一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用。

背景技术：

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不明显，大多食管癌患者确诊时已是晚期，预后极差。目前我国食管癌患者5年生存率只有20％左右。尽管形势严峻，然而在肿瘤研究领域，食管癌的基础研究与药物开发却相对滞后，尤其是食管癌在世界范围内地区分布有显著的差异性，而中国是最主要的高发区，其中绝大多数属于鳞癌。因此开发食管癌高通量研究平台，十分必要。

crispr/cas9—基因编辑的魔法剪刀手，作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成rna导向的dna识别及编辑，使用crispr/cas9系统开发食管癌高通量研究平台比较方便。crispr的基因打靶系统，可利用靶点特异性的rna将cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割，导致基因敲除等等。与传统基因编辑方法相比，crispr的打靶系统简单，载体构建简单，打靶效率很高，是细胞系基因敲除模型制作中广泛采用和认可的手段之一。

传统的细胞系敲除，即使采用crispr/cas基因编辑系统，仍需在细胞转染后进行多轮抗性药物筛选以及极限稀释分离出单克隆细胞并扩大培养后方可进行表型分析，无论是极限稀释方法还是抗性筛选方法，筛选到阳性细胞后均需要将单个细胞扩大培养到一定程度后方可进行表型分析，耗费大量时间成本和人力成本；而且筛选效率低下，分析表型费时，很大程度上拖延了食管癌功能基因的研究进度和广度。

公布号为cn109402179a中国发明专利申请中公开了一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其中指出rnd2基因亦可通过细胞分选后收取不同时间点的dna进行片段分析，但是该技术路线需要两次提取dna的过程，并且后续片段分析实验操作繁琐，所需测序仪价格昂贵不易推广。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用，该方法能够快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型，实现食管癌高通量的分子筛选，对食管癌相关基因功能研究具有很强的指导作用。

本发明是这样实现的，一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1：利用crispr/cas9基因编辑技术将食管癌细胞功能基因park2基因敲除；

步骤2：细胞分选，将功能基因敲除的细胞与空载对照组细胞分别接种至孔板培养；

步骤3：将孔板培养的细胞固定后，经结晶紫染色，目测两组细胞的克隆形成率，判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型。

进一步，步骤2中细胞分选后，另取细胞裂解提取dna，进行pcr、电泳鉴定，验证功能基因是否成功敲除。

进一步，pcr检测的引物序列见seqidno.10和seqidno.11。

进一步，步骤2中使用流式细胞分选仪对食管癌功能基因敲除的细胞与空载对照组的细胞进行分选，并接种至六孔板中培养。

流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下带荧光标签的细胞并测量其发射荧光的强度。流式细胞分选可根据不用的marker分选，具有精度高，速度快等特点。克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外持续6代以上，其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖能力和独立生存能力。

进一步，步骤3中使用多聚甲醛固定细胞。

进一步，步骤1中利用crispr/cas9基因编辑技术将食管癌细胞功能基因park2基因敲除的步骤包括：

s1：针对功能基因设计sgrna靶序列，并针对靶序列设计引物；

s2：引物退火、配对，获得带有粘性末端的双链dna片段；

s3：将带有粘性末端的双链dna片段与具有相同粘性末端的cas9载体连接，获得重组表达载体；

s4：用重组表达载体转染食管癌细胞，培养，获得将食管癌细胞功能基因park2基因敲除的细胞。

进一步，步骤s1中sgrna靶序列设计为两个或者三个。

选择三个靶序列同时进行打靶，能够提高基因编辑的效率。

进一步，所述sgrna靶序列见seqidno.1至seqidno.3。

进一步，步骤s3中，所述cas9载体为px460载体。

如权利要求1-9任一所述的一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法在食管癌功能基因敲除后的增殖表型判断中的应用。

进一步，提取dna的步骤如下所示：将分配至6孔板后的余下细胞，离心弃上清，加9-11μl裂解液及3-5μl蛋白酶k，另加入9-10μl去离子水，然后于55-57℃10-20min、94-96℃3-7min进行裂解。

该种dna提取方法方便快捷，所需细胞量少，并且提取得到的样品pcr扩增阳性率高。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

与现有技术相比，本发明技术路线具有流程简单，只需一次操作即可，并且结果更为直观稳定。此外本发明候选目的基因park2属于发明人在食管癌研究中新发现的一个新的分子标记物，目前尚未有文献报道，具有较高的创新价值。

本发明的细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，结合以上内容，将crispr/cas9技术与流式细胞分选技术以及片段分析技术有机整合到一起，可快速鉴定食管癌功能基因敲除后的相关表型。本发明的方法中从crispr/cas9基因敲除到获取表型结论，整个流程共计两周时间，结果精准稳定，比起传统抗性筛选、极限稀释后的单克隆细胞株筛选，再到单克隆细胞扩增后的增殖表型分析，节省了大量人力和时间成本。本发明利用以上技术的有机结合，可实现食管癌高通量的分子筛选，为食管癌的临床研究提供分子治疗靶点。

