一种检测H7N9亚型禽流感病毒基因组vRNA-vRNA相互作用的生物素标记方法与流程

本发明涉及病毒分子生物学技术领域，具体涉及一种检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的生物素标记方法。

背景技术：

动物流感病毒是威胁人类健康的主要公共卫生安全问题，h7n9亚型禽流感病毒的产生及其流行与流感病毒突变与自然重排紧密相关。已有研究表明流感病毒8个vrna包装进入子代病毒基因组的过程是一种特异性的选择包装过程，由此易发生突变与重排，产生新的病毒基因型。vrna-vrna直接相互作用影响子代病毒选择性包装8个基因节段。

生物素标记技术最初用于标记核酸，并在此基础上建立了非放射性标记核酸的分子杂交技术。与传统同位素标记相比，该技术具有灵敏度高、操作安全、标记稳定等优点。已有研究表明生物素标记技术可以有效标记病毒rna，利用生物素与亲和素相结合的特性鉴定vrna-vrna相互作用，并定量相互作用强度。

然而，基于不同病毒的基因组序列结构等特点，不同病毒甚至是不同亚型流感病毒的vrna-vrna互作方式和互作条件也存在较大差异，病毒vrna-vrna互作的检测方法并不具有普遍适用性。不同于定性检测，病毒vrna-vrna互作的定量检测能够分析vrna之间的相互作用强度，但是其对于杂交反应的特异性和杂交条带的清晰完整度要求很高，因此对于检测的条件参数要求更为严格。目前，尚无在体外探究重排h7n9亚型流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的有效技术体系。因此，开发高效特异的h7n9亚型流感病毒基因组vrna-vrna相互作用定量检测方法对于h7n9亚型流感病毒的进化和流行病学监测具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用生物素标记技术，高效、特异、定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的生物素标记方法，其为：采用生物素标记h7n9亚型禽流感病毒的待测rna对，将所述待测rna对经变性、杂交和凝胶迁移后，通过链霉亲和素结合反应对所述待测rna对的相互作用进行分析；所述链霉亲和素结合反应的反应液中，链霉亲和素的浓度为1.7‰～1.9‰。

生物素标记技术是利用生物素与亲和素之间的特异性结合反应的示踪标记方法。本发明发现在h7n9亚型禽流感病毒的vrna-vrna互作检测时，链霉亲和素的浓度控制显著影响检测结果，将所述链霉亲和素结合反应的反应液中链霉亲和素的浓度控制在1.7‰～1.9‰，更有利于降低链霉亲和素结合反应的非特异性、降低检测背景，保证条带清晰度和完整性，提高检测的敏感性。

本发明中，所述生物素标记h7n9亚型禽流感病毒的待测rna对为利用生物素标记ntps体外反转录合成。

本发明发现对于h7n9亚型禽流感病毒，在体外反转录掺入生物素标记的过程中，生物素标记ntps的用量显著影响合成的生物素标记rna的标记效率和rna质量。

作为优选，所述体外反转录体系中，生物素标记ntps浓度为5～10mm。采用上述生物素标记ntps的用量能够更好地保证合成rna的生物素标记效率和rna质量，更有利于得到纯度较高的生物素标记基因组rna片段，同时更好地与上述链霉素结合步骤配合，保证rna相互作用检测的特异性和敏感性，以及保证条带清晰度和完整性。

作为优选，所述杂交为在52～55℃下反应25～30min。在上述条件下杂交能够有效降低h7n9亚型禽流感病毒rna之间的非特异性结合，更好地保证杂交反应的特异性，使得rna相互作用的定量检测检测结果更为准确。

作为优选，所述杂交的杂交反应缓冲液包括如下组分：二甲基胂酸、kcl和mgcl2；所述二甲基胂酸在杂交反应体系中的终浓度为10～12mm，kcl在杂交反应体系中的终浓度为60～65mm，mgcl2在杂交反应体系中的终浓度为1～2mm。采用上述杂交反应缓冲液能够更好地提高杂交反应的特异性和敏感性，以及保证条带清晰度和完整性。

