一种靶向脑利钠肽的纳米人工抗体的制备方法与用途与流程

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种靶向脑利钠肽(bnp)的纳米人工抗体的制备方法与用途，所述非生物纳米人工抗体具有类似天然抗体和免疫抗体的高亲和力和高选择性，可用于替代天然抗体和免疫抗体。

背景技术：

心力衰竭是临床常见的心血管疾病,是大多数心血管疾病的最终归宿,死亡率较高,它是由于心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等原因引起的心肌损伤,心肌结构和心肌功能发生改变,最终导致心室泵血或者充盈功能低下的一种复杂的临床综合征。近几年来,随着社会的进步,人们生活水平的提高,老龄人口比例不断升高,导致心力衰竭的患者也逐年增加,临床对心力衰竭的诊断主要依据症状、体征、心电图、x线及心脏彩超,这些对心力衰竭的诊断特异性低，使得心力衰竭难以早期诊断出来，给临床医生的诊断和治疗带来困难。

脑利钠肽(bnp)是由心室的心肌细胞分泌出的一种激素，是一个重要的心衰和左心室功能障碍标志物，对心功能不全患者的诊断具有高度的敏感性、特异性。同时在临床上对早期无症状心力衰竭病人的识别、明确心力衰竭病人心衰程度的判断、心衰治疗中对疗效的判定都具有重要价值。因此，临床上常将bnp水平作为心力衰竭诊断明确的患者心力衰竭危险分层的重要指标。正常情况下血浆中的bnp水平很低，仅为0～100ng/l，在心力衰竭情况下能够使利钠肽系统受到刺激而被激活，并释放出bnp，但由于血浆样本成分复杂，目前真实样本中低丰度bnp的检测依旧缺乏选择性和特异性。

天然抗体广泛应用于bnp的选择性识别和检测，然而天然抗体主要由动物免疫获得，存在成本高，制备效率低、筛选周期长、易变性难保存、具有免疫原性等缺点，单克隆抗体也存在批次性能差异大的问题，在实际应用中具有很大的局限性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种靶向脑利钠肽(bnp)的纳米人工抗体的制备方法与用途，通过模拟蛋白质-蛋白质相互作用，研究蛋白质-柔性聚合物相互作用，通过调整柔性聚合物的单体序列结构和空间分布，以创建具有蛋白质样高度特异性和可逆结合特性的基于纳米粒子的人工抗体。

技术方案如下：

一种靶向脑利钠肽(bnp)的纳米人工抗体的制备方法：n-异丙基丙烯酰胺，n-叔丁基丙烯酰胺，十二烷基磺酸钠，带电功能单体，n,n'-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，脑利钠肽的全多肽或多肽片段作为模板分子，在引发剂作用下通过聚合后洗脱模板分子得到靶向脑利钠肽的纳米人工抗体。

优选的，所述带电功能单体包括n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、n-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、3-(丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵或n-(2-氨基乙基)丙烯酰胺、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐中的任意一种或几种。

优选的，n-异丙基丙烯酰胺的用量为5-60wt％，n-叔丁基丙烯酰胺的用量为5-50wt％，带电功能单体的用量为0.5-20wt％，n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为0.5-10wt％。

优选的，聚合方法为反相乳液聚合、沉淀聚合或自由基聚合中的任一种。

优选的，引发剂为过硫酸铵或偶氮二异丁腈。

优选的，氮气氛围下的聚合反应温度为25-70℃，聚合反应时间为3-36h。

优选的，模板分子洗脱溶液为nacl、柠檬酸钠、甘氨酸或十二烷基磺酸钠中的任意一种，或者通过改变温度和ph值实现模板分子的洗脱。

优选的，纳米人工抗体的粒径为10-3000nm。

所述方法制备的靶向bnp的纳米粒子人工抗体可用于结合磁性纳米颗粒、整体柱或微流控芯片实现血清样品中低丰度bnp的高选择性富集，结合高灵敏度拉曼光谱、荧光定量检测、elisa试剂盒、化学发光试剂盒、试纸条、电化学传感器、免疫浊度、免疫层析、超声波检测、ct检测和核磁检测方法实现bnp的高灵敏度检测。

