一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法及在干细胞美容、抗衰、修复和疾病治疗中的应用与流程

本发明属于干细胞领域，涉及干细胞外泌体的制备和应用，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法及在干细胞美容、抗衰、修复和疾病治疗中的应用。

背景技术：

外泌体于1983年首先由harding等在大鼠的网织红细胞中发现，随后在1985年pan等用电镜观察羊网织红细胞向成熟红细胞发育过程中同样发现了这种由细胞分泌的小囊泡，1987年johnstone等将这种小囊泡正式定义为“exosomes”，即外泌体。起初外泌体被认为仅仅是细胞清除的一些不需要的细胞组分，直到2007年valadi等人在外泌体中首次发现microrna和mrna等遗传物质，使得人们对外泌体的组成有了进一步的认识，同时人们也意识到外泌体可能是介导细胞间通讯的一种新机制，因此人们对外泌体的成分、形成机制、作用机制和功能进行了更深入的探索。参考文献：间充质干细胞来源外泌体促进损伤组织修复与再生的应用与进展，中国组织工程研究，2018年22卷1期。

干细胞在组织修复与再生方面具有广阔的应用前景，已被广泛应用于转化医学领域，但目前干细胞发挥作用的机制还不是十分清楚。近年来的多项研究表明，干细胞所发挥的组织修复与再生功能在很大程度上是由其旁分泌作用而实现的，而不是其在损伤部位的增殖和分化。同时，干细胞移植始终存在一定的潜在风险，如移植细胞引起血管栓塞、干细胞遗传物质变异、促进肿瘤转移以及致瘤致畸等问题。而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子，被越来越多的实验证明在组织损伤修复与再生方面起到关键作用。参考文献：间充质干细胞来源外泌体促进损伤组织修复与再生的应用与进展，中国组织工程研究，2018年22卷1期。

凌浩等发现，间充质干细胞源性外泌体是间充质干细胞分泌的同质性膜囊泡,含有大量且种类繁多的蛋白质、细胞因子和微小rna等生物活性物质,在心肌梗死、高血压、心力衰竭和心肌病等的防治方面有极高的应用前景。参考文献：间充质干细胞源性外泌体在心血管疾病中的研究进展，国际心血管病杂志，2018年05期。

陈晨等发现，间充质干细胞源性外泌体具有低免疫原性和长循环半衰期以及可携带小分子物质穿过血脑屏障等特点，能促进神经细胞生长和神经元分化等，有助于改善受损的神经系统功能和增强血管神经发生，成为治疗神经退行性疾病的新兴治疗手段。参考文献：间充质干细胞源性外泌体治疗神经退行性疾病:应用中的问题及未来前景，中国组织工程研究。

邢飞等发现，间充质干细胞外泌体通过作用于受体细胞进而调控其细胞活动，对骨、软骨、皮肤、神经等多种组织具有良好的修复功能。参考文献：间充质干细胞外泌体在骨科的应用，华西医学，2018年12期。

可见，干细胞外泌体的组织修复与再生作用使得其可以用于美容、抗衰和皮肤修复，干细胞外泌体的药理活性使得其可以用于疾病治疗。

但是，脐带间充质干细胞等mscs外泌体的分泌量较少，有必要提高其分泌量。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术中脐带间充质干细胞外泌体的分泌量较少的不足，提供一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，以提高其分泌量，用于美容、抗衰、修复和疾病治疗。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：取生长状态良好的huc-mscs，用完全培养基培养，收集细胞、洗涤，再用无血清α-mem培养基重悬，饥饿处理后收集上清，依次用300×g离心10min和29500×g离心20min再次收集上清，使用0.22μm滤膜过滤，最后用超速离心机120000×g离心1.5h收集沉淀，将沉淀用适量pbs重悬后，-80℃保存备用备用，所述完全培养基含有大豆卵磷脂。

优选地，所述完全培养基为含有10％胎牛血清的α-mem培养基。

优选地，大豆卵磷脂浓度为100μg/ml。

优选地，用含大豆卵磷脂的完全培养基培养48h。

优选地，细胞洗涤后再用无血清α-mem培养基重悬至细胞浓度为5×10⁵/ml。

优选地，饥饿处理72h后收集上清。

大豆卵磷脂用于促进脐带间充质干细胞外泌体分泌的用途。

上述制备方法制备得到的脐带间充质干细胞外泌体。

上述脐带间充质干细胞外泌体在干细胞美容、抗衰、修复或疾病治疗中的应用。

有益效果：

本发明提供的制备方法在维持外泌体纯度(以外泌体特异性跨膜蛋白cd9和cd81的含量为指标)基本不变的前提下，可以显著提高脐带间充质干细胞外泌体的分泌量，可用于干细胞美容、抗衰、修复或疾病治疗。

附图说明

图1为huc-mscs的流式检测结果；

图2为huc-mscs外泌体的电镜观察图，a为大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，b为无大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体；

图3为huc-mscs外泌体的westernblot检测结果，a为大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，b为无大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，c为大豆卵磷脂培养组120000×g离心1.5h的上清液，d为无大豆卵磷脂培养组120000×g离心1.5h的上清液。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。

