基于过氧化钙/聚合物产氧粒子的双交联水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种基于过氧化钙/聚合物产氧粒子的双交联水凝胶及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。

背景技术：

组织工程在疾病治疗展现出广泛的应用前景，近年来的研究发现，在大尺寸工程化组织构建时由于中心区域缺乏充足的氧气供应，使构建的工程化组织功能不全，影响了其对受损组织的修复效果。因此，期望研制出一种产氧性支架材料能够在工程化组织的构建时提供一定的力学强度及适宜的氧气浓度和产氧时间。

水凝胶是一类广泛应用于组织工程中的新型生物支架，可达90％以上的含水量，较大的网孔结构，这与细胞外基质的结构相似，有利于细胞的粘附、生长、增殖以及分化；另外，其良好的生物通透性和生物相容性也有利于细胞与外界进行物质交换和信号传递。由于其独特的性质，广泛应用于生物医学的各个领域，如药物释放，生物传感器和组织工程等。

相比于体外成型的凝胶而言，可注射凝胶可以将生物分子或是细胞混合均匀，通过注射的方式植入体内受损部分。可注射水凝胶具有可以匹配组织受损区域形状，创面小等优点，具有很强的临床价值。因此，可注射水凝胶受到国内外研究人员的广泛关注，可注射凝胶的凝胶强度是组织工程中的研究热点。而凝胶强度跟凝胶交联机制相关，交联机制可分为物理交联和化学交联。物理交联是指在形成网络结构的过程中不产生新的化学键，其优点在于反应过程不涉及化学反应，不会引入有害的交联剂，反应过程安全，方便，整个过程具有可逆性。然而，物理交联的缺点在于难以形成结构均一的凝胶，导致凝胶的力学强度不高，并且降解的速度太快，难以控制。化学交联是指水凝胶在形成的过程中会产生新的化学键，形成的凝胶不可逆，且难以降解，常用于提高水凝胶的力学性能。然而，化学交联剂的加入对细胞具有毒害作用，会阻碍凝胶在组织工程领域的应用。

近年来，无机过氧化物在组织工程中都得到了很广泛的研究，虽然液体过氧化氢、过碳酸钠和过氧化钙都能产生氧气，但释放速率不同。例如，过碳酸钠由过氧化氢分解产生的氧气的速率明显高于过氧化钙快。如果以缓释为目标，过氧化钙较慢的产氧速率会比过碳酸钠更为有利。相反，由于mgo2的溶解度较低，因此反应速度非常慢，不足以提供细胞所需的氧气浓度。过氧化钙遇水发生反应，具有产氧特性，广泛应用于农业、医学、食品、环境等领域。已有研究采用过氧化钙为工程化组织的发育提供氧气。但是其容易与水反应，氧气释放的速度快，难以与工程化组织的形成速度或受损组织的修复速度相匹配。因此，开发一种能够持续提供充足氧气的产氧材料具有十分重要的意义。

综上，研制具有一定力学强度的可注射产氧水凝胶在组织工程领域显得尤为重要。

技术实现要素：

为了克服现有产氧颗粒产氧时间短等缺点，我们创造性提出在过氧化钙合成的过程中加入温敏性的聚合物，制备了过氧化钙/聚合物产氧粒子，在生理条件下使用时，产氧粒子表面的聚合物具有疏水特性，能够阻碍水与产氧粒子的接触，从而延长过氧化钙产氧粒子的产氧时间。在此基础上，为了改善产氧凝胶的力学强度不够，产氧时间不长及使用不方便等缺点，我们首先提出将过氧化钙/聚合物产氧粒子与多巴胺改性的海藻酸钠相结合，制备出一种全新的产氧双交联水凝胶。其中，多巴胺改性的海藻酸钠作为网络原料，过氧化钙/聚合物作为交联剂，钙离子与海藻酸钠中羧基的离子交联为第一交联点，多巴胺自交联形成多巴胺二聚体的化学交联为第二交联点，多巴胺二聚体的结构如图2虚线框中所示，同时，凝胶内部的过氧化钙与水发生反应，产生氧气。

本发明的目的在于克服产氧离子产氧时间不长，现有产氧凝胶的力学强度不够，产氧时间不长及使用不方便等缺点，提供一种使用简单，具有一定的产氧时间的过氧化钙/聚合物产氧粒子和相应的双交联可注射性水凝胶。

本发明的技术方案如下：

一种基于过氧化钙/聚合物的双交联产氧水凝胶，过氧化钙/聚合物复合粒子引入到海藻酸钠多巴胺溶液中，钙离子与海藻酸钠的羧基形成交联点，多巴胺的自交联形成交联点，氯化钙的质量浓度为3wt％，聚合物的质量浓度为3-60wt％；具有双交联可注射水凝胶。

