一种检测化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组及检测方法与流程

本发明涉及基因多态性检测
技术领域：
，具体涉及一种检测化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组及检测方法。
背景技术：
：大量临床实例告诉我们，针对同一时期、同一类型的肿瘤患者采取相同的治疗方案，会得到不同的治疗效果。随着基因组学的迅速发展，人们发现在基因组水平上有种由于单个核苷酸引起的序列多态性，并在人类基因组中普遍存在，我们称之为单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)。研究表明SNP在疾病诊断，用药指导等方面起着重要的作用。目前用于SNP检测的方法主要有Sanger测序法，它是利用DNA聚合酶延伸DNA链，直到加入双脱氧核苷酸，从而终止DNA的进一步延伸。目前的基因测序具有一定的实用价值，也被认定为基因检测的金标准。但是，随着市场需求的不断扩大，它的不足也日益突出。主要体现在：操作复杂，需要多个实验人员完成检测工作，成本相对较高；速度慢，每次反应仅能检测到一个或几个位点，通量较低，不能满足多个位点的同时检测；检测结果不能直观地读出，需要实验人员根据经验自行判断，易存在结果判断失误。实验过程需要多次开管转管。另外，荧光定量PCR也用于检测SNP，虽然其自动化程度较高，特异性好，但其效率较低，每次只能检测一个位点；荧光标记的引物，在曝光条件下，易造成失效。近些年迅速发展起来的二代测序技术，也不断应用于SNP检测，但是测序成本较高，无法在实验室得到普及。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测化疗药物相关基因SNP的扩增引物和延伸引物，该引物组可同时检测多个SNP位点，从而建立起更加高效，成本较低，结果判读方便准确的方法。为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种检测化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组，包括：MTHFR基因rs1801133位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:1序列上游引物和SEQIDNO:2序列下游引物以及SEQID:3延伸引物；XPC基因rs2228001位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:4序列上游引物和SEQIDNO:5序列下游引物以及SEQID:6延伸引物；ERCC2基因rs13181位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:7序列上游引物和SEQIDNO:8序列下游引物，SEQID:9延伸引物；ABCB1基因rs1045642位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:10序列上游引物和SEQIDNO:11序列下游引物，SEQID:12延伸引物；GSTP1基因rs1695位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:13序列上游引物和SEQIDNO:14序列下游引物，SEQID:15延伸引物；CYP19A1基因rs4646位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:16序列上游引物和SEQIDNO:17序列下游引物，SEQID:18延伸引物；CYP2D6基因rs3892097位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:19序列上游引物和SEQIDNO:20序列下游引物，SEQID:21延伸引物；DPYD基因rs3918290位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:22序列上游引物和SEQIDNO:23序列下游引物，SEQID:24延伸引物；RRM1基因rs183484位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:25序列上游引物和SEQIDNO:26序列下游引物，SEQID:27延伸引物；RRM1基因rs9937位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:28序列上游引物和SEQIDNO:29序列下游引物，SEQID:30延伸引物；NUDT15基因rs116855232位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:31序列上游引物和SEQIDNO:32序列下游引物，SEQID:33延伸引物；TPMT基因rs1142345位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:34序列上游引物和SEQIDNO:35序列下游引物，SEQID:36延伸引物；UGT1A1基因rs4148323位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:37序列上游引物和SEQIDNO:38序列下游引物，SEQID:39延伸引物；NQO1基因rs1800566位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:40序列上游引物和SEQIDNO:41序列下游引物，SEQID:42延伸引物；SLCO1