和反应条件如表1所示。

在thermalcyclerrealtimesystem扩增仪上进行pcr扩增，反应结束后确认realtimepcr的扩增曲线和溶解曲线，δδct法进行相对定量。

表1qpcr反应体系和反应条件

4、结果

qpcr结果如图1所示，与癌旁组织相比，rp11-366l20.2和rp4-724e16.2在胃腺癌组织中均表达上调，rp11-366l20.2上调约7.83倍，rp4-724e16.2上调约2.93倍，差异具有统计学意义(p<0.05)，提示可通过检测rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的水平判断受试者是否患有胃腺癌。

根据rp11-366l20.2或rp4-724e16.2与胃腺癌之间的关系，可以设计靶向rp11-366l20.2或rp4-724e16.2的干扰rna、shrna治疗胃腺癌。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>济南市中心医院

<120>胃腺癌分子标志物及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agtgttcgtcctgttcat18

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

attgttcttcctctgtcattac22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctatgtgataaaggaagatg20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cttgacctgtatgtgtaa18

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aatcccatcaccatcttccag21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gagccccagccttctccat19