进一步优选地，所述二甲基胂酸在杂交反应体系中的终浓度为10mm，kcl在杂交反应体系中的终浓度为60mm，mgcl2在杂交反应体系中的终浓度为1mm。

进一步优选地，所述杂交反应液的ph为7.5。

作为优选，所述变性为在80～85℃下反应2～3min。在上述条件下变性能够更好地保证h7n9亚型禽流感病毒的rna的二级结构充分打开，为杂交反应提供有利条件，提高杂交的敏感性和特异性。

进一步优选地，所述定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法包括如下步骤：

(1)体外转录模板的制备：采用特异性引物扩增获得ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因中的任意两个，分别连接至载体后将载体线性化得到模板dna；

(2)生物素标记的h7n9亚型禽流感病毒rna的制备：以步骤(1)制备的线性化载体为模板，以生物素标记的ntps为原料进行体外转录；所述生物素标记ntps浓度为10mm；

(3)rna变性和杂交：将所述生物素标记的h7n9亚型禽流感病毒待测rna对在85℃下变性2～3min，冰上放置2～3min，加入杂交反应缓冲液，在55℃下反应25～30min；

(4)凝胶迁移和生物素标记rna的转印：低温条件下进行电泳迁移后，将生物素标记rna的转印至核酸杂交膜上；

(5)链霉亲和素结合和检测：将已转印生物素标记rna的核酸杂交膜进行固定、封闭，加入链霉亲和素反应液进行亲和素结合反应，经化学发光反应后进行成像检测；所述链霉亲和素反应液中，hrp标记的链霉亲和素的浓度为1.8‰～1.9‰。

本发明通过优化和筛选，获得了分别扩增h7n9亚型禽流感病毒的8个基因的特异性引物对。

作为优选，上述步骤(1)中，所述ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因的特异性引物的序列分别如seqidno.1-16所示。

其中，ha基因的特异性引物如seqidno.1-2所示，na基因的特异性引物如seqidno.3-4所示，pb2基因的特异性引物如seqidno.5-6所示，pb1基因的特异性引物如seqidno.7-8所示，pa基因的特异性引物如seqidno.9-10所示，np基因的特异性引物如seqidno.11-12所示，m基因的特异性引物如seqidno.13-14所示，ns基因的特异性引物如seqidno.15-16所示。

进一步优选地，上述步骤(1)中，提取h7n9亚型禽流感病毒提取其全基因组rna，将全基因组rna反转录得到cdna，以cdna为模板，扩增ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因，与pspt19质粒连接。

作为优选，上述步骤(2)中，所述体外反转录的45μl反应体系为：5×转录缓冲液9μl，10mm生物素标记的ntps8μl，线性化模板dna400ng，recombinantrnaseinhibitor1.5μl，t7rnapolymerase2μl，depc处理水补至45μl。所述体外反转录的反应条件为37℃孵育3小时。

进一步优选地，上述步骤(2)中，将体外反转录得到的生物素标记rna，通过rnase-freednasei消化除去模板，经纯化得到生物素标记的h7n9亚型禽流感病毒rna。

作为优选，上述步骤(3)中，所述变性的8μl反应体系如下：成对的步骤(2)制备的生物素标记的h7n9亚型禽流感病毒rna2pmol，250mmedta1μl，rnase-free水补至总体积。