B1基因rs2306283位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:43序列上游引物和SEQIDNO:44序列下游引物，SEQID:45延伸引物；MAP4K4基因rs4550690位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:46序列上游引物和SEQIDNO:47序列下游引物，SEQID:48延伸引物；SOD2基因rs4880位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:49序列上游引物和SEQIDNO:50序列下游引物，SEQID:51延伸引物；CEP72基因rs924607位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:52序列上游引物和SEQIDNO:53序列下游引物，SEQID:54延伸引物。本发明还公开了一种化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组的检测方法，包括以下步骤：(1)准备符合质量的DNA样本；(2)PCR扩增反应：将权利要求1中的基因扩增引物在反应试剂下进行PCR扩增，得到第一扩增产物；(3)SAP酶反应：将步骤(2)中PCR扩增反应所得到的扩增产物在SAP混合液中进行SAP酶处理；(4)延伸反应：将步骤(3)中SAP酶处理后的产物在iPLEX混合液中进行延伸反应，得到延伸后的第二扩增产物；(5)样本脱盐：将步骤(4)中所得到的第二扩增产物通过离心脱盐；(6)点样到芯片：将步骤(5)中所得到的第二扩增产物点到对应的芯片上。(7)通过质谱仪分析软件自动分析步骤(6)中第二扩增产物的多态性。优选地，所述PCR扩增反应试剂、SAP混合液和iPLEX混合液的总体积比为5:2:2。本发明提供了一种检测化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组及检测方法。具备以下有益效果：本发明可以在同一个反应管中对18个SNP位点同时进行分型检测，大大节约人力、财力成本，改善临床上不合理用药现状，在准确方便判读检测结果的前提下，降低了检测成本，较其他平台具有明显的优势；并且本发明公开的18个SNP位点基本覆盖目前临床肿瘤用药。避免相关性不高位点的检测，减少复杂度；并具有特异性高，稳定性好的特点。附图说明为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1本发明的位点编号为rs1801133的质谱图；图2本发明的位点编号为rs2228001的质谱图；图3本发明的位点编号为rs13181的质谱图；图4本发明的位点编号为rs924607的质谱图；图5本发明的位点编号为rs1695的质谱图；图6本发明的位点编号为rs1801133的Sanger一代验证图；图7本发明的位点编号为rs2228001的Sanger一代验证图；图8本发明的位点编号为rs13181的Sanger一代验证图；图9本发明的位点编号为rs924607的Sanger一代验证图；图10本发明的位点编号为rs1695的Sanger一代验证图；具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例一，如图1至图5所示，一种检测化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组，包括：MTHFR基因rs1801133位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:1序列上游引物和SEQIDNO:2序列下游引物以及SEQID:3延伸引物；XPC基因rs2228001位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:4序列上游引物和SEQIDNO:5序列下游引物以及SEQID:6延伸引物；ERCC2基因rs13181位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:7序列上游引物和SEQIDNO:8序列下游引物，SEQID:9延伸引物；ABCB1基因rs1045642位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:10序列上游引物和SEQIDNO:11序列下游引物，SEQID:12延伸引物；GSTP1基因rs1695位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:13序列上游引物和SEQIDNO:14序列下游引物，SEQID:15延伸引物；CYP19A1基因rs4646位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:16序列上游引物和SEQIDNO:17序列下游引物，SEQID:18延伸引物；CYP2D6基因rs3892097位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:19序列上游引物和SEQIDNO:20序列下游引物，SEQID:21延伸引物；DPYD基因rs3918290位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:22序列上游引物和SEQIDNO:23序列下游引物，SEQID:24延伸引物；RRM1基因rs183484位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:25序列上游引物和SEQIDNO:26序列下游引物，SEQID