本发明利用生物膜干涉技术(bli)测定纳米粒子人工抗体与bnp之间的亲和力，生物传感器固定bnp，然后将待测纳米粒子置于检测池中，当人工抗体和bnp的相互作用发生时，生物层厚度增加；以结合解离时间为横坐标，干涉曲线的漂移导致的信号强度的增量为纵坐标，绘制标准曲线，拟合出纳米粒子人工抗体与bnp之间的结合亲和力kd以及结合、解离速率kon和kdis。

本发明所取得的技术效果：

(1)本发明方法得到的靶向bnp的纳米粒子人工抗体具有较高的亲和力和良好的选择性，可以代替生物抗体应用于血清中bnp的富集和检测；该人工抗体是由化学方法制备的聚合物，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了传统生物抗体制备周期长、易失活、成本高、具有免疫原性等缺点。

(2)本发明将纳米技术与生物膜干涉技术联用，建立对bnp靶向的人工抗体的高通量筛选体系。该方法能在20分钟内得到纳米粒子与bnp之间的亲和力kd以及结合、解离速率kon和kdis。大大缩短了筛选时间，同样也适用于其他抗原的人工抗体高通量筛选。

(3)本方法制备的人工抗体可重复使用，成本大大降低；并且合成过程与再生过程简单，适用于各种bnp的检测应用。

(4)本方法制备的人工抗体具有广泛的应用，包括结合磁性纳米颗粒、整体柱或微流控芯片可实现血清样品中低丰度bnp的高选择性富集，结合高灵敏度拉曼光谱、荧光定量检测、elisa试剂盒、化学发光试剂盒、试纸条、电化学传感器、免疫浊度、免疫层析、超声波检测、ct检测和核磁检测等方法实现bnp的高灵敏度检测。

附图说明

图1是不同粒径的纳米人工抗体的扫描电镜图。

图2是不同浓度的纳米人工抗体与bnp之间的实时结合解离曲线及其拟合线。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明提供的一种靶向脑利钠肽(bnp)的纳米人工抗体的制备方法与用途进行详细描述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例一：基于纳米粒子三维结构改性重建识别区制备靶向bnp的人工抗体

1.纳米粒子的设计及合成

将n-异丙基丙烯酰胺(58-xmol％)，带电功能单体(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵(xmol％)，n-叔丁基丙烯酰胺(35mol％)，交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(7mol％)和十二烷基磺酸钠(10mg)溶解于水中，得到总单体浓度为130mm。加入引发剂后，在氮气氛围下，用磁力搅拌器在65℃下进行聚合反应3小时。通过用过量的纯水透析纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到聚合物纳米粒子。

2.人工抗体的初步筛选

选择使用bnp作为目标物，以分子印迹聚合物纳米粒子作为仿生抗体，利用生物膜干涉技术(bli)测定纳米粒子人工抗体与bnp之间的亲和力，生物传感器用来固定相互作用分子中的bnp，形成生物膜层。然后将待测纳米粒子置于检测池中，当人工抗体和bnp的相互作用发生时，生物层厚度增加。以结合解离时间为横坐标，干涉曲线的漂移导致的信号强度的增量为纵坐标，绘制标准曲线，拟合出纳米粒子与bnp之间的结合亲和力kd以及结合、解离速率kon和kdis。

