一种葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及光动力治疗药物技术领域，更具体地，涉及一种葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂及其制备方法和应用。

背景技术：

随着环境污染和人口老龄化问题加重，癌症已经成为威胁人类健康的重大疾病。2015年我国癌症新发病例及死亡人数预估分别为429.2万例和281.4万人。根据世界卫生组织的估计，2020年全球新增癌症病例将达到2000万，至少1200万人死于癌症，而其中70％的病例将出现在发展中国家。

光动力治疗被认为是继肿瘤手术治疗、放疗、化疗和生物疗法之后的第5种癌症治疗方法，具有肿瘤选择性高、毒副作用小、创伤小等优点，是一种非侵入性的肿瘤疗法。光动力治疗通过特定波长的光激发聚集在肿瘤部位的光敏剂，通过光致电子转移途径产生氧自由基(i型)或者能量转移途径产生单线态氧(ii型)，造成细胞内生物分子氧化损伤，导致肿瘤微血管损伤和肿瘤细胞死亡。光动力治疗还能诱导局部免疫反应，激活人体免疫功能，减少肿瘤复发。氧气是光动力治疗的重要影响因素，单线态氧强氧化性使得ii型光敏剂研究得到广泛关注，但其具有很强的氧气依赖性，对厌氧肿瘤细胞疗效不明显。最近有研究指出，i型光敏剂的光催化过程对氧气依赖程度低于ii型光敏剂，可用于提高厌氧肿瘤细胞的光治疗效果，但由于催化体系自身的复杂性，对光催化治疗的原理和厌氧抗肿瘤机制仍然缺少深入的研究。

光动力疗法的治疗效果与所使用的光敏剂是有很大关系的，其光动力活性、光吸收特性和靶向特性决定了其临床可用性和适用范围。临床用到的光敏剂需满足以下条件：(1)能准确靶向于肿瘤部位；(2)对肿瘤的暗毒性低，而光毒性强；(3)选用的激发光源最好是近红外光或双光子光源，因为这些长波长光源具有较深的组织穿透力，同时可避免高能量的光照射损伤正常组织。目前研究优良光敏剂用于肿瘤的光动力治疗正是临床所需。目前临床光动力治疗主要使用含有环状四吡咯骨架的有机光敏剂，存在水溶性差、肿瘤细胞的选择性不高、易光漂白、稳定性差等缺点，限制了光动力疗法的临床应用，因此亟需开发新一代的光敏剂。

金属配合物由于具有突出的光学性质和强的细胞摄取能力，在细胞器染料、荧光成像和光动力治疗等研究领域获得了极大的关注。与有机化合物相比，金属配合物分子结构具有更好的可塑性，容易在配体上引入其它分子活性基团，可以针对不同的底物结合环境进行相应的结构修饰；而且金属配合物相对比较稳定，容易在体内环境产生药效。金属铱配合物具有发光量子产率高、大的stocks位移和发光寿命长、发射峰较窄等特点。可以通过对配体的修饰，调节铱配合物的发射波长、发光强度、发光量子产率；由于铱配合物的这些优点已经被广泛研究，有望作为新型高效的光敏剂。专利cn201611181323.0、cn201710396909.7、201710902346.4、cn201810342098.7等均公开了用于肿瘤光动力治疗的金属铱配合物光敏剂，但目前，用于肿瘤光动力治疗的铱配合物光敏剂依然有限，且大部分铱配合物细胞暗毒性较大；因此还需要进一步制备更多的对肿瘤的暗毒性低，而光毒性强，可用于肿瘤光动力治疗的铱配合物光敏剂，以供临床选择。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)是活细胞中一种重要的辅酶，在生物介质中能被氧化，并伴随着很高的更新换代频率。若在癌细胞中选择性的引起nadh的氧化消耗可能可影响癌细胞内的氧化还原平衡，从而抑制或杀死肿瘤细胞。但是目前还未见有针对nadh有光催化氧化作用的i型金属化铱配合物光敏剂的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂；所述光敏剂应用于肺癌(a549和h460细胞)以及结肠癌(hct116细胞)的光动力治疗具有很高的疗效，对人正常肝细胞(lo2细胞)几乎没有暗毒性，且表现出明显的肿瘤靶向性。该光敏剂还能对nadh有光催化氧化作用，产生双氧水杀伤肿瘤细胞，对于研究高效低毒的肿瘤治疗药物具有重要的意义。

