一种用于检测甲醛的荧光分子探针与制备方法、及其荧光试纸的制备方法与流程

本发明属于有机合成和化学分析技术领域，具体涉及一种用于检测甲醛的荧光分子探针与制备方法、及其荧光试纸的制备方法。

背景技术：

甲醛是一种重要的有机原料，主要用于塑料工业、合成纤维、皮革工业、医药、染料等。同时，甲醛对环境和人体的危害也是不容忽视的。甲醛是原浆毒物质，能与蛋白质结合，它对人体健康的影响主要表现在嗅觉异常、肺功能异常、肝功能异常、免疫功能异常等方面。长期接触低剂量甲醛可以引起慢性呼吸道疾病、新生儿体质降低、染色体异常，甚至引起鼻咽癌。高浓度的甲醛对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害。甲醛还有致畸、致癌作用。

阿尔茨海默病(alzheimerdisease,ad)，即老年性痴呆，是老年人群中引起痴呆的最常见的神经退行性疾病。随着人类寿命的不断延长，老年痴呆发病率也在逐年上升。老年痴呆是继肿瘤，心脏病和脑血管病之后引起老年人死亡的第四大病因。who已将老年痴呆定位二十世纪五大重点病之一。研究发现，老龄大鼠在记忆力逐步下降的同时,其海马甲醛含量随老龄化进程而增加；参考痴呆模型鼠脑甲醛浓度,给正常成年小鼠注射甲醛,也能观察到其空间记忆能力的下降.这些结果表明,脑内特别是海马甲醛的蓄积可能是诱发动物记忆衰退的关键原因之一。

因此，迫切需要开发高灵敏、高选择性、高安全性的特异性的能够在与人类密切相关的环境条件下以及在可应用与临床诊断中的甲醛检测方法是极其重要和有意义的。目前为止，甲醛检测方法主要有四种：分光光度计化学分析法、电化学法、色谱法和传感器法；如专利号为201711238089.5‘一种空气中甲醛的检测方法’中采用了多孔玻板吸收管收集甲醛，然后用气相色谱测试甲醛的含量；又如专利号为201811353149.2‘一种食品中甲醛的检测方法’中，采用了滴定法测定食品中的甲醛含量；在如专利号为201811414989.5‘一种精确度高的空气甲醛含量检测方法’中，采用传感器等收集甲醛，然后通过比色法，测试甲醛的含量。但是上述四种甲醛检测方法很难做到成本低廉、操作简便和快速检测，因此难以满足市场对甲醛快速检测的需求。基于分子影像学荧光分子探针由于其具有高灵敏度、高选择性和实时原位检测的特点而成为研究人员关注的焦点。荧光的分析法由于其快速、灵敏、非破坏性和适用于高通量检测的优异特点，已被广泛的应用于不同样品中甲醛含量的检测，例如申请号为201510787684.9“一种甲醛荧光探针及其制备方法、应用”中报道了一种双发射带的比率型荧光探针，可应用于水环境中和生物样品中甲醛的检测。又如申请号为201610340384.0“一种双光子甲醛荧光探针及其制备与应用”公开了一种1,8-萘酰亚胺的新型双光子甲醛类荧光探针，其检测甲醛的检测限为5μmol/l。专利201610981466.3“一类检测甲醛的荧光探针及其制备和应用”中公开了一种本身在水溶液中无荧光，但可与甲醛发生特异性的快速反应，生成具有强荧光的产物，其检测甲醛的速度仅需1min，但是其对低浓度的甲醛灵敏度不高。专利申请号为201710358356.6“一种检测甲醛的荧光探针制备方法及应用”中报道了一种2-aza-cope重排反应的荧光探针，但是其检测限处于mm水平。针对目前已经报道的这些荧光探针大多具有一些局限性1.检测限有限，对甲醛响应不够灵敏。主要只能检测微摩尔级别的甲醛，而对痕量甲醛则无法实现定量检测。2.响应速度不够快，多数探针在加入甲醛后需要数十分钟甚至几小时的时间完成响应。3.探针溶解度差，大多只能在有机溶剂中使用，限制其在环境和生物领域的应用。4.探针类型少，检测方法单一，无法适应复杂多变的环境。因此，现在急需开发可以快速、灵敏，并可广泛应用于生物及环境检测的甲醛探针。