所述的聚合物为聚异丙烯基丙烯酰胺、聚己内酰胺或聚乙二醇。

本发明的过氧化钙/聚合物产氧粒子的制备方法是：无水氯化钙与聚合物溶于去离子水中，搅拌直至完全溶解，得到混合溶液；然后在反应液中加入浓氨水，使反应溶液的ph值≥9.5，搅拌1-4h，将双氧水滴加到以上反应混合溶液中，搅拌转速为100～1000r/min；室温下继续反应4-8小时后，然后加入0.1mol/l氢氧化钠溶液直至溶液的ph值达到11～12，以1000r/min以上的转速离心分离沉淀物，所得沉淀用碱洗，然后用蒸馏水洗涤沉淀物，直到滤液的ph值为8-8.5；然后45-60℃下真空干燥24h以上获得过氧化钙/聚合物产氧粒子。

本发明的一种基于过氧化钙/聚合物产氧粒子的可注射性水凝胶的制备方法如下：包括如下步骤：

(1)将海藻酸钠溶解到ph值在5.0-5.5的pbs缓冲溶液中，然后加入碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，通氮气30分钟以上，加入多巴胺盐酸盐，室温避光反应6-24h；采用透析袋对产物进行透析，冷冻干燥，获得多巴胺海藻酸钠；

(2)过氧化氢酶和辣根过氧化氢酶溶到ph值为7.4的pbs缓冲溶液中，取步骤(1)所制备的多巴胺海藻酸钠溶解到酶溶液中，形成2-6wt％的多巴胺海藻酸钠前驱液；

(3)取过氧化钙/聚合物产氧粒子溶于的ph为8.0的tris缓冲液中，震荡均匀，形成1-10wt％过氧化钙悬浊液；然后与步骤(2)多巴胺海藻酸钠的前驱液中以1:9的体积比混合，磁力搅拌均匀；放置于37℃的空气震荡浴中孵育，得到多巴胺海藻酸钠-过氧化钙水凝胶。

所述步骤(1)中的海藻酸钠的质量浓度为1wt％。

所述步骤(1)中海藻酸钠的糖单元、碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(0.5～2):(0.5～2)。

所述步骤(1)中，多巴胺与海藻酸钠的糖单元的摩尔比为1:1～1:3。

所述步骤(3)中，过氧化钙/聚合物分别为过氧化钙/聚异丙烯基丙烯酰胺，过氧化钙/聚己内酰胺，过氧化钙/聚乙二醇；过氧化钙/聚合物悬浊液的浓度范围为0.25wt％～1wt％；凝胶中过氧化氢酶的浓度为0.01-0.1mg/ml，辣根过氧化氢酶的浓度为0.01-0.2mg/ml。

本发明方法制备的一种具有产氧功能的水凝胶：首先在过氧化钙的制备过程中引入温敏性等聚合物制备过氧化钙/聚合物，第二通过酰胺化作用制备多巴胺改性的海藻酸钠，第三，将过氧化钙/聚合物引入到海藻酸钠多巴胺溶液中，钙离子与海藻酸钠的羧基形成第一交联点，多巴胺的自交联形成第二交联点，从而制备了具有缓慢产氧功能的双交联可注射水凝胶。水凝胶如图2所示。水凝胶由多巴胺修饰的海藻酸盐和过氧化钙/聚合物复合粒子组成。该产氧水凝胶中的过氧化钙/聚合物复合粒子是在聚异丙烯基丙烯酰胺、聚己内酰胺、聚乙二醇等聚合物存在的条件下形成，具有氧气产生功能。水凝胶是由过氧化钙形成氧气过程中产生的钙离子和h2o2与多巴胺修饰海藻酸钠形成物理和化学双交联结构。该凝胶具有良好的可注射性能、力学性能及产氧性能，可以在长时间中保持凝胶的高压氧状态，在工程化组织构建中具有良好的应用前景。