作为优选，上述步骤(3)中，所述杂交反应的缓冲液的各组分在杂交反应体系中的终浓度如下：二甲基胂酸10mm，kcl60mm，mgcl21mm。

作为优选，上述步骤(4)中，所述电泳迁移为采用1～1.5％的琼脂糖凝胶电泳1.5～2h。

进一步优选地，上述步骤(4)中，所述电泳的缓冲液包括如下组分50mmtris、44.5mm硼酸、0.1mmmgcl2。

进一步优选地，上述步骤(4)中，所述转印为在低温条件下转印1-1.5h。

作为优选，上述步骤(5)中，所述封闭为在封闭液中封闭0.5～1h。

进一步优选地，上述步骤(5)中，对转印的核酸杂交膜正面和反面分别进行紫外交联5分钟，使生物素与rna固定在膜上。

进一步优选地，上述步骤(5)中，固定后的核酸杂交膜通过生物素标记核酸检测试剂盒进行封闭。

进一步优选地，上述步骤(5)中，将封闭后的核酸杂交膜在链霉亲和素反应液中孵育15～20min。所述链霉亲和素反应液包括如下组分：hrp标记的链霉亲和素和封闭液。

进一步优选地，上述步骤(5)中，经显色成像后，确定泳道中每个条带的rna的重量分数(％)，通过将相应条带的重量分数除以泳道中所有条带的重量分数之和计算rna相互作用复合物的百分比。

本发明的有益效果在于：

本发明利用生物素标记技术建立了检测h7n9病毒基因组内各vrna相互作用的方法。本发明筛选得到了h7n9亚型流感病毒各基因片段的特异性引物，构建了h7n9体外转录载体，并以此为模板进行体外转录。通过对生物素标记、变性、杂交、链霉亲和素结合等步骤的条件参数的全面、整体优化，显著提高了病毒rna的生物素标记效率以及生物素标记vrna的产物浓度，得到了纯度较高的生物素标记基因组rna片段，同时有效保证了杂交的特异性和敏感性，得到的vrna杂交条带清晰、完整，进而显著提高了vrna-vrna结合和相互作用检测的准确性。

本发明提供的生物素标记的h7n9病毒rna的体外互作检测方法能够直观地观察到病毒rna在体外的相互作用情况，并通过定量泳道中每个条带的rna重量分数(％)，将相应条带的重量分数除以泳道中所有条带的重量分数之和计算rna相互作用复合物的百分比，实现了vrna-vrna相互作用强度的定量检测。通过比较不同片段vrna-vrna相互作用强度，为h7n9病毒的基因组选择性包装、病毒变异和进化研究提供基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用生物素标记技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的简要流程图。

图2为本发明实施例1中利用生物素标记技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用中生物素标记和化学发光反应检测的原理图。

图3为本发明实验例1中利用实施例1提供的利用生物素标记技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析np基因的vrna与na基因的vrna的相互作用的结果，其中，+代表加入相应基因的vrna，-代表未加入相应基因的vrna，*代表vrna-vrna复合物。

图4为本发明实验例1中利用对比例1提供的利用生物素标记技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析np基因的vrna与na基因的vrna的相互作用的结果，其中，+代表加入相应基因的vrna，-代表未加入相应基因的vrna。

图5为本发明实验例1中利用对比例2提供的利用生物素标记技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析np基因的vrna与na基因的vrna的相互作用的结果，其中，+代表加入相应基因的vrna，-代表未加入相应基因的vrna。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，t7rna聚合酶是promega公司生产的，货号为p207e；生物素标记ntpsmix是roche公司生产的，货号为11685597910；dnasei是neb公司生产的，货号为r0303s；rna清洁纯化试剂盒是艾德莱公司生产的，货号为rn1401；低熔点琼脂糖是lon2a公司生产的，货号为50002；核酸杂交膜是ambion公司生产的，货号为am10102；生物素标记核酸检测试剂盒是thermo公司生产的，货号为；89880。

实施例1定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法

本实施例提供一种定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法(简要流程如图1所示)，具体包括如下步骤：

(一)体外转录模板的制备

1、引物设计：分别针对h7n9亚型流感病毒8个基因(ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns)的高度保守区域，设计8对扩增引物。引物均委托商家合成。各基因的特异性扩增引物见表1。

表18个基因pcr扩增所用特异性引物

2、病毒rna的提取与反转录

病毒rna提取(roche病毒rna提取试剂盒)

