一种酶法改性淀粉增强磷脂稳定性的方法与流程

本发明涉及一种酶法改性淀粉增强磷脂稳定性的方法，属于生物活性存储的
技术领域：
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背景技术：
：磷脂是人体细胞结构的主要成分，是维持人体正常生理功能必不可少的物质。磷脂既可以作为治疗多种疾病的活性成分，又可以作为制备含有各种药物制剂的调理剂。充足的磷脂能增强细胞的活力，对促进造血、伤口愈合、毛发生长、提高脑神经功能和增进消化能力有着重要的作用。然而磷脂含有的不饱和脂肪酸，在加工和储运过程中易发生脂质氧化反应、非酶促褐变以及参与美拉德反应等，这一系列反应生成的产物一方面引起产品的酸败，另一方面降低了磷脂类产品的商业价值，增加了其应用难度。为了使产品体系中的磷脂更加稳定，人们通常采用化学法，生物酶法及物理法对磷脂进行改性。磷脂的化学改性是将某些化学试剂与磷脂反应，使磷脂发生化学变化。常见的化学改性方法有乙酰化、羟基化、酰羟化、氢化、磺化等。经化学改性的磷脂虽然稳定性得到了一定的提升，但是其部分功能特性受到了影响。磷脂的生物酶法改性是指在特定的磷脂酶或脂肪酶作用下，磷脂分子会发生部分水解或酯交换反应，致使磷脂的组成或结构发生变化。用于磷脂改性研究的酶主要包括专一性的磷脂酶a1、a2、c、d和脂肪酶。然而，与化学法类似，生物酶法改变了磷脂分子的结构，从而影响了其理化及功能性质。磷脂的物理法改性通常是通过环糊精或直链淀粉等物质对其进行包合。物理法在整个过程中磷脂本身的化学结构没有变化，不影响磷脂的安全性，且并不会影响其功能特性，因此是一类绿色环保的稳定磷脂的方法。利用β-环糊精对磷脂进行包合时，由于β-环糊精溶解度较低，因此需要对其进行接枝改性，这也就提高了其生产成本，同时环糊精不易为人体消化，且具有一定的肾毒性也限制了其应用。利用直链淀粉对磷脂进行包合也能有效缓解磷脂的氧化，然而直链淀粉糊化所需温度较高，提取成本高且溶解性较差，限制了其工业化应用。与直链淀粉类似，支链淀粉的外侧链每6个葡萄糖残基可以形成一个螺旋结构，因此含有一个疏水的螺旋空腔，这个螺旋空腔可以用于包埋一些客体分子，例如姜黄素、单甘脂等，同时支链淀粉的溶解度比直链淀粉高。但是与直链淀粉相比，支链淀粉外侧链较短，长支链含量较少，因此形成的螺旋数量较少，且螺旋较短，对磷脂的包埋性能较差。有人提出，微生物来源4-α-糖基转移酶(4-α-glucanotransferase，简称4αgt，ec2.4.1.25)具有利用淀粉中的直链淀粉扩展支链淀粉的非还原性末端的功能。利用该功能，可以延长支链淀粉的侧链使其拥有与直链淀粉类似的疏水性空腔，增强支链淀粉的包埋能力。延长支链淀粉的侧链需要先将淀粉在高温下糊化，淀粉分子与水分子之间形成氢键，分子从颗粒内部游离出来，然后降温后加入4-α-糖基转移酶进行催化反应。但是现有的4-α-糖基转移酶仅能作用于低浓度的淀粉，生产强度低，无法满足工业上生产的需求。如vandermaarel在《anovelthermoreversiblegellingproductmadebyenzymaticmodificationofstarch》中利用4-α-糖基转移酶仅能作用于20％浓度的马铃薯淀粉。因此，提供一种能够作用于高浓度淀粉的4-α-糖基转移酶，且并利用其延长支链淀粉的侧链，对于工业上利用支链淀粉包埋磷脂的应用具有重大的意义。技术实现要素：为了解决上述存在的技术问题，本发明提供了一种改性淀粉从而提高其包埋磷脂效果的方法，该方法是通过发现了一个来源于热变形菌(thermoproteusuzoniensis)的4-α-糖基转移酶，该酶具有较好的温度稳定性和底物耐受性，使其能够在高温下催化高浓度的淀粉改性，延长其支链淀粉的侧链，在淀粉浓度高达30％(w/v)时，淀粉转化率仍高达92.9％，将得到的支链淀粉用于磷脂的包埋，包埋率最高可达42.7％。本发明的第一个目的是提供一种酶法改性淀粉增强磷脂稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将淀粉或淀粉衍生物加热糊化得到淀粉乳；(2)将淀粉乳温度降至40-90℃，调节ph至4.0-13.0，加入氨基酸序列如seqidno.1所示的4-α-糖基转移酶进行反应，干燥研磨得到改性淀粉；(3)将磷脂与改性淀粉混合均匀，30～60℃搅拌，干燥研磨得到改性淀粉-磷脂包合物。在一种实施方式中，所述反应温度为50-70℃。在一种实施方式中，所述淀粉的质量浓度是20％～30％。在一种实施方式中，所述反应时间为0.5-6h。在一种实施方式中，步骤(1)中所述淀粉为马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉或小麦淀粉；所述淀粉衍生物为de4-7麦芽糊精或de13.5-16.5麦芽糊精。在一种实施方式中，步骤(1)中所述淀粉乳中淀粉或淀粉衍生物质量浓度为5-300mg/g。在一种实施方式中，步骤(2)中所述酶添加量为酶/淀粉或淀粉衍生物0.005-6u/g。在一种实施方式中，所述加热糊化是指将淀粉或淀粉衍生物加热到80-100℃，搅拌15-60min得到淀粉乳。在一种实施方式中，步骤(2)中所述干燥为冷冻干燥、常压干燥、喷雾干燥、滚筒干燥或微波干燥。本发明还提供所述方法在制备药物、食品、化妆品或环境保护领域的应用。