一株多环芳烃降解菌Q3及其用途的制作方法

本发明涉及微生物工程领域，尤其涉及一株降解多环芳烃污染物的降解菌q3及其用途。

背景技术：

多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbons，pahs）是指由两个或两个以上苯环以稠环形式相连的化合物，是一类广泛存在于环境中的具有致癌、致畸、致突变性的持久性有机污染物。其具有高毒性、热稳定性、生物富集性、疏水性、不易降解等特点且在环境中普遍存在。国内外对多环芳烃的污染已经展开大量研究。

pahs污染环境的主要修复方法包括物理修复法、化学修复法及生物修复法。物理修复法、化学修复法均具有处理速度快、治理成本高、对污染体系破坏性大等特点，仅适用于高浓度点源污染的快速处理。生物修复法适用于低浓度、大面积污染点的治理，是目前多环芳烃污染修复的主要方法。其中微生物修复技术具有费用低、二次污染少、修复彻底、可进行原位修复等优点，是一类越来越受青睐，低耗高效的生物修复技术。

近年来，国内外对降解低分子量pahs的微生物进行了广泛的研究，但对于高分子量pahs降解菌的研究较少。事实上，污染环境中的多环芳烃均以混合形式存在，其中每种多环芳烃之间会相互影响，从而增加了微生物降解的难度。低环pahs一般可以作为菌株生长的唯一碳源和能源而被直接降解，高环多环芳烃因结构更复杂，生物可利用性低而较难被降解。因此筛选能降解多种高环pahs的微生物具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种降解多环芳烃污染物的降解菌q3。

为实现上述目的，本发明提供一株降解多环芳烃污染物的降解菌q3，其特征在于，所述菌株为rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌，保藏号为cgmccno.16446。

进一步，所述q3的16srdna序列如seqidno:1所示。

进一步，所述多环芳烃为含有菲、芘、苯并蒽、屈、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝中的至少一种多环芳烃。优选地，所述多环芳烃芘的浓度可达200mgl^-1，

另一方面还保护，所述q3去除或降解土壤、水环境中的多环芳烃的应用。

进一步，所述土壤、水环境中有多种高环多环芳烃复合污染。

菌株16srdna测序序列如seqidno:1所示，alkb基因序列如seqidno:2所示。

所述菌株保藏信息：

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称cgmcc；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2018年9月10日；

保藏编号：cgmccno.16446；

保藏菌株分类命名为：rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌；

本发明所述rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌q3的最适生长ph值为7-9之间，ph值为7时菌株生长最好；最适生长温度在30-37℃之间，温度为37℃时菌株生长最好；最适生长盐度为0.1%-3%之间，测试盐度中1%时菌株生长最好，且该菌株具有一定程度的耐碱性和耐盐性。

本发明所述q3菌株具有降解菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并蒽、屈、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝九种pahs的能力，且可降解初始浓度为200mgl^-1的高浓度芘，8天降解率为28%。同时该菌株对初始浓度为50mgl^-1的菲和苯并[a]芘8天降解率分别可达98%和65%；对初始浓度为10mgl^-1的二苯并[a,h]蒽16天降解率可达82%。

该菌株对菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽复合污染仍具有良好修复效果，对四种pahs总量（160mgl^-1）8天降解率可达27%。同时该菌株对土壤pahs也有较好的修复效果。培养24天后对土壤pahs总量（255.47mgkg^-1）降解率为47%。

附图说明

图1是rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌q3生长于lb平板形态图。

图2是不同ph值下q3菌株的生长曲线图。

图3是不同温度下q3菌株的生长曲线图。

图4是不同盐度下q3菌株的生长曲线图。

图5是rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌q3菌株系统发育树图。

图6是rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌q3菌株对不同初始浓度的芘的耐受性能图。

图7是rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌q3对初始浓度为50mgl^-1的菲、50mgl^-1苯并[a]芘、50mgl^-1芘、10mgl^-1苯并[b]荧蒽混合pahs的降解率效果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例所用培养基配方为：

所述rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌的lb培养基成份为：胰蛋白胨10gl^-1，酵母提取物5gl^-1，氯化钠10gl^-1。

所述lb培养基固体平板成份为：胰蛋白胨10gl^-1，酵母提取物5gl^-1，氯化钠10gl^-1，15gl^-1纯化琼脂粉。

无机盐培养基(msm)成分：kh2po45.5g、k2hpo46.0g、kcl2.0g、mgso4·7h2o0.2g、na2so42.0g、微量金属盐1.0ml(mnso439.9mg，znso4·h2o42.8mg，(nh4)moo2·4h2o34.7mg，蒸馏水1000ml)、蒸馏水1000ml、ph7.0。所述无机盐固体培养基的成份为：上述无机盐培养基成份，15gl^-1纯化琼脂粉。

