一种引导PD1基因切割实现外源序列高效整合的sgRNA的制作方法

文档序号:23675654发布日期:2021-01-23 07:46阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种针对细胞内pd1基因进行基因编辑的方法,其特征在于,所述方法包括利用核酸酶和sgrna引入细胞、对pd1基因进行基因编辑的步骤,所述sgrna引导核酸酶对pd1基因进行切割并形成断裂位点;所述sgrna靶向pd1的靶向序列包含seq id no.1-6中任一所示的序列;优选的,所述sgrna靶向pd1的靶向序列包含seq id no.4和/或seq id no.5所示的序列。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、cpf1中的一种或任意几种;优选的,所述核酸酶为cas9;更优选的,所述cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的cas9。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述sgrna还包括碱基的化学修饰;优选的,所述化学修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。4.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于,所述方法还包括提供供体修复模板以及将供体修复模板引入细胞的步骤;优选的,所述供体修复模板包括嵌合抗原受体(car)。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述car包括结合到特异性靶抗原的细胞外结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域。6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述细胞外结构域靶向的抗原选自以下一种或任意几种:α叶酸受体、5t4、αvβ6整联蛋白、bcma、b7-h3、b7-h6、caix、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd138、cd171、cea、cspg4、egfr、包含erbb2(her2)的egfr家族、egfrviii、egp2、egp40、epcam、epha2、epcam、fap、胎儿achr、frα、gd2、gd3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、hla-a1+mage1、hla-a2+mage1、hla-a3+mage1、hla-a1+ny-eso-1、hla-a2+ny-eso-1、hla-a3+ny-eso-1、il-11rα、il-13rα2、lambda、lewis-y、kappa、间皮素、muc1、muc16、ncam、nkg2d配体、ny-eso-1、prame、psca、psma、ror1、ssx、存活蛋白、tag72、tem、vegfr2以及wt-1;优选的,所述跨膜结构域选自以下任意一个或任意几个跨膜区:t细胞受体的α或β链、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154;更优选的,所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域;更优选的,所述初级信号传导结构域包括fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b或cd66d中的一种或任意几种;更优选的,所述共刺激信号传导结构域选自tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c、slp76、trim或zap70中的一种或任意几种。7.根据权利要求1-6任一所述的方法,其特征在于,所述细胞为t细胞。8.根据权利要求1-7任一所述的方法,其特征在于,所述将核酸酶、sgrna或供体修复模板引入细胞的方式包括:载体转化、转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射;优选的,
采用电穿孔的方式;更优选的,将核酸酶和sgrna形成复合物,或者将核酸酶、sgrna和供体修复模板形成复合物,再将复合物通过电穿孔的方式引入到细胞中。9.权利要求1-8任一所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。10.权利要求9所述的细胞在制备肿瘤免疫治疗或癌症免疫治疗产品中的应用。11.一种对细胞内pd1基因进行基因编辑的sgrna,其特征在于,所述sgrna靶向pd1的靶向序列包含seq id no.1-6中任一所示的序列;优选的,所述sgrna靶向pd1的靶向序列包含seq id no.4和/或seq id no.5所示的序列。12.根据权利要求11所述的sgrna,其特征在于,所述sgrna还包括碱基的化学修饰;优选的,所述化学修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。13.权利要求11或12所述的sgrna对细胞内pd1基因进行基因编辑的应用。
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