技术实现要素：

本发明的目的是公开一种可快速检测甲醛且灵敏度高，抗干扰性强用于检测甲醛的荧光分子探针与制备方法、及其荧光试纸的制备方法。

本发明这种用于检测甲醛的荧光分子探针，其结构式如ⅰ所示：

其中：r1和r2均为氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基、胺基、二甲氨基中的一种。

这种用于检测甲醛的荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：

1)化合物2的合成：向圆底烧瓶中加入靛红酸酐和溶剂，室温搅拌条件下，向反应体系中加入化合物1，接着在水浴条件下搅拌回流反应，反应结束后，将反应液倒入蒸馏水中，析出黄褐色沉淀，接着调节ph至中性，静置至无沉淀析出，然后过滤，得到黄褐色沉淀；将黄褐色沉淀洗涤干燥纯化后，即得化合物2；

2)化合物3的合成：向圆底烧瓶中加入步骤1)中制备的化合物2和溶剂，室温搅拌搅拌条件下加入对甲苯磺酰氯，接着在水浴条件下进行搅拌回流反应，反应完成后，将反应液倒入蒸馏水中，会有白色沉淀析出，继续调节ph至中性，静置至无沉淀析出，然后过滤，得到白色沉淀；将白色沉淀洗涤干燥纯化后，即得化合物3；

3)化合物5的合成：向圆底烧瓶中加入步骤2)中制备的化合物3和溶剂1，接着在水浴条件下搅拌反应，反应开始时向反应体系中缓慢加入硝酸与冰醋酸混合溶液，反应结束后，将反应液倒入蒸馏水中，会有黄褐色沉淀析出，继续调节ph至中性，静置至无沉淀析出，然后过滤，得到黄褐色沉淀；将黄褐色沉淀洗涤干燥纯化后，即得化合物4；向圆底烧瓶中加入化合物4和溶剂2，接着加入催化剂，将反应体系抽真空后并通入氢气，接着进行第二次反应，反应结束后，进行过滤，得到黄绿色滤液，将滤液进行减压蒸馏并纯化后，得到化合物5；

4)化合物6的合成：将步骤3)中的化合物5溶解于溶剂中，并加入顺丁烯二酸酐，进行搅拌回流反应，反应至设定时间后，进行取样点板，确定反应完毕后，冷却至室温，并将反应液倒入碳酸氢钠水溶液，析出大量沉淀后，进行抽滤，将滤饼纯化后，得到淡黄色固体产物，即为化合物6；

5)荧光分子探针的制备：将步骤4)中的化合物6和化合物7置于圆底烧瓶中，接着加入溶剂，然后在冰水浴环境下搅拌反应，反应完毕后，将反应液倒入蒸馏水中，沉淀析出完毕后，过滤，将滤饼进行纯化后，得到黄色固体，即为荧光分子探针；

其合成路线如下：

所述步骤1)中，溶剂为冰醋酸，靛红酸酐和溶剂的摩尔体积比为(6～7):15mmol/ml，靛红酸酐与化合物1的摩尔比为(6～7):(7.5～8.5)；回流反应温度为85～95℃，反应时间为1.5～2.5h。

所述步骤2)中，溶剂为吡啶，化合物2与溶剂的(0.5～1.5):20mmol/ml，化合物2与甲苯磺酰氯的摩尔比为(0.5～1):(1.5～2.5)，回流反应温度为85～95℃，回流反应时间为1.5～2.5h。

所述步骤3)中，溶剂1为醋酸酐，化合物3与醋酸酐的摩尔体积比为(0.1～1):10mmol/ml，硝酸与冰醋酸的混合比例为0.1:(2～5)，化合物3与混合溶液的摩尔体积比为0.5:2.1mmol/ml，缓慢加入的速度为(0.05～0.15)ml/min，反应时间为1.5～2.5h，反应温度为45～55℃；溶剂2为四氢呋喃，化合物4与溶剂2的摩尔体积比为(0.2～0.3):10mmol/ml，催化剂为10％pd/c，化合物4与催化剂质量比为(105～110):1，第二次反应时间为0.5～1.5h。

所述步骤4)中，溶剂为乙酸，化合物5与乙酸摩尔体积比为(0.2～0.3):15mmol/ml，回流反应温度为125～135℃，设定时间为4～5h。

所述步骤5)中，化合物6与化合物7的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)，溶剂为四氢呋喃，化合物6与溶剂的摩尔体积比为(0.2～0.3):5mmol/ml，反应时间为0.5～1.5h。