本发明的另一目的在于提供所述葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂，所述配合物为具有式(i)所示结构的化合物，简记为[ir(1pq)2ptg]cl；

本发明提供了一种新型的肿瘤靶向葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂，所述光敏剂具有容易合成的葡萄糖修饰配体，可以利用肿瘤细胞摄取葡糖糖显著高于正常细胞的特点，达到靶向肿瘤细胞的目的。所述光敏剂在黑暗情况下，对肿瘤细胞和正常细胞均没有毒性，但是在光照条件下对肿瘤细胞具有很强的生长抑制能力，且对nadh有光催化氧化作用，对于研究高效低毒的抗肿瘤药物有重要的意义，为临床开发新型的金属抗肿瘤药物奠定实验和理论基础。

本发明还提供所述葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂的制备方法，包括如下步骤：

s1.将2-乙炔基吡啶、叠氮化钠、硫酸铜、溴代四乙酰基葡萄糖和抗坏血酸钠在dmf/水混合溶液中室温搅拌发生“click”反应，然后在生成的反应溶液中加入乙二胺四乙酸二钠溶液析出白色ptgoac配体；其反应方程式如下所示：

s2.将三氯化铱(iii)与1-苯基异喹啉(1pq)在乙二醇乙醚/水中加热回流得黄色固体，为铱(iii)μ-氯-桥连二聚体；其反应方程式如下所示：

s3.将步骤s2得到的铱(iii)μ-氯-桥连二聚体配合物与步骤s1的ptgoac配体在二氯甲烷/甲醇中加热回流获得[ir(1pq)2ptgoac]cl中间产物；其反应方程式如下所示：

s4.将步骤s3得到的[ir(1pq)2ptgoac]cl中间产物与甲醇钠在甲醇中反应得黄色溶液，再经酸性树脂中和后得到式(i)所示环金属化铱(iii)配合物；其反应方程式如下所示：

优选地，步骤s1所述反应为20～30℃搅拌反应15～25小时。

优选地，步骤s1所述2-乙炔基吡啶与叠氮化钠、硫酸铜、溴代四乙酰基葡萄糖和抗坏血酸钠的比例为2:3:1:2:2。

优选地，步骤s2所述氯化铱(iii)与1-苯基异喹啉的摩尔比为1:2。

优选地，步骤s2所述回流反应为110～115℃反应26～28小时。

更优选地，步骤s2所述回流反应时间为27小时，反应温度为110℃。

优选地，步骤s3所述铱(iii)μ-氯-桥连二聚体配合物与ptgoac的摩尔比为1:2～2.5。

优选地，步骤s3所述回流反应为45～55℃反应8～10小时。

更优选地，步骤s3所述回流反应为50℃反应8小时。

具体地，步骤s4所述[ir(1pq)2ptg]cl配合物由[ir(1pq)2ptgoac]cl与甲醇钠和酸性树脂在无水甲醇中室温搅拌发生水解反应制得。

优选地，步骤s4所述[ir(1pq)2ptgoac]cl、甲醇钠与酸性树脂的摩尔比为1:5:10。

优选地，所述水解反应为室温搅拌(20～30℃)反应为1～2小时。

本发明式(i)所示的葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂在无光照情况下，对人肺癌细胞a549和h460，人结肠癌细胞hct116以及人正常肝细胞lo2没有毒性(ic50>50μm)，但是在光照条件下对肿瘤细胞具有很强的生长抑制能力(ic50＝0.08～0.13μm)，表明本发明的光敏剂跟现有的大部分铱配合物光敏剂不同，具有暗毒性低而光毒性强的优点，对于研究高效低毒的抗肿瘤药物具有重要的意义。

因此本发明还请求保护式(i)所示的葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为肺癌和/或结肠癌。

更优选地，肺癌为a549和/或h460细胞，结肠癌为hct116细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本专利提供了一种葡萄糖修饰的环金属化铱光敏剂，所述光敏剂为具有式(i)所示结构的化合物；该光敏剂在黑暗情况下对肿瘤细胞和正常细胞均没有毒性，但是在光照条件下对肿瘤细胞具有很强的生长抑制能力，且对nadh有光催化氧化作用，对于研究高效低毒的抗肿瘤药物具有重要的意义，可进一步制备抗肿瘤药物，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明ptgoac配体的化学结构式。