3.用分子印迹技术提高人工抗体kd值及其选择性

在初步筛选出对bnp有高kd值的纳米粒子后，为了进一步提高其亲和力和选择性，本实验采用分子印迹的方法来提高人工抗体的特异性和选择性。印迹聚合物(mip)的合成方法如下：将n-异丙基丙烯酰胺(28mol％)，n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸(30mol％)，n-叔丁基丙烯酰胺(35mol％)，n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(7mol％)、十二烷基磺酸钠(10mg)以及20mg的bnp多肽片段溶解于水中，得到总单体浓度为130mm。加入引发剂过硫酸铵后，在氮气氛围下，用磁力搅拌器在45℃下进行聚合反应12小时。然后加入0.04mol的nacl室温下继续搅拌30分钟洗脱掉模板多肽，最后通过用过量的纯水透析(每天三次换水)纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到分子印迹聚合物纳米粒子，不同粒径的纳米人工抗体的扫描电子显微镜图见图1。

生物膜干涉技术(bli)测定纳米人工抗体对bnp吸附的亲和力常数kd，结果如图2所示，表明纳米人工抗体对bnp具有很高的亲和力和选择性，与天然的抗体相当。

实施例二：靶向bnp的纳米人工抗体作为配基与整体柱固定相相结合

首先，需要在毛细管柱内壁键合硅烷偶联剂。将毛细管柱依次用丙酮和纯水冲洗干净毛细管柱内壁后，用浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液泵送通过毛细管柱，使其充分均匀地充满毛细管柱，然后置于120℃的烘箱内。随后取出反应完成的毛细管柱，用纯水将毛细管柱内的氢氧化钠冲洗干净，直至毛细管柱泵出溶液ph为中性。接着用丙酮继续冲洗并用氮气吹干毛细管柱，并将毛细管柱不封口放入120℃的烘箱内充分干燥。在棕色小瓶内将0.1g的硅烷偶联剂3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷溶于0.9g的无水甲苯中，并加入1～2mg的阻聚剂2,2-联苯基-1-苦基肼基。将其泵送通过干燥的毛细管柱后将毛细管柱的末端密封，并置于120℃的烘箱中反应。最后用丙酮冲洗毛细管柱并用氮气干燥。

然后合成纳米粒子人工抗体整体柱，240mg单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、160mg偶联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、100mg的靶向bnp的纳米粒子人工抗体和致孔剂月桂醇和环己醇混合均匀,并加入4mg引发剂偶氮异丁腈(aibn)。将混合溶液超声处理1至2分钟然后通入氮气，紧接着将混合溶液泵入毛细管柱，在两端密封，并置于60℃的水浴中反应24小时。反应完成后用甲醇冲洗整体柱以除去致孔剂，并用扫描电子显微镜表征。

实施例三：纳米人工抗体整体柱实现血清样品中低丰度bnp的选择性富集

将含有浓度为0.001～10μg/lbnp的血清样品，通过微量注射泵以0.1～0.5μl/min的流速泵入纳米人工抗体整体柱中进行选择性富集，富集后采用100mm磷酸缓冲溶液(ph＝7)洗脱非特异性吸附在整体柱上的杂质蛋白。再将富集的bnp进行洗脱，计算富集倍数和回收率。

实施例四：制备基于纳米人工抗体的双发射荧光量子点试纸条

(1)蓝色荧光碳量子点的合成

称取4.2g柠檬酸固体于50ml离心管中，加入40ml水使固体完全溶解，加入乙二胺溶液1.34ml(使柠檬酸和乙二胺的摩尔比为1:1)，搅拌使其分散均匀，将液体转移至聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜置于200℃烘箱中反应5h；反应结束待其冷却至室温，用截留分子量为1000da的透析膜透析1天，透析结束后收集备用。合成的荧光碳量子点显蓝色。

(2)红色荧光碳量子点的合成

将0.1g间苯二胺、1ml氨水加入10ml乙醇溶液中，超声搅拌10min使其溶解，然后将得到的溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，将聚四氟乙烯反应釜置于烘箱中，在180℃下反应6h，反应结束后自然冷却至室温，将得到的碳量子点用乙醇稀释到909.61mg/l可得到红色荧光量子点。