采用所述的荧光分子探针制备荧光试纸的方法，包括以下步骤：

1)以二氯甲烷为溶剂配制浓度为1mm的荧光探针溶液；

2)按照需要的尺寸裁剪滤纸片，然后将裁剪好的滤纸片浸泡在步骤1)中的荧光探针溶液中10min，取出后晾干，即得荧光试纸；荧光试纸在日光下为白色，在紫外灯下呈现蓝色荧光。

采用所述的荧光分子探针测试甲醛的方法，包括以下步骤：

在室温条件下，所述荧光探针溶解于有机溶剂与水按照一定比例的溶液中，将所述荧光探针浓度配置成10～50μm，将甲醛的水溶液加入到探针体系中，测定溶液荧光强度，通过荧光强度与甲醛浓度的线性关系测定甲醛的含量。

所述的有机溶剂为甲醇、n，n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或二甲基亚砜中的一种，所述的一定比例为1:1，探针体系的ph需要控制在3.0～7.4，检测甲醛时用370nm荧光作为激发光，监测和检测荧光变化范围为400～700nm。

所述的荧光分子探针在检测化学溶液体系、环境或生物组织中甲醛含量的应用

本发明的荧光分子探针检测甲醛的原理：本发明中的荧光分子探针采用了具有斯托克位移大、光学双稳态、荧光产量高、响应快等优点的esipt效应的荧光母核作为荧光团，可有效地减少荧光损失、自吸收、生物背景荧光等因素的干扰。在识别基团的选择上，本发明采用了新型甲醛响应机制作为识别基团；因为该类型探针能够捕获分析物分子，诱导区域特异性酰亚胺键裂解，同时释放捕获的fa(甲醛)分子，通过独特的pet/ict实现荧光开启响应和淬火机理(其具体的反应原理如图1所示)，真正实现了对甲醛无消耗检测，同时其响应速度也远远大于传统探针。

本发明的有益效果：1)本发明的荧光分子探针具有水溶性好，ph适用范围广，可以在酸性和中性水溶液中实现对甲醛的高灵敏度荧光检测，为该荧光探针在复杂环境中的检测提供有利条件。2)本发明的荧光探针具有esipt效应的荧光母核作为荧光团，减少荧光损失、自吸收、生物背景荧光达到有效提高检测灵敏度的作用。3)本发明的荧光探针分子及检测试纸的制备方法简单、成本低，有利于大规模生产。4)本发明的荧光探针用于检测甲醛，该探针对甲醛具有很好的选择性，苯甲醛、乙醛、丙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙二醛、丙酮、乙酸、甲醛等对甲醛的检测没有干扰，该探针溶液的荧光强度与甲醛的浓度在一定的浓度范围内(甲醛的浓度范围0-30μm)具有良好的线性关系，显示出定量检测特性，完全可以满足环境中甲醛的含量检测的要求。5)本发明的荧光探针对甲醛的响应时间短，测定的灵敏度高，抗干扰能力强，操作简单，成本低廉，使得其适合推广运用。6)本发明的荧光分子探针采用了新型甲醛响应机制作为识别基团，真正实现了对甲醛无消耗检测。

附图说明

图1本发明检测甲醛的原理图；

图2实施例2中(a)不同浓度甲醛浓度对应的荧光检测图；(b)浓度与荧光强度的标准曲线；

图3实施例3中荧光探针检测不同含醛溶液的荧光强度图；

图4实施例4荧光试纸测试甲醛的荧光试纸图。

具体实施方式

实施例1

本实施例制备的荧光探针结构式中的r1＝h，r2＝h。

本实施例的合成技术路线如下：

化合物2的合成

首先，称取靛红酸酐(1.0g,6.13mmol)置于350ml圆底烧瓶中，加入15ml冰醋酸，室温搅拌混匀，接着称取2-氨基苯硫酚(0.85ml,7.97mmol)加入反应体系中，然后将反应体系移至水浴环境下，水浴温度设置为90℃，反应时间2h。在反应过程中，反应体系由浑浊状态逐渐变为澄清状态，颜色由灰褐色逐渐变为橙黄色；tlc监测反应进程，原料暗斑点逐渐减少，产生极性较小的蓝色荧光点，副产物较少。待反应结束后，将反应体系移至室温环境下冷却，倒入200ml纯净水中，析出黄褐色沉淀，使用1m的氢氧化钠溶液调节体系的ph至近中性后，有大量黄褐色沉淀析出，减压过滤得到固体沉淀，并用100ml的饱和氯化钠溶液洗涤3次，并将收集到的滤饼置于烘箱中，在50℃下进行烘干除水。然后，将完全干燥的滤饼取出，用二氯甲烷溶解，加入100～200目硅胶拌样，采用200～300目硅胶进行柱层析分离纯化(pe/ea＝10/1,v/v)，得到黄褐色产物1.1g，即为化合物2(abt)，产率80.1％。