(1)取200μl病毒液加入400μlbindingbuffer，混匀，静置10min；

(2)将以上混合液过柱，12000r/min离心1min；

(3)将层析柱移到另一干净的收集管中，加入500μlinhibitorremovalbuffer，12000r/min离心1min；

(4)将层析柱移到另一干净的收集管中，加入450μlwashbuffer，12000r/min离心1min；

(5)重复操作(4)；

(6)弃去收集管中液体，12000r/min离心1min；

(7)再将层析柱移到1.5ml离心管中，加入50μlelutionbuffer，12000r/min离心1min。

反转录的40μl反应体系如下：rna抽提产物24μl，反转录引物uni122μl，5×m-mlvrtbuffer8μl，dntpmix4μl，m-mlvreversetranscriptase(rt)1μl，recombinantrnaseinhibitor(rri)1μl。

反应体系加完样后，瞬时离心。

反应程序如下：37℃反应1h，4℃保存。

3、pcr反应

以步骤2反转录得到的cdna为模板，分别采用表1中所示的各基因的特异性引物进行pcr扩增，得到ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因片段(双链dna片段)。

每管反应体系为50μl，反应体系如下：fastpfuflydnapolymerase1μl，fastpfuflybuffer10μl，dntps4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cdna4μl，加双蒸水至终体积为50μl。

将反应体系混匀，并作好标记。

反应程序如下：94℃5min；94℃30s，50～58℃退火30s，72℃延伸1min-2min30s，共进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

以上反应程序中，退火温度根据各引物对的tm值计算，退火温度＝tm-5℃。

延伸时间根据各基因扩增片段的大小以及酶的扩增速度确定。

4、体外转录载体的制备

体外转录载体的构建方法如下：将上述步骤3扩增得到的各基因片段分别插入pspt19质粒的酶切位点之间，得到体外转录载体。

各基因插入的酶切位点如表2所示。ha基因插入至pspt19质粒的kpni和sali酶切位点之间。

表28个基因插入pspt19质粒的酶切位点

5、体外转录载体的线性化

为获得特定长度的rna转录产物，需在插入位点下游选择合适的限制酶(切割产生平末端或5’-突出末端为佳)切割质粒dna使之线性化。

不同基因片段的体外转录载体线性化所用限制性内切酶以及buffer如表3所示：

表3体外转录载体线性化所用限制性内切酶

将含有目的片段的pspt19质粒酶切，使之线性化。酶切体系如表4所示：

表4体外转录载体线性化反应体系

酶切反应条件：37℃，3-5h。

将酶切后产物进行、切胶回收，再进行电泳鉴定。用nanodrop2000测定回收产物浓度，作为体外转录的模板。

(二)体外转录制备vrna

1、体外转录

以上述(一)中制备的体外转录模板作为模板进行各基因的vrna的体外转录，具体方法如下(采用以下操作方法可从1μgdna模板中制备10μgrna转录产物，反应体系可以放大或缩小)：

(1)解冻冻存的试剂，混匀后短暂离心；

(2)酶蛋白和核苷酸需冰上放置，反应缓冲液需室温放置；

(3)室温配制反应体系(如表5所示)；

表5体外转录的反应体系

(4)37℃孵育3小时。

2、消化dna模板

体外转录完成后，为得到纯度较高的rna，需消化dna模板。在体外转录产物中加入5μl10×dnaseⅰbuffer，1μldnaseⅰ，置于金属浴上反应15分钟后，获得的rna溶液，用nanodrop2000测定rna浓度，做好记录。

3、rna清洁纯化

使用rnacleanrna清洁纯化试剂盒最大限度的除去蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质。清洁纯化步骤可在室温进行，但是应该迅速操作，减少rna降解机会，具体方法如下：

(1)冰上rna样品加入rnase-freewater补足至100μl，加入350μl溶液rc，混匀。

(2)加入250μl无水乙醇，混匀，无需离心。

(3)上一步所得溶液和可能有的沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)，4℃12000rpm离心45s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新套回收集管。如需除去dna微量残留，可在本步骤后进行dna酶柱子上直接消化。