附图说明

图1是pcr鉴定park2基因crispr-cas9打靶效果图；

图2是结晶紫染色结果；

图3是细胞克隆数目比对结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用，发明构思为：分别转染目的基因sgrna与crispr/cas9载体同源重组后的质粒和不含目的基因sgrna的crispr/cas9空载。然后利用流式细胞分选仪，每组分选5000个带有crispr/cas9载体荧光标签的阳性细胞群。分选完毕后，每组细胞分别取出500个细胞接种至六孔板的三个培养孔中，即六孔板每孔含有目的基因敲除组与空载组的500个细胞，并且各有三个复孔。余下的细胞裂解获取dna，pcr后作琼脂糖凝胶鉴定验证。分选的细胞在细胞培养箱中培养2周后，终止培养，以4％多聚甲醛固定后，再经结晶紫染色。此时可肉眼判断每组细胞的克隆形成数目。根据克隆形成结果即可快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型。通过在食管癌细胞系kyse150中敲除park2基因，可以观察到该基因在食管癌细胞系中的作用。具体实验步骤如下：

1、针对候选基因park2，确定打靶位点

根据sgrna设计原则，以人类基因park2的转录本(transcript:prkn-206enst00000366898.6)其中的exon9作为模版，利用在线设计软件(http://crispor.tefor.net)，获得三个特异性位点作为sgrna靶序列，当然其他实施例中也可以只设计两个靶序列，本实施例中的靶序列分别为：

sgrna1：5’-gtcctcccctatcaaccccg-3’，见seqidno.1；

sgrna2：5’-tactgctggtaccggttgta-3’，见seqidno.2；

sgrna3：5’-tggagcggtgtgttcctgtc-3’，见seqidno.3。

然后通过体外转录，合成得到sgrna。

2、设计引物

根据以上设计的靶序列，设计三对引物并由上海百力格生物技术有限公司合成，在引物序列的5’端添加bbsi酶切位点(其中添加下划线的碱基序列表示为添加的酶切位点)，引物序列分别为：

h-park2-ivt-1：5’-caccgtcctcccctatcaaccccg-3’，见seqidno.4；

h-park2-ivt-2：5’-aaaccggggttgataggggaggac-3’，见seqidno.5；

h-park2-ivt-3：5’-caccgtacaaccggtaccagcagta-3’，见seqidno.6；

h-park2-ivt-4：5’-aaactactgctggtaccggttgtac-3’，见seqidno.7；

h-park2-ivt-5：5’-caccgacaggaacacaccgctcca-3’，见seqidno.8；

h-park2-ivt-6：5’-aaactggagcggtgtgttcctgtc-3’，见seqidno.9。

值得注意的是表达sgrna的px461载体是用的u6启动子，如果转录起始位点为碱基g的话，基因表达量会明显升高，故再设计引物时应考虑这个因素，额外添加一个碱基g，这种情况下，其对应的下游引物3’末端需要添加一个碱基c，来保证基因维持较高的表达量。

3、引物退火、配对获得带有粘性末端的双链dna片段

将步骤2中合成的6条引物以h-park2-ivt-1+h-park2-ivt-2和h-park2-ivt-3+h-park2-ivt-4还有h-park2-ivt-5+h-park2-ivt-6的组合方式退火配对获得带有粘性末端的双链dna片段。

具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物h-park2-ivt-1+h-park2-ivt-2和h-park2-ivt-3+h-park2-ivt-4还有h-park2-ivt-5+h-park2-ivt-6各加入1μl(100μm)，再加入1μl10×t4ligationbuffer(neb)，然后加入0.5μlt4polynucleotidekinase(nebm0201s)，最后加入6.5μlddh2o至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至pcr仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。

4、获得线性化的载体dna片段

使用限制性内切酶bbsi将载体(px460)dna线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体dna片段，具体体系如下：向1.5ml离心管中依次加入1μgpx461载体dna；3μl10×nebbuffer2.1；1μlbbsi(neb)最后补水至总体积30μl，置于37℃培养箱孵育过夜。酶切后使用qiaquickpcrpurificationkit纯化酶切产物并回收至20μlddh2o中。

5、通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgrna和cas9表达载体

加入0.5μl步骤(3)中得到的带有粘性末端的双链dna片段和2μl步骤(4)中得到的具有相同粘性末端的载体dna，再加入0.5μlt4dna连接酶(nebm0202s)和1μl10×t4ligationbuffer(neb)，反应1小时后转化大肠杆菌dh5α并涂氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，第二天下午挑选单菌落进行测序验证，最终可得到sgrna和cas9重组表达载体px460-park2-1和px460-park2-2以及px460-park2-3。