实施例1：菌株的筛选与分离

以北京焦化厂pahs污染土壤为菌源，称取10g土壤，加入90ml无菌水在180rmin^-1，37℃摇床中震荡3h，静置30min后，取上清液5ml接种到含芘50mgl^-1己灭菌的45ml无机盐培养液中，37℃，180rmin^-1摇床培养。每隔10天转接5ml培养液于45ml芘浓度梯度呈100、200、300、500mgl^-1递增的新鲜灭菌无机盐培养液，经过5次转接完成pahs降解菌的富集。取100ul最后一次富集培养液涂布于无机盐固体平板后，平板倒扣于装有芘的烧杯中，采用升华法在无机盐固体平板铺上一层芘膜。涂有芘膜的平板置于37℃恒湿培养箱中培养，培养期间多次观察，挑选出现透明圈的菌落，在lb固体培养基中经多次平板划线分离得到纯菌株q3（见图1）。

将对数期（od600为0.6）菌液按10%的体积比例接种于nacl重量含量为1%的lb培养基中，lb培养基初始ph值分别设置为5，6，7，8，9。不同处理组在180rmin^-1，37℃摇床中振荡培养，探究菌株q3最适生长ph。连续取样测定菌液od600变化，od600吸光度值增长最快的处理组即为q3生长最适ph。

将对数期（od600为0.6）菌液按10%的体积比例接种于ph=7的lb培养液中，lb培养液nacl重量含量分别设置为0.1%，0.5%，1%，2%，3%，5%。不同处理组在180rmin^-1，37℃摇床中振荡培养，探究菌株q3最适生长盐度。接种q3后连续取样测定菌液od600变化，od600增长最为快速的处理即为最适合q3生长的盐度。

将对数期（od600为0.6）菌液按10%的体积比例接种于ph=7，nacl重量含量为1%的lb培养液中，分别设置摇床温度为25℃,30℃,37℃，40℃于180rmin^-1下振荡培养，探究q3生长最适温度。连续取样测定菌液od600变化，od600增长最为快速的处理即为最适合q3生长的温度。

通过测定不同ph值、温度及盐度培养过程中菌液od600的吸光度值变化，绘制了不同条件下菌株的生长曲线（图2-4）。实验结果表明q3最适生长ph值为7-9之间，ph值为7时菌株生长最好；最适生长温度在30-37℃之间，温度为37℃时菌株生长最好；最适生长盐度为0.1%-3%之间，盐度为1%时菌株生长最好，且该菌株具有一定程度的耐碱性和耐盐性。

2018年7月送交中国科学院微生物研究所进行鉴定，2018年9月10日完成鉴定，中国科学院微生物研究所根据送检菌种的细胞形态，生理生化特征，16srdna基因序列，alkb基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》以及internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology有关研究论文，将纯菌株q3鉴定为rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌。其细胞形态和理化试验结果见表1。

表1菌株q3生理生化特性

注:“+”表示反应为阳性或不敏感，“-”表示反应为阴性或敏感。

菌株16srdna测序序列如seqidno:1所示；alkb基因序列如seqidno:2所示。

seqidno:1序列为：acacatgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgcactctgggataagcctgggaaactgggtctaataccggatatgacctcttgctgcatggtgaggggtggaaagtttttcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggacgaagcgcaagtgacggtacctgcagaagaagcaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtcgtctgtgaaatcccgcagctcaactgcgggcttgcaggcgatacgggcagactcgagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgtgggtttccttccacgggatccgtgccgtagccaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatgtaccggacgactgcagagatgtggtttcccttgtggccggtagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcacgtgatggtggggactcgcaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggtcggtacagagggctgcgataccgtgaggtggagcgaatcccttaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaacccctcgtgggagggagccgtcgaagg

seqidno:2序列为：tcgcgtcgctggtcttcgcctgctacctctggtcggccgagaatctgtcctggctcggcatcgacggcgggctcggcgtgatgtcgaagatcggtctcgcgatctcggtcggcgtggtcgcgggcatcggtatcaacacggcgcacgaactcggccacaagaaggtcgaattcgaacggcgactgtcgaagtgggcgctcgccccgtcgttctacgggcacttctacatcgagcacaatcgcggtcaccacgtgcgggtcgccacccccgaggacccggcctcggcccggttcggggagagcttctggcgatttctgccccgcagcgtcgtcggcagcctgcggtcggcgtggcgcctcgaacgagcccgcctcgaacggctcgacaagccggtgtggagcgtgcacaacgacgtcctcaacgcgtgggcgatctccgttgcgctgtacgcggtgctcctcggcgtcttcggcctgtcgatcgcgccgtacctcgtgatccaggcggtcttcgggttctcgttgctcgaggtcgtgaactatctcgagcactacggtctgctgcggcagaagaccgcgaaggggcgctacgagcgctgctcgcccgc

rhodococcusrhodochrous玫瑰色红球菌q3菌株系统发育树图见图5。

实施例2：菌株对芘的降解

将实施例1所得的q3(rhodococcusrhodochrous）分别接种至lb培养基至对数期，离心后弃上清液，加入20ml无菌水洗涤2次，再次离心后弃去上清液，收获菌体，将其菌悬液在600纳米的吸光度值（od600)均调整为1.0。将所得的纯菌种的菌悬液接种（接种量为10%）于含芘的无机盐液体培养基中，使芘初始含量分别为25、50、100、200mgl^-1，每个样品4个重复，同时设置对照组。于37℃，180r/min摇床中培养8天后分别测定残余芘浓度，计算降解率，其结果见图6。

