一种新型分离寡核苷酸的色谱方法与流程

本发明涉及寡核苷酸分离
技术领域：
，特别是涉及一种新型分离寡核苷酸的色谱方法。
背景技术：
：寡核苷酸是一种20-30个碱基左右的dna片段，可以用于dna测序、pcr扩增、基因检测、反义核苷酸研究等领域。以寡核苷酸为基础的反义技术是迄今为止实现抑制或消除遗传信息的最常见和最成功的方法。合成寡核苷酸序列的反义效应在20世纪70年代末首次被zamecnik和stephenson证明。扎米尼克和斯蒂芬森利用劳斯肉瘤病毒(rsv)35srna的5'端和3'端核苷酸序列，确定了21个重复序列(nt)，这些重复序列对病毒整合似乎至关重要。他们合成了一个13碱基的寡核苷酸，(aatggtaaaatgg)是该病毒序列的一部分。将合成的寡核苷酸序列导入感染rsv的成纤维细胞中，可显著抑制病毒的产生。他们正确地得出结论，寡核苷酸通过与关键序列杂交并阻断它们来抑制病毒整合。他们用杂交来描述这种寡核苷酸。寡核苷酸主要的得到方法是固相亚磷酰胺三酯法合成法，具体见图1。合成寡核苷酸之后需要进行分离纯化，除去杂质才能得到纯度高的dna片段，用于下游检测或扩增和研究使用。合成寡核苷酸的主要杂质是失败的碱基片段，具体见图2。分离纯化寡核苷酸的方法主要是高效液相色谱法，分离纯化的指标是目标物和杂质的分离度，现有高效液相色谱法方法中使用teab作为离子对试剂，对寡核苷酸进行分离纯化，该方法又称反相离子对色谱法。由于teab的保留性能一般，所以目标物与杂质之间的分离度较差。寡核苷酸不能得到真正有效的分离，对于一些缺少一个碱基的片段的杂质，经常会和目标物共流出，从而影响纯度导致下游应用效果变差。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种新型分离寡核苷酸的色谱方法，分离效果好。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种新型分离寡核苷酸的色谱方法，采用包括有己胺醋酸盐的流动相对寡核苷酸进行液相色谱法分离。在本发明一个较佳实施例中，所述液相色谱法中固定相采用的是c18柱。在本发明一个较佳实施例中，所述色谱方法中所述流动相还包括甲醇。在本发明一个较佳实施例中，所述色谱方法中流速为1ml/min。本发明的有益效果是：本发明的新型分离寡核苷酸的色谱方法，基于色谱分离方法原理，通过改变高效液相色谱法中离子对试剂的组成成分，提高寡核苷酸在反向色谱柱上的保留性能，从而改善相邻一个碱基寡核苷酸之间的分离度，提高寡核苷酸的分离纯化效果，提高目标物与杂质的分离度，从而提升产品的质量。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1是现有技术中寡核苷酸合成方法固相亚磷酰胺三酯法合成法的合成路线图；图2是现有技术中合成的目标物寡核苷酸和杂质的化学结构式图；图3是本发明新型分离寡核苷酸的色谱方法的分离效果图；图4是本发明对比实验中采用三乙胺碳酸氢盐teab的分离效果图；图5是现有技术中以三乙胺碳酸氢盐teab作为离子对试剂的高效液相色谱法的原理图；图6是本发明新型分离寡核苷酸的色谱方法中以己胺醋酸盐haa作为离子对试剂的原理图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。提供一种新型分离寡核苷酸的色谱方法，采用包括有己胺醋酸盐的流动相对寡核苷酸进行液相色谱法分离。采用waters高效液相色谱仪进行分离。具体高效液相色谱法hplc条件为：色谱柱：c18柱，粒径为：3.5微米，柱规格为：4.6*150mm。流动相a为：四氢呋喃，第二流动相b为：己胺醋酸盐haa。柱温选定为：60摄氏度。流速选定为：1ml/min。波长选定为：260nm。注入量为：10微升。样品：16-28个dt碱基的寡核苷酸和杂质的混合物。高效液相色谱法hplc的梯度为：时间流速(ml/min)b％013011306138719515195以己胺醋酸盐haa作为离子对试剂的分离效果图见图3。对比实验：实验条件与上述实验条件相同，样品为16-28个dt碱基的寡核苷酸和杂质的混合物，以三乙胺碳酸氢盐teab作为离子对试剂的分离效果图见图4。从图3和图4中可以看出，采用己胺醋酸盐haa的图3，混标中每个组分的分离度明显优于采用图4所示三乙胺碳酸氢盐teab的分离度。在现有技术中，分离寡核苷酸的高效液相色谱法中离子对试剂采用的是三乙胺碳酸氢盐teab。三乙胺上的乙基带有疏水性，可对反相色谱柱上的填料颗粒产生吸附作用。由碳酸提供一个质子，使得三乙胺成铵正离子的盐，带有正电荷的铵正离子和寡核苷酸上的磷酸二酯键上的氧负离子有电荷吸附作用。相应的反相色谱柱中的填料为硅胶颗粒键合了c18链，具有疏水性，能够吸附同样带有疏水性的三乙胺碳酸氢盐上的乙基。具体见图5。采用高效液相色谱法分离寡核苷酸的原理为：不同碱基数的寡核苷酸，其带有的磷酸骨架数不同，也就意味着磷酸二酯键上的氧负离子数量不同。碱基数少的寡核苷酸，和离子对试剂电荷吸附作用小，吸附能力弱，较其他物质先洗脱，碱基数多的寡核苷酸，和离子对试剂电荷吸附作用大，吸附能力强，较其他物质后洗脱，从而达到不同碱基数寡核苷酸的分离。由于三乙胺的疏水性能一般，所以寡核苷酸在反相色谱柱上的保留性能也不佳。加上碳酸氢盐本身的不稳定性，导致当杂质和目标物差异性较小时，无法达到有效分离。根据碳链越长，疏水性越强的原理，本发明选用己胺醋酸盐作为离子对试剂，对寡核苷酸进行分离纯化，具体见图6。虽然现有技术中存在有非常多的碳链长且疏水性强的化合物，但己胺醋酸盐是价格相对经济，容易获得的溶剂，适用于广泛的应用。本发明选用了疏水性更强的己胺醋酸盐haa，由图3和图4可知，其相邻碱基数的寡核苷酸分离度较三乙胺碳酸氢盐teab有显著的进步，能够有效分离缺一个碱基的杂质，提高寡核苷酸产品的成品质量。本发明的有益效果是：一、所述新型分离寡核苷酸的色谱方法基于色谱分离方法原理，通过改变高效液相色谱法中离子对试剂的组成成分，提高寡核苷酸在反向色谱柱上的保留性能，从而改善相邻一个碱基寡核苷酸之间的分离度；二、所述新型分离寡核苷酸的色谱方法提高了寡核苷酸的分离纯化效果，提高了目标物与杂质的分离度，从而提升产品的质量。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12