本发明的有益效果：(1)本发明的4-α-糖基转移酶，在65℃-80℃之间，该酶的相对酶活均保持在90％以上，具有较好的温度稳定性；(2)本发明的4-α-糖基转移酶，可以在高温60-90℃下催化淀粉改性，淀粉转化率高达80％以上；(3)本发明的4-α-糖基转移酶，可以催化10～30％(w/v)高浓度的淀粉改性，淀粉转化率高达90％以上；将得到的支链淀粉用于磷脂的包埋，包埋率最高可达42.7％。附图说明图1：4-α-糖基转移酶镍柱纯化结果。图2：酶的最适反应温度。图3：酶的最适反应ph。图4：4-α-糖基转移酶改性淀粉侧链分布。具体实施方式(1)4αgtase酶活测定方法取100μl适当稀释的酶液加入1％麦芽三糖(g3)溶液(50mm柠檬酸钠缓冲液配制，ph6.0)，75℃反应6h。沸水浴10min停止反应。采用葡萄糖氧化酶试剂盒法测定反应液中的葡萄糖含量。歧化活力定义为每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶的量。酶活单位定义为：每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶的量。(2)包埋的磷脂含量测定方法：精确称取50mg淀粉磷脂复合物于消化瓶中，加入6ml浓硫酸溶液，混合均匀，置于加热器上逐渐加热至瓶内复合物碳化完全，关闭加热器冷却至室温，缓慢滴加5～6滴30％的过氧化氢，继续加热至黑色完全消失，消化瓶内液体澄清透明，继续加热10min，关闭火源，消化完毕。将消化冷却后的样品液转移到100ml容量瓶中，并加蒸馏水至刻度，用移液管取10ml于50ml锥形瓶中，加入5ml钼酸钠稀硫酸溶液，摇匀静置几秒，加入2ml抗坏血酸溶液，混匀并置于90℃以上水浴锅中10min，取出冷却后转移到50ml容量瓶中并加蒸馏水至刻度，摇匀。用分光光度计在波长825nm处测定其吸光度，对照标准曲线，同时用做空白实验。计算方法见下式：式中：x为样品中磷脂总含量/％；m0为样品的质量/mg；m1为从标准曲线上确定的样品液中磷质量/μg；v1为样品消化后定容总体积/ml；v2为从v1中吸取的样品体积/ml；25为磷换算成磷脂的系数。(3)淀粉转化率的计算公式：式中：x为淀粉转化率；c0为原淀粉中直链淀粉含量；c1为酶改性后淀粉中直链淀粉含量。实施例1：酶的制备人工合成核苷酸序列如seqidno.2所示(氨基酸序列如seqidno.1所示)的基因片段，选用pet-28a质粒构建重组质粒，利用bl21表达菌株表达，经摇瓶发酵，离心沉淀，超声破壁得到粗酶，经过镍柱纯化最终获得4αgtase纯酶(见图1)。实施例2：酶的性质(1)酶的最适反应温度在不同温度下(50℃-90℃)测定4αgtase歧化活力以确定最适温度。4-α-糖基转移酶的最适反应温度为50～80℃。表14αgtase最适反应温度(2)酶的最适反应ph用不同ph值(3.0-10.0)的缓冲液代替4αgtase歧化测定方法中的缓冲液，在75℃下测定4αgtase活力，考察酶的最适ph。最适反应ph为5.0～8.0。表24αgtase最适ph的测定(3)酶的温度稳定性在不同温度(50℃-90℃)保温，每1h将部分酶液取出，迅速冷却，测定残留总酶活。结果表明：温度在65℃-80℃之间，该酶的相对酶活均保持在90％以上。表3温度稳定性测定实施例3酶催化温度对改性淀粉转化率的影响(1)将30％质量浓度的木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。(2)将温度分别降至50、60、70、80、90℃，ph调至6.0，按5u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应8h，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉，测定改性淀粉的直链淀粉含量。表4酶催化温度对改性淀粉转化率的影响催化温度(℃)5060708090转化率(％)68.585.991.987.180.7实施例4淀粉浓度对改性淀粉转化率的影响(1)分别将10％、20％、30％(w/v)浓度的木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。(2)将温度分别降至70℃，ph调至6.0，按5u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应8h，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉，通过测定改性淀粉中直链淀粉的含量确定改性淀粉的转化率。表5淀粉浓度对改性淀粉转化率的影响底物浓度10％20％30％转化率95.4％93.7％92.9％实施例5改性淀粉包埋磷脂(1)将30％质量浓度木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在90℃条件下完全糊化。(2)将温度降至70℃，ph调至7.0，按0.5u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应3h，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉，改性淀粉转化率为71.9％。(3)将磷脂与淀粉按1g磷脂/g淀粉的比例混合均匀，50℃搅拌，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉-磷脂包合物。(4)包埋率：取定量包埋磷脂的改性淀粉颗粒与定量水均匀混合，采用钼蓝比色法对包埋的磷脂含量进行测定。磷脂包埋率平均可达35.9％。