一、实验材料

脐带组织取自健康剖宫产孕妇，4℃保存，24h内进行脐带间充质干细胞的分离与培养。产妇本人签署知情同意书，声明所取脐带仅可用于科学研究。

细胞培养箱为thermofisherscientific产品。

流式细胞仪为美国bdbiosciences产品。

胎牛血清为美国gibco公司产品，α-mem培养基为hyclone公司产品，胰酶购自碧云天。

流式鉴定使用到的荧光标记流式抗体cd14-pe、cd31-fitc、cd34-pe、cd44-fit、cd45-fitc、cd90-fitc、cd105-pe、hla-dr-pe为beckman产品。

bca试剂盒购自碧云天。

低温冰箱为thermofisherscientific产品。

二、实验方法

1、huc-mscs的分离培养、鉴定

按照本领域常规操作方法，无菌操作台内将脐带剪成3-5cm小段，用生理盐水充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的残存血液，剔除静脉、动脉。将脐带沃顿胶剪碎成0.5-1.0mm³的组织块，均匀平铺在直径100mm的无菌培养皿中，置于37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中，约1～2h后待组织块略干燥能牢固贴于培养皿壁上时，缓慢加入含10％胎牛血清的α-mem培养基(完全培养基)，使培养液浸泡组织块，继续培养，每隔3～4d换液1次，待细胞克隆长至80％-90％融合时，用0.05％胰酶消化传代至新的无菌培养皿中。

流式鉴定方法如下：取生长状态良好的第5代脐带间充质干细胞，经洗涤、过滤、固定、荧光抗体标记、再洗涤，流式细胞仪上样，检测表面标记物cd14、cd31、cd34、cd44、cd45、cd90、cd105和hla-dr的表达率。

2、huc-mscs外泌体的提取、分泌水平测定、电镜观察和平均粒径测定

外泌体提取具体方法为：取生长状态良好的第5代huc-mscs，用含有100μg/ml或不含有大豆卵磷脂的完全培养基培养48h，收集细胞、洗涤，再用无血清α-mem培养基重悬至细胞浓度为5×10⁵/ml(为便于比较，两组各取20ml细胞悬液进行后续处理和外泌体提取，平行操作三份)，饥饿处理72h后，收集上清，依次用300×g离心10min和29500×g离心20min再次收集上清，使用0.22μm滤膜过滤，最后用超速离心机120000×g离心1.5h收集外泌体，将提取的外泌体用500μlpbs重悬后，-80℃保存备用。

用bca试剂盒对分离纯化的外泌体进行蛋白定量，计算产量，评价外泌体分泌水平。

取适量外泌体悬液，无大豆卵磷脂培养组稀释100倍，大豆卵磷脂培养组稀释500倍，按常规方法制样后于电镜下观察并照相。使用nanosight-ns500按照仪器使用说明书上机进行纳米粒子特性分析，测量外泌体的平均粒径。

3、huc-mscs外泌体的纯度测定

外泌体的膜蛋白富含跨膜蛋白家族cd9和cd81，因此我们利用westernblot测定cd9和cd81的含量来评价huc-mscs外泌体的纯度，具体方法为：用bca试剂盒测定pbs悬液的蛋白浓度，取含有30μg蛋白的pbs悬液，氮吹，加入5×loadingbuffer50μl，沸水浴5min，冷却后取40μl加入加样孔，用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维膜，用封闭液室温封闭1h，加入一抗鼠抗人cd9和cd81，于4℃孵育过夜，洗膜15min×3次，加入hrp标记的二抗室温孵育1h，洗膜15min×3次，ecl增强发光试剂显色后，于凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。内参为β-actin。

4、数据处理

实验结果数据以均值±标准偏差表示，采用spss17.0软件进行分析。不同组之间的比较采用t检验，p＜0.05代表差异有统计学意义。

三、实验结果

1、huc-mscs的流式鉴定结果

流式鉴定结果如图1所示，huc-mscs中cd44、cd90、cd105阳性表达，cd14、cd31、cd34、cd45和hla-dr阴性表达，符合人脐带间充质干细胞的特点。

2、huc-mscs外泌体的分泌水平

bca法对分离纯化的外泌体进行蛋白定量，无大豆卵磷脂培养组每1×10⁷个huc-mscs收集得到外泌体约为(645±58)μg，大豆卵磷脂培养组每1×10⁷个huc-mscs收集得到外泌体约为(3593±286)μg，大豆卵磷脂培养组huc-mscs外泌体的分泌水平提高了5倍之多。

3、huc-mscs外泌体的电镜观察和平均粒径测定结果

电镜观察结果如图2所示，其中a为大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，b为无大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，两组huc-mscs外泌体均呈圆形或椭圆形，直径约30～100nm，有完整的包膜结构，内含低密度物质。经nanosight-ns500测定，大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体平均粒径为(75.9±26.5)nm，无大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体平均粒径为(76.4±25.2)nm，平均粒径无显著差异。

4、huc-mscs外泌体的westernblot测定结果

westernblot测定结果如图3所示，其中a为大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，b为无大豆卵磷脂培养组的huc-mscs外泌体，两组huc-mscs外泌体中cd9和cd81均呈阳性表达，表达水平无显著差异，说明两组huc-mscs外泌体纯度基本一致。

上述实施例表明，本发明制备方法在维持外泌体纯度(以外泌体特异性跨膜蛋白cd9和cd81的含量为指标)基本不变的前提下，可以显著提高脐带间充质干细胞外泌体的分泌量，可用于干细胞美容、抗衰、修复或疾病治疗。

上述实施例用来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。