6、获得转染食管癌细胞系

将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染食管癌细胞系kyse150。

细胞培养和转染详细步骤如下：

kyse150细胞的培养和传代：细胞购于中科院细胞库，将细胞带回实验室置于co2培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用dpbs换液以冲洗掉死细胞和细胞代谢物，再加入新鲜的培养液rpmi1640+10％fbs+1％双抗(青霉素+链霉素))继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞长满培养瓶底90％左右开始传代。观察培养瓶中细胞生长状况，待细胞增殖至铺满瓶底的80～90％时，吸除瓶内的旧培养液，用预热的dpbs洗涤1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％edta)1ml，37℃消化2min后将培养瓶放置于显微镜下观察。当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mlrpmi1640以终止消化反应，用移液器轻柔反复吹打细胞，细胞脱离瓶壁后即形成细胞悬液，吸取适量悬液转移至新的培养瓶中，加入新鲜培养基混合均匀后置于co2恒温培养箱中培养。待细胞达90％汇合度后，按上述传代方法将f2细胞接种到24孔板上培养24h。

细胞的转染：将px460-park2-1和px460-park2-2以及px460-park2-3载体dna各取1μg，两种质粒共计3μg为实验组，取3ugpx460空载为对照组，分别加入到150μl减血清培养基(opti-mem)中进行稀释；取0.75μl脂质体lipofectamine3000稀释于150μl减血清培养基(opti-mem)中，然后将脂质体稀释液加入至dna稀释液中，充分混匀，置于室温条件下孵育20min。将上述步骤中已接种培养细胞的24孔板中的培养基弃去，然后将复合物按顺序分别加入相应的细胞中，每孔加入300μl，另额外加三孔以作为平行对照实验组和未加入转染混合物的细胞作为阴性对照组。所有细胞在37℃5％浓度co2培养箱中孵育4h后，弃去培养基，更换新鲜的培养基继续培养。

7、分选细胞群

转染48h后，弃去培养基，采用胰酶消化法将细胞重悬于含有500μl新鲜培养基的离心管中，1500rpm离心5min后，丢弃大部分培养基上清，留约200μl培养基于管底，用移液器轻轻吹打混匀，再加400μl新鲜培养基混匀后转移至流式管中。通过流式细胞仪将cfp阳性细胞群分选至已经加有10ml新鲜培养基的15ml离心管中，每个离心管分选5000个cfp阳性细胞。分选完毕后，每组细胞分别取出500个细胞接种至六孔板的三个培养孔中，即六孔板每孔含有目的基因敲除组与空载组的500个细胞，并且各有三个复孔。余下的细胞裂解获取dna，pcr后作琼脂糖凝胶鉴定验证。分选的细胞在细胞培养箱中培养2周，每隔一天，更换培养液一次。

8、琼脂糖凝胶验证敲除效率

将分配完六孔板细胞后余下的细胞裂解获取dna，pcr后跑琼脂糖凝胶鉴定验证，其中裂解以及pcr鉴定步骤主要如下：

①裂解细胞，提取dna

细胞离心弃上清，加10μl裂解液及4μl蛋白酶k，另加入9.6ul去离子水，pcr仪中进行裂解，反应条件为56℃15min，95℃5min。

②pcr鉴定：

根据park2基因信息，在包含靶序列的片段上，设计引物：

park2-pcr-f：5’-cacacttatatgtcttgccagttgaa-3’，见seqidno.10；

park2-pcr-r：5’-tccttcactcctgtctacttaaagg-3’，见seqidno.11。

通过pcr扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为750bp)，用此引物进行pcr。

pcr体系为：(vazyme，p111)2*taqmasterpcrmix：5μl，park2-pcr-f(5μm)和park2-pcr-r(5μm)各0.5μl；基因组dna：20ng；补充ddh2o至总体积10μl；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，50s，30个循环；72℃，10min。

pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，从图中可见park2已成功被crispr-cas9打靶成功。

9、结晶紫染色确定平板克隆结果

分选的细胞在细胞培养箱中培养2周后，终止培养，以4％多聚甲醛固定后，再经结晶紫染色。此时可肉眼判断每组细胞的克隆形成数目。根据克隆形成结果即可快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型。结果见图2、图3。根据平板克隆结果可判断park2敲除后食管癌细胞系的增殖速度加快。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>新乡医学院

<120>一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>sgrna1(sgrna1)

<400>1

gtcctcccctatcaaccccg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>sgrna2(sgrna2)

<400>2

tactgctggtaccggttgta20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>sgrna3(sgrna3)

<400>3

tggagcggtgtgttcctgtc20

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(h-park2-ivt-1)

<400>4

caccgtcctcccctatcaaccccg24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(h-park2-ivt-2)

<400>5

aaaccggggttgataggggaggac24

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(h-park2-ivt-3)

<400>6

caccgtacaaccggtaccagcagta25

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(h-park2-ivt-4)

<400>7

aaactactgctggtaccggttgtac25

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(h-park2-ivt-5)

<400>8

caccgacaggaacacaccgctcca24

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(h-park2-ivt-6)

<400>9

aaactggagcggtgtgttcctgtc24

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(park2-pcr-f)

<400>10

cacacttatatgtcttgccagttgaa26

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(park2-pcr-r)

<400>11

tccttcactcctgtctacttaaagg25