实施例6改性淀粉包埋磷脂(1)将30％质量浓度木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。(2)将温度降至70℃，ph调至8.0，按2u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应6h，常压干燥，研磨得到改性淀粉。改性淀粉转化率为87.4％。(3)将磷脂与淀粉按2g磷脂/g淀粉的比例混合均匀，70℃搅拌，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉-磷脂包合物。(4)包埋率：取定量包埋磷脂的改性淀粉颗粒与定量水均匀混合，采用钼蓝比色法对包埋的磷脂含量进行测定。磷脂包埋率平均可达31.9％。实施例7改性淀粉包埋磷脂(1)将30％质量浓度木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。(2)将温度降至80℃，ph调至7.0，按5u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应4h，常压干燥，研磨得到改性淀粉。改性淀粉转化率为87.5％。(3)将磷脂与淀粉按5g磷脂/g淀粉的比例混合均匀，50℃搅拌，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉-磷脂包合物。(4)包埋率：取定量包埋磷脂的改性淀粉颗粒与定量水均匀混合，采用钼蓝比色法对包埋的磷脂含量进行测定。磷脂包埋率平均可达42.7％。实施例8改性淀粉包埋磷脂(1)将30％质量浓度木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。(2)将温度降至80℃，ph调至8.0，按10u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应3h，常压干燥，研磨得到改性淀粉。改性淀粉转化率为82.5％。(3)将磷脂与淀粉按5g磷脂/g淀粉的比例混合均匀，50℃搅拌，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉-磷脂包合物。(4)包埋率：取定量包埋磷脂的改性淀粉颗粒与定量水均匀混合，采用钼蓝比色法对包埋的磷脂含量进行测定。磷脂包埋率平均可达39.7％。实施例9改性淀粉包埋磷脂(1)将30％质量浓度木薯淀粉溶于ph7.0磷酸盐缓冲液中进行调浆，在120℃条件下完全糊化。(2)将温度降至90℃，ph调至7.0，按1u/g淀粉添加4-α-糖基转移酶，反应4h，常压干燥，研磨得到改性淀粉。改性淀粉转化率为72.9％。(3)将磷脂与淀粉按5g磷脂/g淀粉的比例混合均匀，50℃搅拌，冷冻干燥，研磨得到改性淀粉-磷脂包合物。(4)包埋率：取定量包埋磷脂的改性淀粉颗粒与定量水均匀混合，采用钼蓝比色法对包埋的磷脂含量进行测定。磷脂包埋率平均可达32.4％。表6改性淀粉包埋磷脂虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种酶法改性淀粉增强磷脂稳定性的方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>481<212>prt<213>人工合成<400>1metleuargglyalaglyileleuleuproleupheserleuprogly151015prohisglyileglyaspmetglyproalaalatyrargphevalglu202530pheleuargaspalaglyglnthrtyrtrpglnleuleuproleuasn354045provalleuproglutyraspasnserprotyrserserthrserser505560phealaglygluproalatyrileserleugluleuleualaglugln65707580glyvalleuargargseralaseralaglupheglyalaglyargala859095asptyrglualaalaargalatyrlysvallysileilealagluala100105110gluargprolysaspleuaspgluphevalglyargasnglutrpleu115120125gluasptyralaleutyrseralaleuargglutyrpheglyargpro130135140trpvalglutrpproarggluleuargaspargaspproalaalaleu145150155160argglntrpargglulysleuargargargilegluleuglutyrleu165170175leuglntyrphephetrpthrglntrparggluleulysarghisala180185190asnserleuglyilepheleuileglyaspleuproiletyrleuser195200205leuaspseralaaspvaltrpalahisarggluleuphelysleuasp210215220alagluglyargproleutyrvalalaglyvalproproasptyrphe225230235240serprothrglyglnleutrpglyasnprovaltyrasptrpaspala245250255metarglysgluglypheargtrptrpleuaspargleuargtyrthr260265270leuservalpheasptyrvalargleuasphispheargglytyrala275280285alatyrtrpgluvalproalaglyglulysthralavalasnglyarg290295300trpvalproalaproglyglygluleuleugluargalaargaspglu305310315320leuglyglyleulysileilealagluaspleuglytyrilethrpro325330335aspvalvalgluleuargaspargpheglyleuproglymetargval340345350leuglnphealatrpaspglyasnproalaasngluhislysprohis355360365asnhisvallysasnservalvaltyrthrglythrhisaspasnasn370375380thrilevalglytrpphepheargglualaserprolysalaargarg385390395400glualaleuglutyrmetglyargargseralalysaspilehistrp405410415alapheileargleualatyrpheservalalaaspvalalavalval420425430prometglnaspphemetglyleuglyproglualaargileasnarg435440445proglythrargglyglyasntrpvaltrpargmetthrgluleupro450455460glyargalaleualaargargileargargleualaargleutyrgly465470475480arg<210>2<211>1446<212>dna<213>人工合成<400>2atgctgaggggggcggggatccttctgcctctgttctccctcccgggcccccacgggatc60ggcgacatggggcccgccgcgtaccgattcgtggagttcttgagggatgccggccagacg120tattggcagctgttgcccctaaaccccgtgttgccggagtacgacaactcgccctacagc180tccacctcgtccttcgccggggagccggcgtacataagcctggagctcctggcggagcaa240ggcgtgttgaggagatccgcctcggcggaattcggggcgggccgcgccgattacgaagcc300gcgcgggcctacaaggtcaagataatcgccgaggcggagaggccgaaggacctcgacgag360ttcgtggggaggaacgagtggcttgaggactacgccctctactcggcgttgagggagtac420ttcggacggccttgggtggagtggccgagggagctgagggatagagatccggcggccttg480aggcagtggcgcgagaagttgcggaggaggatagagcttgagtacctcctccagtacttc540ttctggacgcagtggcgcgagctgaagcggcacgccaactcgctgggcatcttcctcata600ggcgacctcccgatatacctgagcctcgacagcgccgacgtgtgggcccacagagagctg660ttcaagctcgacgcggagggccggcccctatacgtggcgggggtgccgcccgactacttc720tcgcccaccggccagctgtggggcaaccccgtctacgattgggacgccatgaggaaggag780gggtttaggtggtggctcgacagactgaggtacacgctctcggtcttcgactacgtcagg840ctcgaccacttccgcggctatgccgcctactgggaggtgccggccggcgagaagactgct900gtgaacggccgctgggtccccgctccgggcggggagctcctggaaagggcgagggatgag960ctgggcgggctcaagataatcgcggaggatctcggctacataacgcccgacgtggtggag1020ctgagagaccgcttcgggttgccgggcatgagggtgctgcagttcgcctgggatggcaac1080ccggcgaacgagcacaagccccataaccacgtcaagaactcggtcgtctacacgggcacc1140cacgacaacaacacgatagtgggctggttcttccgcgaggcgtcccccaaggcgaggagg1200gaggcgttggagtacatgggcagacgctccgccaaggatatacactgggccttcataagg1260ctggcgtacttctcggtggccgacgtggccgtcgtgcctatgcaggacttcatggggctt1320gggccagaagcgcgtataaataggccgggaactagaggcggaaactgggtctggaggatg1380acagagctccccgggcgggcgttggccaggcggataaggcggctggcccggctctacggc1440cgttga1446当前第1页12