本发明的有益效果：

本发明制备的过氧化钙/聚合物产氧粒子，过氧化钙粒子表面涂敷聚合物的疏水作用或者阻碍作用，有效地减缓了水和过氧化钙的反应，过氧化钙/聚异丙烯基丙烯酰胺产氧粒子相比于过氧化钙，同样的产氧量，产氧时间有效延到5个小时(图1)，该产氧粒子可用于医学，环境等领域。本发明制备的双交联可注射性产氧水凝胶由多巴胺修饰的海藻酸盐和过氧化钙/聚合物产氧粒子组成。以海藻酸钠作为聚合物的骨架，通过多巴胺简单的改性后，与过氧化钙/聚合物产氧粒子混合，一步法制备物理化学双交联可注射产氧水凝胶。该双交联水凝胶可通过调节过氧化钙/聚合物产氧粒子的含量使其压缩强度可达247±1.15kpa(图3)，水凝胶除了有一定的力学性能，还可以有效提高凝胶内部的氧气含量，在37℃温度下凝胶内部保持高氧环境超过4天(图4)。此外，本发明所制备的可注射产氧凝胶，所用材料均无毒或低毒。

附图说明

图1过氧化钙/聚合物产氧曲线。

图2双交联产氧凝胶示意图。

图3为本发明制备的双交联海藻酸钠水凝胶的应力应变图。

图4为本发明制备的双交联海藻酸钠水凝胶的溶解氧随时间的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。下面实施例中使用的试剂主要包括以下几种：海藻酸钠，多巴胺盐酸盐，过氧化钙，辣根过氧化氢酶，过氧化氢酶，磷酸盐缓冲液，碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。

实施例1：过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺产氧粒子制备

称取3g无水氯化钙，6g聚异丙烯基丙烯酰胺溶于130ml去离子水中，搅拌直至待完全溶解，然后在混合溶液中加入15ml的25％的氨水，搅拌1h后，将20ml质量分数为30％的双氧水滴加到反应液中，搅拌转速为100r/min。室温下反应4小时后，然后加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液直至溶液的ph值达到11，以1000r/min的转速离心5分钟分离沉淀物，所得沉淀用碱洗3次，然后用去离子水洗涤沉淀物，直到滤液的ph值为8.0。然后45℃下真空干燥48h获得过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺产氧粒子。

实施例2：过氧化钙/聚己内酰胺产氧粒子制备

称取3g无水氯化钙，30g聚己内酰胺溶于130ml去离子水中，搅拌直至待完全溶解，然后在混合溶液中加入15ml的25％浓氨水，搅拌2h后，将20ml质量分数为30％的双氧水滴加到反应液中，搅拌转速为500r/min。室温下反应6小时后，然后加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液直至溶液的ph值达到11.5，以5000r/min的转速离心5分钟分离沉淀物，所得沉淀用碱洗3次，然后用去离子水洗涤沉淀物，直到滤液的ph值为8.5。然后50℃下真空干燥36h获得过氧化钙/聚己内酰胺产氧粒子。

实施例3：过氧化钙/聚乙二醇产氧粒子制备

称取3g无水氯化钙，60g聚乙二醇溶于130ml去离子水中，搅拌直至待完全溶解，然后在混合溶液中加入15ml的25％浓氨水，搅拌4h后，将20ml质量分数为30％的双氧水滴加到反应液中，搅拌转速为1000r/min。室温下反应8小时后，加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液直至溶液的ph值达到12，以10000r/min的转速离心5分钟分离沉淀物，所得沉淀用碱洗3次，然后用去离子水洗涤沉淀物，直到滤液的ph值为9。然后60℃下真空干燥24h获得过氧化钙/聚乙二醇产氧粒子。

实施例4：过氧化钙/聚合物产氧粒子的测试

称取6mg上述实施案例1制备的过氧化钙/聚异丙烯基丙烯酰胺，加入30ml含过氧化氢酶的磷酸盐缓冲液中于37℃恒温条件下进行氧气生成实验，每隔30min通过上海雷磁jb608溶氧仪测定其产氧量，测量1min完毕后，通氮气2min，去除该时间段内生成的氧气。结果表明对于过氧化钙来讲，其在前两小时内生成了大量的氧气，后续过程几乎没有氧气的形成，而过氧化钙/聚异丙烯基丙烯酰胺形成氧气的速度明显降低，其前2小时的氧气生成量仅占总体的45.1％，而纯过氧化钙则占到70.7％。原因在于聚异丙烯基丙烯酰胺属于温敏性聚合物，在37℃下，聚合物表现出疏水特性，阻碍水与过氧化钙的接触，使氧气产生速率得到明显控制。

实施例5：多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺产氧水凝胶的制备

(1)将1g的海藻酸钠溶解到100mlpbs溶液中，然后加入484mg碳二亚胺和291mgn-羟基琥珀酰亚胺，通氮气30分钟，加入0.96g多巴胺盐酸盐，室温避光反应6h；采用截留分子量为3000da透析袋对产物进行透析3天，冷冻干燥，获得多巴胺海藻酸钠。