(4)加0.5μl漂洗液rw(先检查是否已加入乙醇)，4℃12000rpm离心45s，弃废液。

(5)加0.5μl漂洗液rw，4℃12000rpm离心45s，弃废液

(6)4℃13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(7)取出吸附柱ra，放入rnase-free离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μlrnase-freewater(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟。如需较多的rna，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟，或者另外在加入30μlrnase-freewater，离心1分钟，合并两次洗脱液。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要rna浓度较高，可适当减少洗脱体积，但是最小体积最好不少于30μl，体积过小降低rna洗脱效率，减少rna产量。

(8)获得的rna溶液，用nanodrop2000测定rna浓度,做好记录，-80保存。

(三)vrna的变性、杂交和电泳迁移率分析

1、预电泳

将配置好的1×tbm电泳缓冲液放在4℃预冷，使用该电泳缓冲液配制不含goldenview的1％的低熔点琼脂糖凝胶，待胶凝固后，在预冷的1×tbm电泳缓冲液中进行预电泳，电压为120v，电流为30ma，电泳时间为15分钟。

1×tbm电泳的缓冲液的组分如下：50mmtris、44.5mm硼酸、0.1mmmgcl2。

2、变性和杂交反应

将上述步骤(二)制备的、需要验证是否发生相互作用的h7n9亚型禽流感病毒的两种vrna样品(待测vrna对，分别命名为vrna1和vrna2)从-80℃冰箱中取出，放置在冰上融化，配制如表6所示的rna-rna相互作用反应体系(8μl)。

表6vrna变性的反应体系

体系配制过程中使用无rna酶200μlep管与无rna酶枪头。体系配制完成后，轻弹管壁使体系混匀，瞬离。

提前打开金属浴升温至85℃，将配置好的变性反应体系样品置于85℃下变性2分钟，迅速放置在冰上，冰上静置2分钟。每管加入2μl的5×杂交反应缓冲液，轻弹管壁使体系混匀，瞬时离心；提前打开金属浴，将rna互作样品以55℃温育30分钟，使rna发生结合。

5×杂交反应的缓冲液的组分如下：二甲基胂酸50mm，kcl300mm，mgcl25mm，ph7.5。即杂交反应体系中，二甲基胂酸的终浓度为10mm，kcl的终浓度为60mm，mgcl2的终浓度为1mm。

取出rna样品后，迅速将样品与5×rnaloadingbuffer按比例混合，即每管加入2μl的5×rnaloadingbuffer，吹打混匀。将混合后的样品全部加入点样空中，点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。4℃条件下进行电泳迁移，电压为120v，电流为30ma，电泳时间为1.5小时。

(四)生物素标记rna的转印

将经电泳迁移的生物素标记rna转印至核酸杂交膜上，具体方法如下：

1、电泳结束前20min，将转印所需的滤纸浸泡在1×tbm电泳缓冲液中。

2、电泳结束后，取出凝胶，根据rna条带范围切下符合要求的凝胶，将凝胶浸入预冷的1×tbm缓冲液中；根据rna凝胶的大小，裁下相应大小的核酸杂交膜，先放置在1×tbm缓冲液中浸泡1min；打开转膜夹，按照从负极(黑色)到正极(红色)顺序次为：滤纸—凝胶—核酸杂交膜—滤纸的顺序组装好转膜夹，使用玻璃棒赶出中间可能会出现的气泡，夹紧夹板；将已组装好的转膜夹放置到红色的转膜槽中，加入足够量的1×tbm缓冲液(至槽顶端)，确保装置所有正负极都连接正确，采用湿式电转膜法转膜；4℃条件下进行转印，电流为300ma，转印时间为1-1.5小时。

3、转印结束后，将核酸杂交膜取出，用紫外交联仪固定膜表面病毒vrna，曝光能量为9000×100μj/cm²，曝光时间为5min(正反面各5min)。

(五)生物素标记rna相互作用的检测

使用生物素标记核酸检测试剂盒(thermo)进行生物素标记rna相互作用的检测(检测反应的原理如图2所示)，封闭液(nucleicaciddetectionblockingbuffer)、亲和素结合液、膜洗液(1×washbuffer)在使用前需50℃水浴预热20分钟，并在室温放置，使温度降至室温。将封闭缓冲液和4×洗涤缓冲液在水浴中缓慢加热至37-50℃直至所有颗粒溶解。这些缓冲液可以在室温和50℃之间的温度范围内使用，但使用前需保证所有溶液中的颗粒完全溶解。底物平衡缓冲液可在4℃和室温之间的温度范围内使用。