:27延伸引物；RRM1基因rs9937位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:28序列上游引物和SEQIDNO:29序列下游引物，SEQID:30延伸引物；NUDT15基因rs116855232位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:31序列上游引物和SEQIDNO:32序列下游引物，SEQID:33延伸引物；TPMT基因rs1142345位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:34序列上游引物和SEQIDNO:35序列下游引物，SEQID:36延伸引物；UGT1A1基因rs4148323位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:37序列上游引物和SEQIDNO:38序列下游引物，SEQID:39延伸引物；NQO1基因rs1800566位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:40序列上游引物和SEQIDNO:41序列下游引物，SEQID:42延伸引物；SLCO1B1基因rs2306283位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:43序列上游引物和SEQIDNO:44序列下游引物，SEQID:45延伸引物；MAP4K4基因rs4550690位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:46序列上游引物和SEQIDNO:47序列下游引物，SEQID:48延伸引物；SOD2基因rs4880位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:49序列上游引物和SEQIDNO:50序列下游引物，SEQID:51延伸引物；CEP72基因rs924607位点扩增引物和延伸引物，具体包括SEQIDNO:52序列上游引物和SEQIDNO:53序列下游引物，SEQID:54延伸引物。上述的基因SNP位点具体信息如下表1所示：表118个基因SNP位点信息基因名称染色体位置位点编号突变类型MTHFRchr1rs1801133G/AXPCchr3rs2228001G/TERCC2chr19rs13181T/A/GABCB1chr7rs1045642A/GGSTP1chr11rs1695A/GCYP19A1ch15rs4646A/CCYP2D6chr22rs3892097C/TDPYDchr1rs3918290C/G/TRRM1chr1rs183484C/ARRM1chr11rs9937A/GNUDT15chr13rs116855232C/TTPMTchr6rs1142345T/CUGT1A1chr2rs4148323G/ANQO1ch16rs1800566G/ASLCO1B1chr12rs2306283A/GMAP4K4chr2rs4550690T/CSOD2chr6rs4880A/GCEP72chr5rs924607C/T具体的基因及位点功能如下：MTHFR(rs1801133)：MTHFR位于甲基化和DNA的合成的途径的交叉点。它催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，催化同型半胱氨酸转变为甲硫氨酸。然后甲硫氨酸被转化为通用的甲基供体，s-腺苷蛋氨酸(SAM)。其质谱图如图1所示。XPC(rs2228001)：着色性干皮病补体族C，XPC基因在识别核苷酸剪切修复过程的各个环节中发挥作用，包括：损伤识别、开放复合体形成和修复蛋白复合体形成。其质谱图如图2所示。ERCC2(rs13181)：核苷酸切除修复是机体对外源致癌物质和诱变剂的重要防御机制，ERCC2/XPD是NER的关键成分。其质谱图如图3所示。ABCB1(rs1045642)：P糖蛋白1，也称为多药耐受蛋白1。是一种细胞膜上重要的蛋白质，负责将细胞内的外源物质泵出细胞。这个过程依赖ATP提供能量，在一些酵母和细菌中这一基因起到防御的作用。一些肿瘤细胞高表达ABCB1基因，产生耐药作用。与A基因型相比，当使用环磷酰胺和氟尿嘧啶治疗乳腺癌时，G基因型与药物毒性可能无关。GSTP1(rs1695)：GSTP1基因编码谷胱甘肽S-转移酶，谷胱甘肽S-转移酶通过催化许多疏水亲电化合物与还原型谷胱甘肽结合起到解毒的作用。与AG和GG基因型相比，AA基因型与结直肠癌患者使用氟尿嘧啶后，神经毒性综合征和嗜中性白血球减少症的风险增加有关。其质谱图如图5所示。CYP19A1(rs4646)：芳香酶，细胞色素P450家族的一员，负责雌激素合成中的关键步骤。该基因编码的蛋白负责雄激素的芳香化成雌激素，对于性别形成至关重要。该基因的活化出现在某些雌激素依赖的局部组织肿瘤临近乳腺、子宫内膜和子宫平滑肌。与C基因型相比，A基因型乳腺癌患者使用来曲唑效果增加。CYP2D6(rs3892097)：细胞色素氧化酶P450家族，涉及到机体有害物质的代谢。细胞色素氧化酶P450蛋白催化很多反映涉及到药物代谢和胆固醇合成。主要和乳腺癌有关。CYP2D61846G>A引起剪接缺陷，导致无功能的蛋白质。DPYD(rs3918290)：DPYD是尿嘧啶和胸苷通过分解代谢形成丙氨酸过程中的第一个限速酶。DPYD涉及到嘧啶(如5FU，卡培他滨，替加氟)的代谢降解。与CC基因型相比，CT基因型结直肠癌患者使用卡培他滨或氟尿嘧啶治疗时，药物毒性风险增加。RRM1(rs183484、rs9937)：核糖核苷二磷酸还原酶大亚基，该基因对于S期脱氧核糖核苷酸的合成至关重要。