本发明属于珍珠粉技术领域，特别涉及一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法。
背景技术：
珍珠是珍珠贝类和珠母贝类软体动物体内分泌作用而生成的含碳酸钙的矿物珠粒，由大量微小的文石晶体集合而成。珍珠粉既是一种用于装饰的珍宝，又是一种宝贵的中药材和化妆品。我国明朝著名医学家李时珍在《本草纲目》中记载:“珍珠主治：镇心。点目，去肤黯障膜。涂面，令人润泽好颜色；涂手足，去皮肤逆肿。”珍珠粉由无机成分与有机成分结合而成，其中有机成分主要是蛋白质。蛋白质是由肽组成的，而肽又是由氨基酸组成的。氨基酸一共有22种，其中有一部分是含硫氨基酸(saa)，主要包括肤氨酸、半肌氨酸和蛋氨酸。这些氨基酸对于人体皮肤及皮肤衍生物(指甲、毛发)有着不可或缺的作用。珍珠中的主要蛋白为角蛋白。水解珍珠蛋白可产生小分子活性肽。
目前对于珍珠功效成分的开发应用相对停留在较为固定的工艺模式中，利用传统水提、酸提及酶解等方法。如公开号为cn101381400的中国专利文献公开了一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，是取纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液，经杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kda的第一珍珠有机基质萃取物及分子量小于5kda的第二珍珠有机基质萃取物；进一步以硫酸铵沉淀法分离出珍珠蛋白与无法沉淀出的蛋白质，并以sephadexg25凝胶依照蛋白质分子量进行层析，得到三个级分：级分a，级分b，级分c。使化妆品、食品等产业，可以由此获得有效成分被纯化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，提取出来的小分子活性肽具有高活性和针对性，对酪氨酸酶抑制率高，具有美白功效。
本发明提供如下技术方案：
一种利用复合酶从珍珠粉中提取小分子活性肽的方法，包括以下步骤：
(1)将珍珠粉加入到酸溶液中进行酸解，收集上清液和第一不溶性蛋白；对第一不溶性蛋白进行水冲泡后离心得到第二上清液和第二不溶性蛋白；合并第一上清液和第二上清液；
(2)对合并后的第一上清液和第二上清液进行真空热浓缩析出乳酸钙，过滤后与第二不溶性蛋白混合，匀浆制成匀浆液；
(3)使用复合蛋白酶液对匀浆液在弱酸性条件下进行酶解，得到酶解液，所述复合蛋白酶液包括胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液；
(4)对酶解液进行脱色和灭菌，制成液体或粉末形态的小分子活性肽。
在步骤(1)中，将不溶性蛋白在4℃保存。
在步骤(1)中，所述珍珠粉为普通珍珠粉、超细珍珠粉或纳米级珍珠粉。在步骤(1)中，所述酸溶液选自盐酸、醋酸、乳酸或醋酸/醋酸钠溶液。
优选的，在步骤(1)中，所述珍珠粉为纳米级珍珠粉，所述酸溶液为乳酸。珍珠粉粒度越细，壳角蛋白(不溶性蛋白)的提取率越高；在相同酸浓度下，以乳酸对壳角蛋白的提取率最高。因此，在上述珍珠粉粒径和酸溶液条件下壳角蛋白的提取率最高。
在步骤(1)中，所述上清液包括可溶性蛋白和乳酸钙，不溶性蛋白中夹杂有水溶性蛋白和沉淀的乳酸钙。在步骤(2)中，所述匀浆液包括水溶性蛋白和不溶性蛋白组成的总蛋白。
在步骤(2)中，所述匀浆液中总蛋白的浓度为1-3mg/ml。由于珍珠粉粒径和酸的种类不同，可以得到不同浓度匀浆液。
在步骤(3)中，所述复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的质量比为0.5-3:8-12:2-6。
所述复合蛋白酶液通过分别配制胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液后，再进行混合而得到。其中，胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液分别通过将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或角蛋白酶加入到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行配制，再按比例混合得到复合蛋白酶液。
优选的，在步骤(3)中，所述复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1-2:10-11:3-4。上述质量比的复合蛋白酶液酶解得到的小分子活性肽对酪氨酸酶的抑制率更高，美白功效更好。
优选的，在步骤(3)中，所述复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的总质量为匀浆液中总蛋白的质量的1-3％。
在步骤(3)中，所述酶解的温度为45-60℃，酶解的时间为12-24h。
在步骤(3)中，所述小分子活性肽的分子量小于1000da。
本发明通过复合酶提取小分子活性肽，可以减少酶的用量，提取到的小分子活性肽具有高活性和针对性，对酪氨酸酶抑制率高，具有较好的美白功效。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
在本发明中，复合蛋白酶液通过分别配制胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液后，再进行混合而得到。其中，胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液分别通过将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或角蛋白酶加入到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行配制，再按比例混合得到复合蛋白酶液。其中，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶都通过市场购买获得，生产厂家为国药集团化学试剂有限公司。
胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液和角蛋白酶液的浓度为0.5mg/ml、5.0mg/ml和3.0mg/ml，制备方法为：将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或角蛋白酶加入到1m的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.6))，加热至55℃，待酶完全溶解后，冷却至室温，离心，取上清液，4℃保存，得到胰蛋白酶液、木瓜蛋白酶液或角蛋白酶液。按比例混合三种酶液，得到复合蛋白酶液，4℃保存。
对本发明制备的小分子活性肽进行以下美白活性验证和抗氧化功效验证：
美白活性验证-方法1：
利用体外酪氨酸酶抑制法通过分光光度计测定加入美白剂前后溶液在475nm处吸光度来计算美白剂对酪氨酸酶的抑制率，通过熊果苷的阳性对照来评价本发明制备的小分子活性肽的美白功效。