1、封闭：将步骤(四)中得到的紫外交联曝光后的核酸杂交膜放置在塑料盒中进行膜封闭，加入16ml封闭缓冲液，轻轻摇动孵育1小时；

2、亲和素结合：使用封闭液稀释hrp标记的链霉抗生物素蛋白来制备用于结合生物素的链霉亲和素反应液，使得hrp标记的链霉亲和素的浓度为1.83‰。封闭结束后将封闭液从塑料盒中倾倒出，倒入上述配制好的链霉亲和素反应液。将膜在链霉亲和素反应液中孵育15分钟，同时轻轻摇动；

3、洗膜：在120ml超纯水中加入40ml4×洗涤缓冲液，制备1×洗涤液。孵育完成后将核酸杂交膜转移到新容器中并用20ml1×洗涤溶液短暂冲洗；在温和摇动的20ml1×洗涤溶液中洗涤核酸杂交膜4次，每次5分钟；

4、hrp底物化学发光反应：将核酸杂交膜转移到新容器中，加入30ml底物平衡缓冲液。轻轻摇动孵育5分钟；在1ml稳定过氧化物溶液中加入1ml鲁米诺/增强剂溶液，来制备化学发光底物反应液(应注意：不要将发光液暴露在阳光下或任何其他强光下，并且为获得最佳效果，应将发光液保存在棕色瓶中，避免长时间暴露在强光下)；孵育完成后，从底物平衡缓冲液中取出核酸杂交膜，小心地将膜的边缘印在纸巾上以除去多余的缓冲液。将膜放入干净的容器中或放在平放的干净的塑料包装表面；将发光液缓慢倒在核酸杂交膜上，使其完全覆盖表面。或者，可以将膜以核酸面朝下放置在发光液中。将核酸杂交膜在底物发光液中孵育3分钟；从底物发光液中取出核酸杂交膜，将膜边缘在吸水纸巾上擦拭2-5秒钟，去除多余的发光液，但不要让膜变干；

5、曝光：采用ecl曝光法，在曝光之前将电脑软件及曝光机打开进行预冷，待温度降至-20℃时将核酸杂交膜置于曝光机中央，关闭曝光机的舱门，利用曝光软件进行曝光。曝光时间根据rna条带信号强弱进行改变，从数秒钟到数分钟均可。

6、结果分析：将曝光后的rna条带图片保存至电脑个人文件夹中，使用公共u盘拷贝至个人电脑后进行进一步分析；通过软件image-j进行条带的灰度分析，计算rna复合物的量占整个泳道中vrna分子量的百分数，以此估计vrna-vrna相互作用强度。

对比例1

本对比例提供一种定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：用于结合生物素的链霉亲和素反应液中hrp标记的链霉亲和素的浓度为2‰。

对比例2

本对比例提供一种定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：用于结合生物素的链霉亲和素反应液中hrp标记的链霉亲和素的浓度为1.6‰。

实验例1

利用实施例1提供的定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法进行np基因的vrna与na基因的vrna的相互作用分析，结果如图3所示；利用对比例1和对比例2提供的定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法进行np基因的vrna与na基因的vrna的相互作用分析，结果如图4和图5所示。结果显示，利用实施例1提供的定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析np基因的vrna与na基因的vrna的相互作用，vrna检测的条带清晰、完整，杂交背景干净无污染，能够很好地分析vrna之间的相互作用；结果表明，np与na基因可以发生相互作用，经计算，rna复合物的量占整个泳道中vrna分子量的45.2％，np基因与na基因的vrna-vrna相互作用较强。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的生物素标记方法

<130>khp191113231.2

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aatggtaccagcaaaagcagggg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggtgtcgacagtagaaacaaggg23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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