(2)称取0.06g的多巴胺海藻酸钠溶解到2.7ml含有过氧化氢酶和辣根过氧化氢酶的混合溶液中。

(3)称取7.5mg上述实施案例1制备的过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺溶于300μltris缓冲液中，震荡均匀，然后迅速将过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺悬浊液加到2.7ml多巴胺海藻酸钠的酶溶液中，磁力搅拌，混匀。放置于37℃的空气震荡浴中孵育，得到多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺水凝胶。凝胶中多巴胺海藻酸钠、过氧化氢酶、辣根过氧化氢酶和过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺的浓度分别为2.0wt％、0.05mg/ml，0.1mg/ml和0.25wt％。

实施例6：多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚己内酰胺产氧水凝胶的制备

(1)将1g的海藻酸钠溶解到100mlpbs溶液中，然后加入0.98g碳二亚胺和0.58gn-羟基琥珀酰亚胺，通氮气40分钟，加入1.92g多巴胺盐酸盐，室温避光反应12h；采用截留分子量为3000da透析袋对产物进行透析3天，冷冻干燥，获得多巴胺海藻酸钠。

(2)称取0.12g的多巴胺海藻酸钠溶解到2.7ml含有过氧化氢酶和辣根过氧化氢酶的混合溶液中。

(3)称取15mg上述实施案例2制备的过氧化钙/聚己内酰胺溶于300μltris缓冲液中，震荡均匀，然后迅速将过氧化钙/聚己内酰胺悬浊液加到2.7ml多巴胺海藻酸钠的酶溶液中，磁力搅拌，混匀。放置于37℃的空气震荡浴中孵育，得到多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚己内酰胺水凝胶。凝胶中多巴胺海藻酸钠、过氧化氢酶、辣根过氧化氢酶和过氧化钙/聚己内酰胺产氧粒子的浓度分别为4.0wt％、0.05mg/ml，0.1mg/ml和0.5wt％。

实施例7：多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚乙二醇产氧水凝胶的制备

(1)将1g的海藻酸钠溶解到100mlpbs溶液中，然后加入1.97g碳二亚胺和1.16gn-羟基琥珀酰亚胺，通氮气50分钟，加入2.88g多巴胺盐酸盐，室温避光反应24h；采用截留分子量为3000da透析袋对产物进行透析3天，冷冻干燥，获得多巴胺海藻酸钠。

(2)称取0.18g的多巴胺海藻酸钠溶解到2.7ml含有过氧化氢酶和辣根过氧化氢酶的混合溶液中。

(3)称取30mg上述实施案例3制备的过氧化钙/聚乙二醇溶于300μltris缓冲液中，震荡均匀，然后迅速将过氧化钙/聚乙二醇悬浊液加到2.7ml多巴胺海藻酸钠的酶溶液中，磁力搅拌，混匀。放置于37℃的空气震荡浴中孵育，得到多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚乙二醇水凝胶。凝胶中多巴胺海藻酸钠、过氧化氢酶、辣根过氧化氢酶和过氧化钙/聚乙二醇产氧粒子的浓度分别为6.0wt％、0.05mg/ml，0.1mg/ml和1wt％。

实施例8：多巴胺海藻酸钠-过氧化钙产氧水凝胶的力学性能检测

通过电子万能试验机(wdw-05l，500n)检测不同过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺含量的多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺产氧水凝胶的压缩性能。首先将实施案例5所制备的水凝胶前驱液吸入2ml的注射器中，经过12h的孵育后，取出，凝胶样品经过裁剪为圆柱型，高度为6±0.5mm，直径为9±0.3mm。压缩速率固定为5mm/min。图3中，过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺的含量分别为0.25wt％，0.5wt％，0.75wt％，1wt％，结果表明随着过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺含量的增加，压缩应力随之而增加，压缩应力达到247±1.15kpa，这归因于随着过氧化钙投料比的增加，同样的反应时间，生成的过氧化氢量随着增加，凝胶体系中的交联密度增加。

实施例9：产氧凝胶的测试

通过侵入式氧传感器(presens)检测多巴胺海藻酸钠-过氧化钙/聚异丙基丙烯酰胺产氧水凝胶的产氧性能。首先将实施案例5所制备的水凝胶前驱液吸入10ml的密封小瓶中，然后迅速将溶解氧探头侵入凝胶内部，检测凝胶中氧气含量的变化情况。在37℃条件下，连续测试4天，测量时间间隔1min/次。图4对产氧双交联水凝胶的产氧性能进行表征和测试，实验结果表明，双交联水凝胶的产氧在4天之后，凝胶的氧气含量仍然维持在15.7mg/l，远高于正常氧压5.7mg/l。