外源基因定点整合至ACTB基因下游的打靶载体构建方法及其应用与流程

本发明属于动物基因编辑工程领域，具体地说，涉及一种将外源基因定点整合至猪actb基因下游的打靶载体及其构建方法和应用。

背景技术：

在动物转基因工程研究领域，敲入的外源基因能在细胞或生物体内稳定并高效地表达是研究基因功能或者制备转基因动物的关键因素。外源基因随机整合至基因组会受到表观遗传、位置效应等各种因素的调控，所以外源基因的表达会呈现不稳定且效率难以保证。但如果通过基因编辑工具将外源基因定点整合至特异的基因组位点，并使其稳定高效表达，就不会受到其他因素的影响。所以，定点敲入外源基因至特定基因组位点具有重要意义。

actb(beta-actin)是一种细胞质肌动蛋白，也是细胞骨架的关键组成部分，在绝大多数非肌肉细胞以及未分化的成肌细胞中高效表达。与此同时，几乎参与真核细胞中所有的生理过程，包括细胞分裂及分化、细胞器及染色体运动、维持细胞骨架完整等等。此外，actb由于其具有高表达量、表达稳定的特点，因此常被作为内参基因。actb基因又在所有细胞中均稳定表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，又被称为持家基因(house-keepinggenes)。综上，考虑到actb基因的高效且稳定表达，actb基因可以作为一个友好安全位点被加以利用，从而更好地推进动物基因工程领域的研究。

crispr-cas9系统是近年来最为火热的基因编辑技术，它是广泛存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统，能主动切割外源基因组序列，从而抵御病毒对细菌的入侵。在单链指导rna(sgrna)的指引下，crispr-cas9系统能特异性地定点编辑基因组序列，并且由于其简单实用、效率高效的特点而在生命科学领域被广泛应用。crispr-cas9系统主要通过使dna双链发生断裂，再通过dna的损伤修复机制即非同源末端连接进行修复，但这种修复机制往往会导致碱基插入缺失。与此同时，此系统还可以与同源重组载体共同作用，从而进行同源重组修复，使基因组序列得到精确修饰，达到精准编辑的目的，利用这个原理，就可以定点敲入外源基因至基因组特定位点，并使其稳定高效表达，本发明就是在此基础上所做的研究。总而言之，crispr-cas9系统在基因编辑领域具有巨大的发展和应用潜力，并且逐渐成为基因编辑领域最主流的编辑工具。

目前鲜有报道可用于猪外源基因定点敲入的安全位点，借助内参基因启动子从而稳定高效地表达外源基因的研究进展也不多。本发明借助了内参基因actb启动子，定点敲入外源基因并使其稳定高效表达，同时提供了一个可供外源基因定点敲入的安全友好位点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种将外源基因定点敲入至actb基因下游的打靶载体及其应用，具体地说，即通过crispr-cas9系统，所述打靶载体可将外源基因序列定点整合至actb基因下游，并且在actb基因启动子的驱动下，外源基因可以稳定高效表达。

本发明采用以下技术方案：

一种将外源基因定点整合至猪actb基因下游的打靶载体，其构建方法是：

以猪actb基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2a剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来并构建到真核表达载体或克隆载体骨架上，所述的左同源臂的核苷酸序列如seqidno.1所示，右同源臂的核苷酸序列如seqidno.2所示，2a序列如seqidno.3所示。

进一步地，所述真核表达载体为pcdna3.1(+)，插入的多克隆位点位于hindiii与kpn1位点之间。

特异性靶向猪actb基因下游的sgrna序列，作为优选，所述sgrna的序列如seqidno.5所示。

利用crispr/cas9系统将外源基因定点整合至猪actb基因下游的方法，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：以actb基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2a剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上；所述左同源臂的核苷酸序列如seqidno.1所示，右同源臂的核苷酸序列如seqidno.2所示，2a剪切肽序列如seqidno.3所示；

(2)构建crispr-cas9切割载体：所述的切割载体含特异性靶向猪actb基因下游的sgrna，其核苷酸序列如seqidno.5所示；

(3)将所述打靶载体和crispr-cas9切割载体共同转染猪真核细胞。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种将外源基因定点整合至猪actb基因下游的打靶载体及其应用，借助crispr/cas9系统，该打靶载体可将外源基因定点整合至猪actb基因下游，使外源基因可在内源actb基因启动子的驱动下稳定表达。利用该打靶载体，可以构建稳转外源基因的细胞系或转基因猪模型，可为基因功能研究及制备转基因猪提供可用的工具及方法。