化合物3的合成

称取化合物2-abt(240mg,1mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入20ml吡啶作为反应溶剂，室温搅拌下，称取对甲苯磺酰氯(400mg,2mmol)加入圆底烧瓶中，水浴90℃下搅拌回流反应2小时。随着反应的进行，反应体系的颜色逐渐由浅黄色变为黄褐色。tlc监测反应进程，原料蓝色荧光点逐渐消失，产生极性增大的黄色荧光点。待反应结束后，将反应体系倒入200ml纯净水中，析出少量白色沉淀，使用5％的稀盐酸溶液调节体系的ph至近中性后，有大量白色沉淀析出。减压过滤得到固体沉淀，并用100ml的饱和氯化钠溶液洗涤3次，并将收集到的滤饼置于烘箱中，在50℃下进行烘干除水。然后，将完全干燥的滤饼取出，用二氯甲烷溶解，加入100～200目硅胶拌样，采用200～300目硅胶进行柱层析分离纯化(pe/dcm＝5/1,v/v)，得到白色产物384mg，即为化合物3-abtt，产率95.1％。

化合物5的合成

称取化合物3-abtt(190mg,0.50mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入10ml醋酸酐作为反应溶剂，并将反应体系移至水浴环境下搅拌反应，水浴温度设置为50℃。取0.1ml硝酸溶于2ml冰醋酸中，用微量进样泵缓慢的将硝酸的冰醋酸溶液加入反应体系中，加入速度为0.1ml/min，20min左右滴加完毕。加入完毕后，反应继续在50℃水浴条件下继续搅拌反应2小时。随着反应的进行，反应体系中的白色固体消失，逐渐呈现褐色浑浊状。tlc监测反应进程，原料黄色荧光点逐渐消失，产生极性增大的黄绿色荧光点。待反应结束后，将反应体系移至室温环境下冷却，倒入200ml纯净水中，有少量黄褐色沉淀析出，使用1m的氢氧化钠溶液调节体系的ph至近中性后，有大量黄褐色粘稠状固体沉淀析出。将体系进行简单过滤，固体用200ml二氯甲烷溶解，滤液用150ml二氯甲烷萃取三次，用饱和氯化钠溶液洗涤，混合有机相并用无水硫酸镁除水，减压蒸馏旋干溶剂，加入100～200目硅胶拌样，采用200～300目硅胶进行柱层析分离纯化(pe/dcm＝3/1,v/v)，得到淡黄色产物化合物4-abtt-no2。称取化合物4-abtt-no2(108mg,0.25mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入10ml四氢呋喃作为反应溶剂，称取1mg10％pd/c作为催化剂加入到反应体系中，将反应体系抽真空后通入氢气，反应时间1小时。随着反应的进行，反应体系的颜色逐渐由无色透明变为黄色。tlc监测反应进程，原料的黄绿色荧光点逐渐消失，产生极性增大的红色荧光点。待反应结束后，过滤除去pd/c，得到黄褐色的滤液。减压蒸馏除去四氢呋喃，加入100～200目硅胶拌样，采用200～300目硅胶进行柱层析分离纯化(pe/dcm＝1/3,v/v)，得到黄色产物42mg，即为化合物5-abtt-nh2，产率22.3％。

化合物6的合成

称取化合物5-abtt-nh2(100mg,0.25mmol)溶于15ml乙酸中，然后加入顺丁烯二酸酐(25.4mg,0.25mmol)，130℃油浴搅拌回流，此时可观察到黄色浊液，75min后变为橙黄清液，在经过4.5h后，取样，用二氯甲烷稀释并点板。反应基本完全，将反应体系转移至室温冷却。冷却后，将反应液倾倒入水中，加入碳酸氢钠水溶液，析出大量沉淀，抽滤并放入烘箱内干燥。用二氯甲烷溶解滤饼，加入100～200目硅胶拌样旋干，采用200～300目硅胶进行柱层析分离纯化，用石油醚压柱，干法上样。用pe：ea＝5：1洗脱杂点，pe：ea＝3：1洗脱产物。得到淡黄色固体产物46.1mg，即为化合物6-abtt-ma，产率为38.8％。