该基因位于11p5.5区域，是肿瘤抑制基因区，该区域的改变可导致wilms肿瘤、肺癌、卵巢癌和乳腺癌等多种癌症。rs183484中，与AA和CC基因型相比，AC基因型胰腺癌患者对吉西他滨的反应降低。rs9937中，与AA基因型相比，基因型GG非小细胞癌患者使用卡铂和吉西他滨治疗时，有血液疾病风险。NUDT15(rs116855232)：Nudix水解酶15，该基因编码的蛋白属于Nudix蛋白水解酶超家族。该家族的基因催化二磷酸核苷酸的水解，底物包括氧化损伤产生的8-oxo-dGTP，也可以导致DNA修复过程中的错配引起碱基颠换。与CC基因型相比，CT和TT基因型前体细胞淋巴母细胞白血病-淋巴瘤患儿中，巯嘌呤剂量减少。TPMT(rs1142345)：TPMT是嘌呤类药物代谢过程中决定巯基鸟嘌呤核甘酸(TGNs)浓度的关键酶。与CT和TT基因型相比，CC基因型前体细胞淋巴母细胞白血病-淋巴瘤患儿中，巯嘌呤剂量减少。UGT1A1(rs4148323)：UGT1A基因座编码的一个转录本为UGT1A1，表达于肝以及结肠、小肠和胃中，主要在肝脏中发挥作用，是唯一一种负责胆红素的分解代谢的酶。与G基因型相比，A基因型肺癌患者使用伊立替康时，腹泻的可能性增加。NQO1(rs1800566)：NQO1编码黄素蛋白形成功能二聚体，结合的辅基可以是FAD或FMN，是一种主要的细胞质酶，催化广泛底物如醌类的电子还原，多数黄素蛋白参与呼吸链组成，与电子转移有关，如线粒体中的黄素蛋白主要是电子传递链中NADH脱氢酶和TCA循环中的琥珀酸脱氢酶。SLCO1B1(rs2306283)：SLCO1B1编码有机阴离子转运蛋白家族具有肝脏特异性的成员，其编码的蛋白质是跨膜受体，介导许多内源化合物(包括胆红素，17-β-葡萄糖醛酸基雌二醇和白三烯C4)的钠依赖性摄取。AG基因型在结肠直肠肿瘤患者中用伊立替康治疗时，可能降低药物毒性。MAP4K4(rs4550690)：MAP4K4编码的蛋白质是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。该激酶可能通过MAP3K7-MAP2K4-MAP2K7激酶起级联作用，并且介导TNF-α信号传导途径。与基因型C相比，基因型T患有乳腺癌女性使用阿那曲唑和依西美坦的骨折风险增加。SOD2(rs4880)：SOD2是铁/锰超氧化物歧化酶家族的成员。它编码线粒体蛋白质，形成同四聚体，每个亚基与一个锰离子结合。该蛋白与氧化磷酸化的超氧化物副产物结合并将其转化为过氧化氢和双原子氧。与A基因型相比，G基因型乳腺癌患者使用环磷酰胺治疗时，存活率降低。CEP72(rs924607)：CEP72的产物是富含亮氨酸重复序列(LRR)的超蛋白家族的成员。与CC和CT基因型患有前体细胞淋巴母细胞白血病-淋巴瘤的人使用长春新碱治疗，TT基因型与周围神经系统疾病风险增加相关。其质谱图如图4所示。而18个SNP位点的扩增引物如下表2所示：表218个SNP位点的扩增引物序列而延伸引物序列如下表3所示：表3延伸引物序列实施例二，本发明还公开了一种化疗药物疗效及副作用相关SNP的引物组的检测方法，包括以下步骤：(1)准备符合质量的DNA样本；(2)PCR扩增反应：将PCR扩增反应试剂在95℃下反应2分钟，再在95℃下进行变性30秒，再将温度降到56℃进行退火30秒，再将温度升到72℃进行延伸1分钟；再升温至95℃，循环45次，再72℃下延伸5分钟后将温度降低到4℃保温备用；其步骤如表4所示,表4PCR扩增反应步骤所述PCR扩增反应试剂的体系组成如下表5所示：表5PCR扩增反应体系(3)SAP酶反应：取SAP混合液，在37℃下孵育40分钟，用以除去PCR反应过程中多于的dNTP；再将温度升至85℃孵育5分钟，使SAP酶失活，再放置在4℃的保温箱中保温备用。所述SAP混合液的体系组成如下表6所示：表6SAP酶反应体系(4)延伸反应：将iPLEX混合液在94℃下反应30秒，再进行变性5秒，待温度降到52℃进行退火5秒和温度为80℃进行延伸5秒，并使退火和延伸进行5次循环，再将温度升至95℃下反应，循环40次，72℃下延伸3分钟后将温度降低到4℃保温备用，其步骤如表7所示；表7延伸反应步骤所述iPLEX混合液的体系组成如下表8所示：表8延伸反应体系试剂最后在7μl反应中的浓度2μl中的试剂体积(μl)NanopureWaterN/A0.619iPLEXBuffer0.222X0.2iPLEXTerminationmix1X0.2ExtendPrimerMix*0.94μM0.94iPLEXEnzyme1X0.041步骤3中获得产物N/A7总体积(ul)N/A9(5)样本脱盐：把洁净树脂铺平在96/15mg凹槽上进行风干。在样本板的每一个有样本的孔里加入41μl水然后离心。轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的凹槽上，让树脂掉到孔里。用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀30分钟，再离心5分钟。(6)点样到芯片：将样本点到对应的芯片上。(7)通过质谱仪分析软件自动分析结果。所述PCR扩增反应试剂、SAP混合液和iPLEX混合液的总体积比为5:2:2。通过本实施例中的试剂和方法，对S1900044010样本进行检测。并对该样本采用Sanger测序法进行比较。整理该样本结果如表9所示：表9MassARRAY质谱分析与Sanger验证结果上表中的右侧为金标准Sanger测序的结果统计，显示出与本发明的结果一致。如图6-图10所示为从位点编号中抽取的rs1801133、rs2228001、rs13181、rs924607和rs1695的Sanger一代验证图。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页1 2 3