图2为本发明的环金属化铱(iii)配合物光敏剂的化学结构式。

图3为本发明ptgoac配体的合成途径。

图4为本发明环金属化铱(iii)配合物光敏剂合成途径。

图5为本发明环金属化铱(iii)配合物光敏剂光催化氧化nadh的能力与产生过氧化氢的能力检测。

图6为本发明环金属化铱(iii)配合物光敏剂对人肺癌和结肠癌细胞的暗毒性与光毒性。

图7为本发明环金属化铱(iii)配合物光敏剂对人正常肝细胞的暗毒性。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1配体和配合物的制备方法

1、配体ptgoac的合成方法

(1)2-乙炔基吡啶(0.103g,1.0mmol)与叠氮化钠(0.100g,1.5mmol)、五水硫酸铜(0.125g,0.5mmol)、溴代四乙酰基葡萄糖(0.410g,1mmol)和抗坏血酸钠(0.198g,1.0mmol)在二甲基乙酰胺/水(15ml,4:1，v/v)中25℃搅拌20小时。反应结束后，往悬浮液中加入氨水/edta(100ml)，配体用二氯甲烷(100ml)萃取。用水(100ml)、饱和氯化钠溶液(100ml)分别洗涤有机相，无水mgso4干燥，减压除去溶剂，粗产品用乙醇重结晶得到0.252g白色固体，产率86.8％。；上述化学反应方程式如下所示：

质谱：477.3,[m+h]⁺，499.3,[m+na]⁺；

核磁氢谱：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.60(d,1h),8.40(s,1h),8.14(d,j＝7.9,1h),7.82–7.73(t,1h),7.27–7.19(m,1h),5.92(d,1h),5.54–5.40(m,2h),5.26(t,1h),4.31(dd,1h),4.15(dd,1h,),4.02(dd,1h),2.09(s,3h),2.07(s,3h,),2.03(s,3h),1.89(s,3h).

2、铱配合物的合成方法

(1)三氯化铱(ⅲ)(0.151g,0.428mmol)和1-苯基异喹啉(0.175.5g,0.856mmol)的混合物在乙二醇乙醚/水(12ml，3:1，v/v)中加热至110℃，在氮气环境下反应27小时后将反应降至室温，析出物过滤用乙醇和水洗涤，在真空中干燥后得到黄色固体铱(ⅲ)μ-氯-桥连二聚体配合物(0.163g)，产率60％。上述化学反应方程式如下所示：

(2)桥连前体(0.127g,0.107mmol)和ptgoac配体(0.107g,0.214mmol)在二氯甲烷/甲醇(12ml,3:1，v/v)在氮气环境加热到50℃，反应8小时。将反应得到的溶液旋干，将获得的粗产物经中性氧化铝柱(溶剂：甲醇/二氯甲烷＝1/4，v/v)纯化，旋干溶剂得到黄色粉末状产品(0.091g,0.083mmol)，产率75％。上述化学反应方程式如下所示：

(3)将步骤(2)反应得到的乙酰化铱配合物(0.091g,0.083mmol)溶于无水甲醇中(40ml)中，然后加入甲醇钠(0.006g,0.11mmol)，室温搅拌2小时。然在无水甲醇中加入酸性树脂(0.5g)，室温搅拌2小时，过滤以除去树脂，减压旋干溶剂，得到橙黄色配合物(0.072g,0.079mmol)，产率95％。通过核磁和质谱表征，简记为[ir(1pq)2ptg]cl；上述化学反应方程式如下所示：

质谱：909.0[m-cl]⁺；

核磁氢谱：¹hnmr(400mhz,meod)δ9.04(d,2h),8.57(s,4h),8.46–8.23(m,3h),8.13(t,1h),8.01(s,2h),7.90–7.83(m,3h),7.81(d,1h),7.63(d,1h),7.56(dd,1h),7.51(dd,1h),7.47(dd,1h),7.43(t,1h),7.15(t,1h),7.06(t,1h),6.91(t,1h),6.78(t,1h),6.32(dd,2h),5.71(dd,1h),3.93–3.35(m,10h).