荧光分子探针的合成

称取化合物6-abtt-ma(120mg,0.25mmol)和苯乙胺(840μl,0.25mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入5ml四氢呋喃作为反应溶剂，并将反应体系移至冰水浴环境下搅拌反应，连续搅拌1h。tlc监测反应进程，反应基本完全。将反应体系取出，放至室温，将反应液倾倒入水中，抽滤并放入烘箱内干燥。用二氯甲烷溶解滤饼，加入100～200目硅胶拌样旋干，采用200～300目硅胶进行柱层析分离纯化，用石油醚压柱，干法上样。用pe：ea＝3：1到pe：ea＝1：1洗脱产物。旋干，得到黄色固体产物68.6mg，即为荧光分子探针，产率为47.3％。

根据荧光探针的结构式其化学命名为：n-(2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-(3-(苄基氨基)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基)-4-甲基苯磺酰胺。

实施例2

探针母液的制备

准确称取实施例1制备的荧光分子探针4.3mg，置于50ml的棕色容量瓶中，室温下，加入dmso:h2o＝1:1使其充分溶解，并定容到刻度线，得到的溶液为1mm的探针母液。

甲醛母液的制备：

使用移液枪准确量取37％的甲醛水溶液76ul和760ul；分别转移到10ml的容量瓶中，室温下，加入去离子水使其充分溶解，并定容到刻度线，得到的溶液为100mm和1000mm的甲醛母液。

荧光探针与甲醛的荧光响应

每次20μl取探针母液分别与0、6、10、20、30、40、60、100、200、240、300、360、400μl甲醛母液置于测试体系中，充分溶解，测试体系的总体积为2ml。测试体系中荧光探针的浓度为10μm，测试体系中甲醛的浓度分分别为0、3、5、10、15、20、30、50、100、120、150、180、200μm。将上述的测试体系充分响应后，进行荧光检测(λex＝365nm,λem＝525nm)，计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与甲醛浓度标准曲线，其结果如图2所示。

图2(a)为不同甲醛浓度荧光曲线图，可以看出，甲醛浓度越强，其在525nm处的荧光强度越强。根据甲醛浓度与荧光强度比值做标准曲线，其结果如图2(b)所示，标准曲线的线性相关度为r²＝0.941。

实施例3

使用实施例2中所制备的溶液作为荧光探针，并评价该探针对甲醛的选择性，该纳米探针的激发波长为365nm。我们选择了多种常见的小分子含醛化合物：1.苯甲醛、2.乙醛、3.丙醛、4.甲酸甲酯、5.甲酸乙酯、6.乙二醛、7.丙酮、8.乙酸、9.糠醛和10.甲醛并将其配制成水溶液加入至探针溶液中，浓度均为20μm，探针浓度为10μm，其中dmf：h2o＝1：1(v/v)，ph值为7.0，测其荧光发射光谱并记录525nm处荧光发射的强度。结果如图3所示，发现荧光探针只对甲醛在525nm处有明显的荧光增强，对其他测试小分子荧光变化微弱，说明其对甲醛具有优良的选择性。

实施例4

荧光试纸的制备：

1)以二氯甲烷为溶剂配制浓度为1mm的荧光探针溶液；

2)按照需要的尺寸裁剪滤纸片(尺寸为长×宽×厚尺寸为100～75mm×15～8mm×1～0.5mm的白色方形滤纸片)，然后将裁剪好的滤纸片浸泡在步骤1)中的荧光探针溶液中10min，取出后晾干，即得荧光试纸；

在检测时，将甲醛溶液(20μm)滴加在试纸上，5分钟后，在365nm波长紫外灯下可以看到试纸出现明显的黄绿色荧光。其结果如图4所示：滴加了甲醛溶液的一侧试纸产生荧光强度明显更强。说明该试纸通过荧光信号的产生对甲醛进行定性检测，能够对水中的甲醛进行快速定性检测。

最后，特别需要说明的是，以上举例仅是本发明的若干具体实施例。本发明显然不限于以上实例，本领域的相关技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。