在样品组、标准对照组和阳性对照组分别投入ph6.8、0.05mol/l缓冲液pbs(nah2po4-na2hpo4缓冲液)、150u/ml酶溶液(0.05nnah2po4-na2hpo4缓冲液溶解)、2％(质量分数)熊果苷溶液、小分子活性肽。于37℃水浴中反应10min后，加入0.3％l-酪氨酸溶液，再于37℃中水浴反应30min，测475nm处吸光度。
表1相对熊果苷抑制率测定溶液组成/ml
样品对酪氨酸酶活性的抑制强度以相对熊果苷抑制率表示，按(1)式计算：
抑制率/％＝(a1－as)/(a1－ac)·100(1)
公式中：a1、ac和as分别为阳性对照、标准对照和样品的吸光度值，抑制率高表明其对酶活性抑制强度高。
美白活性验证-方法2：
按表2进行小分子活性肽对酪氨酸酶活性抑制率试验。
表2美白试验测试溶液组成/ml
按表2同时配制4组测试样品液，放入25℃水浴反应3.5h后，转移至3ml的比色皿中，于475nm处测吸光度，按(2)式计算对酪氨酸酶的抑制率：
其中，a1为空白组吸光度值；a2为反应体系自身的吸光度值；
a3为待测样吸光度值；a4为待测样在反应体系中自身吸光度值。
实施例1
(1)脱钙：珍珠粉称重，按1g珍珠粉(纳米级珍珠粉)：12ml乳酸(2mol/l)的比例缓慢加入乳酸溶液，边加边搅拌，酸解至无气泡产生，离心，分别收集上清液和不溶性蛋白。纯水冲泡不溶性蛋白并再次离心、倒出上清液、合并上清液，不溶性蛋白4℃保存。
(2)打浆：合并后的上清液真空热浓缩，至体积为其1/5，冷却结晶，析出乳酸钙，过滤；滤液再次真空热浓缩，至体积为其1/2，冷却结晶，析出乳酸钙，过滤。将收集到的乳酸钙晶体，经真空干燥后封存。滤液与不溶性蛋白混合，匀浆制成匀浆液，4℃保存。其中，匀浆液中总蛋白的浓度为2mg/ml。
(3)复合蛋白酶液制备：称取一定量胰蛋白酶，加入少许0.1m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.6)，加热至55℃，待酶完全溶解后，冷却至室温，再用此缓冲液配制成0.5mg/ml胰蛋白酶液，离心，取上清液，4℃保存。按照此种方法分别配制5.0mg/ml木瓜蛋白酶液、3.0mg/ml角蛋白酶液。按胰蛋白酶液:木瓜蛋白酶液:角蛋白酶液＝1:1:0.5(v:v:v)的比例混合三种酶液，得复合蛋白酶液，4℃保存。
(4)酶解：匀浆液加纯化水稀释并用0.1m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph6.6)调整ph至6.5±0.2，按复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的总质量为匀浆液中总蛋白的质量的2％的比例添加复合蛋白酶液，在发酵罐中混合此两种溶液，55℃恒温酶解10h，制得含有小分子活性肽的酶解液。
(5)脱色：按照酶解液质量的5％加入活性炭，混合均匀并搅拌10分钟，离心除去沉淀物。
(6)灭菌：采用超高温瞬时灭菌法(112℃、30s)，灭菌后真空灌装，得到小分子活性肽。
实施例2
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，选用超细珍珠粉。
按照方法1、方法2分别对实施例1-2制备的小分子活性肽进行美白功效验证，结果如表3和表4所示：
表3实施例1-2制备的小分子活性肽的美白功效验证
表4实施例1-2制备的小分子活性肽的美白功效验证
从表3和表4可以看出，两种美白功效验证方法均可以说明实施例1和2制备的小分子活性肽比直接使用珍珠粉，可以明显提高对酪氨酸酶的相对抑制率，具有良好的美白效果。
实施例3
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，在步骤(3)中，按胰蛋白酶液:木瓜蛋白酶液:角蛋白酶液＝4:2.1:7(v:v:v)的比例混合三种酶液，得复合蛋白酶液。
实施例3制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为110.12％、100.34％。
实施例4
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，在步骤(3)中，按胰蛋白酶液:木瓜蛋白酶液:角蛋白酶液＝1:1.6:0.7(v:v:v)的比例混合三种酶液，得复合蛋白酶液。
实施例4制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为106.89％、98.09％。
实施例5
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，在步骤(3)中，按胰蛋白酶液:木瓜蛋白酶液:角蛋白酶液＝3:12:6(v:v:v)的比例混合三种酶液，得复合蛋白酶液。
实施例5制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为105.25％、98.15％。
实施例6
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，匀浆液中总蛋白的浓度为1mg/ml，按复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的总质量为匀浆液中总蛋白的质量的3％的比例添加复合蛋白酶液。
实施例6制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为104.47％、98.70％。
实施例7
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，匀浆液中总蛋白的浓度为3mg/ml，按复合蛋白酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶的总质量为匀浆液中总蛋白的质量的1％的比例添加复合蛋白酶液。
实施例7制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为104.63％、98.03％。
对比例1
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，只使用胰蛋白酶，添加量为匀浆液中总蛋白的质量的2％。
对比例1制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为94.33％、81.77％。
对比例2
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，只使用木瓜蛋白酶，添加量为匀浆液中总蛋白的质量的2％。
对比例1制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为93.87％、82.65％。
对比例3
如实施例1提供的小分子活性肽的制备方法，其中，只使用角蛋白酶，添加量为匀浆液中总蛋白的质量的2％。
对比例1制备的小分子活性肽按照方法1和方法2分别测试的相对抑制率分别为92.76％、80.71％。
以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。