具体地，所述金属铱(iii)配合物合成途径如图4所示。

将上述方法获得的金属铱配合物进一步进行以下实验。

实施例2铱配合物光催化氧化nadh的能力

在光照条件下，金属配合物具有很高的氧化还原电位，能将还原型辅酶i(nadh)氧化成其氧化态(nad⁺)。将含铱配合物(浓度：5μm)和nadh(a339nm＝1.0)的发光石英试管放在465纳米光源下，每5分钟扫描一次紫外-可见光谱，检测溶液的吸光度。如图5所示，表明所述铱配合物对nadh有光催化氧化能力。

实施例3铱配合物光照后产生过氧化氢的能力

使用双氧水试纸检测在465nm波长灯下光照30分钟(光密度:11.7j/cm²)和在黑暗中30分钟的铱配合物溶液(浓度：5μm)。双氧水试纸检测显示光照后有过氧化氢产生，未光照样品没有过氧化氢产生。如图5所示，铱配合物产生活性氧的机制是i型机制，通过光照后被激发产生过氧化氢，杀死肿瘤细胞。

实施例4铱配合物应用于肺肿瘤细胞的光动力治疗

利用mtt比色法来分析铱配合物对人肺癌细胞(a549和h460)和人肝正常细胞(lo2)的抗增殖效应。噻唑蓝(mtt)，是一种四唑盐，在活细胞中，线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将mtt还原，生成一种蓝紫色沉淀-甲臜，加入dmso溶解，可用590纳米处的吸光度来分析细胞增殖情况。

1、mtt实验步骤如下：

(1)先复苏1管细胞，用新鲜完全培养基(rpmi-1640培养基+10％胎牛血清+1％盘尼西林和链霉素)培养，传代2次后使用。

(2)待细胞到达对数生长期时，以5000个/孔的细胞密度接种至2块96孔板中(每孔用100μl培养液培养细胞，一板为光照组，另一板为黑暗对照组)，送入细胞培养箱(310k，5％co2/95％)中培养。

(3)待细胞贴壁后(约24小时)，每孔加入100μl含有200、100、25、10、1、0.5、0.1、0.01μm共8个浓度的配合物铱配合物的新鲜培养液，轻轻晃匀，在恒温箱中避光孵育。

(4)孵育16h后，将光照组的细胞培养板置于465nm波长蓝光灯下光照30min(光剂量：11.7j/cm²)，然后放回培养箱继续避光孵育22h(黑暗对照组的细胞一直置于温箱中避光培养。

(5)孵育44h后，在每孔中加入10μlmtt(5mg/ml)，于37℃温箱中继续孵育4h后，吸去上清液，每孔加150μl二甲基亚砜(dmso)，用酶联免疫检测仪检测590纳米处的吸光度，计算细胞增殖抑制率，求出ic50值(抑制率等于50％的时候的药物浓度)。

2、结果

如图6所示，mtt法检测不同浓度的铱配合物在黑暗与光照处理条件下对人肺癌细胞(a549和h460)以及结肠癌细胞(hct116)的杀伤作用效果不同，在无光照情况下，配合物几乎不表现出细胞毒性(ic50>50μm)，但是在光照条件下对人肿瘤细胞株具有很强的生长抑制能力(ic50＝0.08～0.13μm)。

如图7所示，mtt法检测不同浓度的铱配合物在黑暗处理条件下对人肝正常细胞(lo2)没有毒性(ic50>50μm)。

同时，将金属铱配合物光敏剂通过静脉注射给药到分别患有肺癌细胞(a549和h460)以及结肠癌细胞的小鼠模型中，另外设置相同条件下仅注射生理盐水的对照组。结果发现，在等待一段时间后光敏剂会聚集到病灶上，表明所述光敏剂具有肿瘤靶向性；然后用适当波长的光对病变组织进行照射，富集在病灶中的光敏剂在光激发下发生光敏反应，发现静脉注射光敏剂的肿瘤小鼠模型与静脉注射生理盐水的肿瘤小鼠模型对照相比，其体内的肿瘤明显变小，表明所述金属铱配合物对肿瘤细胞具有很强的生长抑制能力。

上述结果表明，本发明制备得到的金属铱配合物光敏剂具有非常低的暗毒性但在光照条件下具有很强的光毒性，且能对nadh有光催化氧化作用，对于研究高效低毒的i型铱配合物光敏剂有重要的意义，为临床开发新型的抗肿瘤药物奠定实验和理论基础。