(3)纳米人工抗体双发射荧光量子点试纸条的制备

4.2g柠檬酸固体用40ml水溶解后，加入1.34ml乙二胺溶液混匀，在聚四氟乙烯反应釜中200℃下反应5h，反应结束后待其冷却至室温用1000da的透析袋透析1天，得到碳量子点。向8.5ml乙醇溶液和1.5ml水的混合溶液中加入500μlteos，磁力搅拌10min后将合成的蓝色荧光量子点(碳量子点)3ml加入到反应体系中搅拌30min，最后加入500μl氨水搅拌4h，反应结束后在12000r/min下离心10min，沉淀用乙醇和水多次洗涤，得到将碳量子点包封在二氧化硅中的纳米颗粒，此时的二氧化硅纳米颗粒显蓝色荧光。将红色量子点和bnp模板分子印迹在纳米人工抗体表面形成显红色荧光的分子印迹纳米颗粒(mip)，显红色荧光的mip包裹在显蓝色荧光的二氧化硅纳米颗粒表面，然后将模板分子洗脱，由于荧光的叠加，纳米人工抗体双发射荧光量子点呈紫色荧光。

接着当待检测bnp与纳米人工抗体双发射荧光量子点接触后，会与最外层的空腔结合，同时引起最外层红色荧光量子点的荧光淬灭，使得纳米人工抗体双发射荧光量子点由紫色荧光变为蓝色荧光。将剪裁好的滤纸条浸在制好的纳米人工抗体双发射荧光量子点溶液中，然后将待检测样本滴在试纸条上，用紫外灯照射，可以实现待检测样本的可视化检测。

实施例五：

称取适量(n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐)(apm)和适量n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(bis)将其配制成浓度为19.8mg/ml和20.0mg/ml的混合溶液。分别称取n-异丙基丙烯酰胺41.42mg，十二烷基硫酸钠10mg加入到50ml离心管中。称取n-叔丁基丙烯酰胺33.06mg溶于1ml乙醇中，再将其全部加入到离心管中。用去离子水将离心管溶液补足至接近50ml。取apm和bis混合溶液100μl，加入至离心管中，摇匀。将50ml离心管的溶液加入到三口烧瓶中，加入20mg的bnp多肽片段，加入引发剂过硫酸铵后，在氮气氛围下，用磁力搅拌器在45℃下进行聚合反应12小时。然后加入0.04mol的nacl室温下继续搅拌30分钟洗脱掉模板多肽，最后通过用过量的纯水透析(每天三次换水)纯化聚合的溶液，冷冻干燥后得到靶向脑利钠肽的纳米人工抗体。

上述反应液中加入适量磁球，得到磁性靶向脑利钠肽的纳米人工抗体。

本发明公开了一种靶向脑利钠肽(bnp)的纳米人工抗体的制备方法和用途，将多种功能单体和交联剂以不同组分聚合形成凝胶纳米颗粒人工抗体，通过改变功能单体的配比来调控人工抗体对bnp的亲和力和选择性。结合分子印迹技术，以bnp的全多肽或部分多肽片段为模板，进一步提高纳米人工抗体对bnp的特异性和选择性。筛选后纳米人工抗体对bnp的亲和力常数kd值达到1.41×10^-11m，与抗体相当，且具有良好的选择性。本发明提供了人工抗体纳米粒子的可控制备方法，获得了粒径均一、大小形状可控的人工抗体凝胶纳米颗粒。所得到的纳米人工抗体结合磁性纳米颗粒、整体柱或微流控芯片可实现血清样品中低丰度bnp的高选择性富集，并可通过高灵敏度拉曼光谱、荧光定量检测、elisa试剂盒、化学发光试剂盒、试纸条、电化学传感器、免疫浊度、免疫层析、超声波检测、ct检测和核磁检测等方法实现bnp的高灵敏度检测。

上面结合实施例对本发明的实例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出的各种变化，也应视为本发明的保护范围。