附图说明

图1是实施例1的同源重组定点打靶载体关键序列组成结构。

图2是实施例2的gfp基因定点敲入actb基因下游的打靶载体的质粒图谱。

图3是实施例3的gfp基因敲入后流式分析图。

图4是实施例4的gfp基因敲入后荧光图。

图5是实施例4的gfp基因敲入后sanger测序鉴定敲入序列的测序峰图。

图6是实施例5的gfp基因敲入后流式分选后的细胞蛋白表达检测的wb胶图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。

需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修饰和替换。

实施例1gfp基因定点敲入打靶载体构建

参阅图1，一种将外源基因定点敲入至猪actb基因下游的打靶载体，以猪基因组dna为模板，pcr扩增actb基因(geneid:414396)终止密码子上下游的部分序列作为左、右同源臂，然后将左同源臂(seqidno.1所示)、2a序列(seqidno.3所示)、外源基因序列(seqidno.4所示)和右同源臂(seqidno.2所示)连接起来反向插入至真核表达载体的多克隆位点上，获得打靶载体。

参阅图2，在优选的实施例中，基于常规真核表达载体pcdna3.1(+)载体，将上述参阅图1所示的关键片段反向插入至pcdna3.1(+)多克隆位点的酶切位点hindiii及kpn1位点之间，从而构建完成gfp基因定点敲入至猪actb基因下游的打靶载体，命名为pcdna3.1-actb-gfp-ki-donor。

实施例2crispr/cas9切割载体构建

选取猪actb基因终止密码子上游的一个sgrna序列(seqidno.5所示)：5’-agtccgcctagaagcatttg-3’，命名为actb-sgr1，其反向互补序列(seqidno.6所示)：5’-caaatgcttctaggcggact-3’。需合成的寡核苷酸链如下表所示，划线部分为酶切位点：

将合成的一对寡核苷酸序列稀释至10μm，然后各取5μl混合均匀，在pcr仪上进行退火处理，程序为：95℃，10min；65℃，30min。将退火后的pcr产物与bbsi酶切过后的px330骨架连接，挑取单克隆菌落，扩大培养后测序，将构建成功的载体命名为px330-actb-sgr。

实施例3构建gfp基因定点敲入细胞系

将上述gfp基因定点敲入打靶载体pcdna3.1-actb-gfp-ki-donor及crispr/cas9切割载体，采用脂质体转染方法(lipo2000)共同转染pk15细胞，构建稳转gfp基因的pk15细胞系，具体操作流程如下：

转染前，将pk15细胞接种至6孔板培养皿。待细胞密度达到80％-90％时进行转染。按照质粒质量1:1(各1μg)的比例，将打靶载体pcdna3.1-actb-gfp-ki-donor及crispr/cas9切割载体共同转染至pk15细胞中，按照lipo2000(invitrogen)操作说明书进行操作。转染48小时后，观察荧光，并更换含有800μg/mlg418的细胞培养基，在含有g418的培养基中连续培养三天，再通过流式细胞术分选含有gfp荧光的细胞。

参阅图3，将gfp基因定点敲入actb基因下游后对发绿色荧光的pk15细胞进行分选。从流式分选的统计数据中看出，gfp阳性细胞的比例可达到1.84％以上。

实施例4pcr-sanger测序检测敲入gfp基因的基因型

参阅图4，在流式细胞术分选出gfp基因发光的pk15细胞后，在荧光显微镜下进行观察，结果表明，流式细胞术分选出的pk15细胞均能产生绿色荧光。

收取部分分选出的pk15细胞，提取细胞基因组dna。跨同源臂设计引物对用于检测gfp基因是否成功敲入，引物设计策略参阅图5。引物对f1：5′-caccactggcatccaccact-3′，r1：5′-gctgttcaccggggtggtgc-3′，引物对f2：5′-atcacatggtcctgctggag-3′，r2：5′-tcaggggaattggggacctt-3′。分别用两对检测引物pcr扩增目的序列，将扩增出来的pcr产物进行sanger测序，得到的测序结果与参考目的序列进行比对。

参阅图5，比对结果显示，gfp基因成功定点敲入至actb基因下游。

实施例5westernblot检测分选后的阳性细胞gfp蛋白和actb蛋白表达量

在流式细胞术分选出gfp基因发光的pk15细胞后,将细胞扩大培养，然后铺到六孔板上，等细胞密度接近100％的时候，收集细胞并裂解，提取细胞总蛋白。变性蛋白并测浓度，然后进行westernblot实验，检测gfp阳性细胞相比于野生型细胞，actb蛋白表达是否会受到影响。

参阅图6，显影结果显示，gfp蛋白稳定高效高效表达，actb蛋白的表达未被破坏，符合预期结果。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所做的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例作出若干替代或变形，而这些替代或变形方式都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>外源基因定点整合至actb基因下游的打靶载体构建方法及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>900

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<211>900

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

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