结果表明，菌株q3能够去除体系中的芘，且对芘有耐受性，当底物芘浓度高达200mgl^-1时，芘降解率短时间内也可达到28%。

实施例3：菌株对pahs的降解

如实施例2所述，制备q3菌悬液，将所得的菌悬液接种（接种量为10%）于含菲、芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘的无机盐液体培养基中，培养基中菲、芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘的初始浓度分别为50mgl^-1、50mgl^-1、10mgl^-1、50mgl^-1，每个样品4个重复，同时设置对照组，于37℃，180r/min摇床中培养8天后，测定残余菲、芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘浓度，计算降解率。降解率如图7所示。

按照上述实验步骤验证菌株q3对于菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并蒽、屈、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝多环芳烃单体的降解能力，降解率如表2所示。

表2菌株q3的降解广谱性分析

pahs测定过程如下：将摇瓶中的整瓶样品进行残留多环芳烃提取，加入相应量的替代物十氟联苯，然后以萃取剂样品比为3:10的体积比例向溶液中加入正己烷，三角瓶置于180rpm，37℃摇床中振荡提取30min。通过梨形分液漏斗分离有机相和水相，每个样品重复上述过程提取3次，收集合并所有的萃取液，合并的萃取液用旋转蒸发仪浓缩，甲醇定容至1ml，过0.22um滤膜待hplc测定。测定仪器为日立l-2000高效液相色谱仪，采用多环芳烃专用液相色谱分析柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇/水（90：10），流速为1mlmin^-1，检测波长254nm，柱温35℃，进样体积10ul。

菌株对多环芳烃的降解率采用公式（1）计算。

（1）

式中:n为降解率(%)，a为对照组样品中多环芳烃含量;b为实验组样品中多环芳烃的剩余含量。

菌株q3对菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并蒽、屈、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝九种pahs均有降解效果。该菌株对初始浓度为50mgl^-1的菲和苯并[a]芘8天降解率分别可达98%和65%；对初始浓度为10mgl^-1的二苯并[a,h]蒽16天降解率可达82%。该菌株对菲、芘、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽复合污染仍具有良好修复效果，对四种pahs总量（160mgl^-1）8天降解率可达27%。

实施例4菌株修复pahs污染土壤

供试土壤采自北京某废弃焦化厂0-20cm表层土，混合均匀后自然风干，过2mm筛，经测定该土壤样品中16种pahs均有检出（见表3，总量为255.47mgkg^-1），用灭菌锅灭菌30min后备用。本实验按实施例2的方法制备菌株种子液，将菌株种子液按照与土壤重量比为10%的比例，接种于该灭菌土壤中，土壤含水率保持为10%，培养24天后，测定pahs降解率。

表3土壤样品中16种pahs的浓度统计表

土壤pahs含量检测步骤如下所述：称取土样0.5g，无水硫酸钠2.0g，将土样与无水硫酸钠置于100ml烧杯中混和均匀后倒入ase萃取池中，加入25μl(40mg·l^-1)的5种氘代物混合液作为替代物，再向萃取池中加入2.0g无水硫酸钠，然后盖紧萃取池盖子置于ase350中萃取，萃取溶剂采用二氯甲烷：丙酮（1:1）的混合溶剂。萃取液在39℃水浴锅中完成浓缩与溶剂替换，溶剂替换为正己烷，过硅胶-氧化铝净化柱净化后，氮吹至1ml装入至色谱瓶，用gc-ms测定。

实验结果表明，培养24天后，菌株q3对土壤pahs总量（255.47mgkg^-1）降解率为47%。表明该菌株对土壤pahs有较好的修复效果。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110>中国科学院城市环境研究所

中国科学院大学

<120>一株多环芳烃降解菌q3及其用途

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1402

<212>dna

<213>玫瑰色红球菌(rhodococcusrhodochrous)

<400>1

acacatgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtga60

gtaacacgtgggtgatctgccctgcactctgggataagcctgggaaactgggtctaatac120

cggatatgacctcttgctgcatggtgaggggtggaaagtttttcggtgcaggatgagccc180

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gtgggagggagccgtcgaaggv1402

<210>2

<211>607

<212>dna

<213>玫瑰色红球菌(rhodococcusrhodochrous)

<400>2

tcgcgtcgctggtcttcgcctgctacctctggtcggccgagaatctgtcctggctcggca60

tcgacggcgggctcggcgtgatgtcgaagatcggtctcgcgatctcggtcggcgtggtcg120

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cgcccgc607