一种大豆灰斑病离体叶片鉴定方法与流程

本申请涉及遗传育种技术领域，具体涉及一种大豆灰斑病离体叶片鉴定方法。

背景技术：

大豆灰斑病是一种危害严重，发生范围广的世界性大豆真菌病害，严重威胁大豆的生产。在我国，尤以东北三省发生最为严重，严重发生年份可使大豆减产30％左右。目前，防治大豆灰斑病最经济、安全有效的方法是选育并利用抗病品种，因此，高效准确鉴定抗病种质的方法对于选育抗病品种具有重要意义。目前大豆灰斑病的鉴定方法包括田间孢子喷雾法、室内大豆灰斑病菌毒素法和菌丝块离体叶接种鉴定法，三种鉴定大豆灰斑病的方法各有优缺点，受到每种方法的技术手段、成本及操作难度的限制难以在实验室内小范围多重复简单准确的进行接种鉴定实验，尤其在被测品种样本容量大的情况下，如进行较准确重复性较好的大规模种质资源抗灰斑病鉴定的难度很大。

目前大豆灰斑病的鉴定方法包括田间孢子喷雾法、室内大豆灰斑病菌毒素法和菌丝块离体叶接种鉴定法，以上鉴定方法均存在明显的不足之处，难于在实验室中广泛应用，其中田间孢子喷雾法易受时间和空间限制、鉴定结果重复性差、准确性低且易对植株造成毁灭性伤害；室内大豆灰斑病菌毒素法的鉴定结果同大田鉴定结果的基本符合率较低(62.37％)；菌丝块离体叶接种鉴定法的发病率较差，对鉴定环境要求高。

技术实现要素：

本发明提供一种基于高压水枪处理的大豆灰斑病离体叶片鉴定方法，该方法克服田间鉴定易受时间、空间等环境因素的干扰影响；克服田间鉴定喷雾处理叶片不均匀引起的鉴定结果准确性低；克服田间鉴定重复性较差的问题。

本发明提供的大豆灰斑病离体叶片鉴定方法，按照以下技术方案实现：

(1)取待测品种大豆叶片预处理；

(2)将预处理后的大豆叶片置于保持叶片正常存活的环境下；

(3)用高压水枪对步骤(2)所得叶片进行蒸馏水喷打压力处理；

(4)用高压喷雾器将灰斑病原菌孢子悬浮液均匀喷洒到步骤(3)所得叶片表面进行接种；

(5)步骤(4)所得叶片培养14天后统计叶片发病情况，从而判定待测品种的抗病性。

步骤(1)所述大豆叶片预处理，具体为：选取同一位节生长势相近的新鲜大豆完全展开叶，将带柄三出复叶剪下后再将三出复叶的三片小叶分别剪下，用无菌水冲洗干净。

步骤(2)所述保持叶片正常存活的环境，制备方法为：在容器底部铺设纱布，纱布上铺设厚度为8.32-9.71mm且厚度均匀的脱脂棉层，脱脂棉层上铺设表层纱布，向容器内加入蒸馏水，浸润纱布及脱脂棉，加水量以达到纱布和脱脂棉的最大持水量为准。

步骤(1)预处理后的叶片，按品种号有序地将叶片正面朝上摆放在步骤(2)所述保持叶片正常存活的环境的表层纱布表面，叶柄与表层纱布紧密接触，叶片之间水平/垂直距离为5-7cm。

步骤(3)所述高压水枪处理，具体为：使高压水枪的出水方向垂直于叶片表面，边向叶片表面喷水边移动，移动方式为：对同一叶片，横向移动完成全部叶片表面的喷水处理后，再纵向移动完成全部叶片表面的喷水处理，最后以螺旋方式移动，完成全部叶片表面的喷水处理。

步骤(3)所述高压水枪处理，高压水枪额定排气压力为0.7Mpa。

步骤(3)所述高压水枪处理，高压水枪枪头与叶片的距离为20-25cm。

所述灰斑病原菌孢子悬浮液的制备方法为：将灰斑病原菌接种到平板PDA培养基上，活化培养；将活化好的灰斑病菌随PDA培养基琼脂块切成小块，并接种到高粱粒培养基上，扩繁培养，取完成扩繁的高粱粒培养基倒入蒸馏水中，水面高于高粱粒10.0cm，揉搓将菌丝洗下，纱布过滤，取滤液为灰斑病原菌孢子悬浮液。

所述活化培养，培养条件为24-28℃恒温培养7d；所述扩繁培养，培养条件为24-28℃恒温培养14d。

所述灰斑病原菌孢子悬浮液孢子浓度为1×106个/mL。

PDA培养基制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g蔗糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，定容至1000ml分装，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟，冷却至40℃，超净工作台内倒入直径9cm培养皿中，自然冷却凝固，备用。

高粱粒培养基制备方法：取未脱粒的高梁种子1000g，蒸馏水冲洗后，加水煮沸30分钟后，将高梁分装到250ml三角瓶的100ml刻线处，封口，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟，备用。

步骤(4)所述高压喷雾器喷头与叶片表面垂直，喷头与步骤(2)所述保持叶片正常存活的环境中的容器底部的距离为5.5cm。

步骤(4)所述接种需进行2次，每次接种需进行喷洒10次，每次喷洒灰斑病原菌孢子悬浮液体积与喷洒的叶片总面积的比例为0.2-0.5mL/cm2。

步骤(4)接种完成后，叶片用透明保鲜膜密封。

步骤(5)所述培养，培养温度为24-28℃，叶面湿润期为48h，培养期间向保持叶片正常存活的环境中补充蒸馏水，保持水量达到纱布和脱脂棉的最大持水量。

有益效果

本发明所提供的大豆灰斑病离体叶片鉴定方法是基于高压水枪和高压喷雾器对大豆离体叶片做孢子悬浮液接种处理的鉴定方法，该方法具有环境可控、鉴定准确、显症时间更短，显症效果更好等特点，克服现有鉴定方法的易受时间、空间限制、鉴定结果重复性差、易对植株造成毁灭性伤害等缺点，可用于大豆抗灰斑病种质资源筛选，选育抗源为抗病育种提供优异亲本；为抗病基因挖掘提供服务，并为相关分子分析奠定基础；便于实验室内做鉴定处理，可少重复鉴定数量有限的转基因品种材料的抗病性；可区分同种病原物不同生理小种对大豆品种侵染的差异性。

本发明提供的方法与现有田间孢子接种鉴定方法相比，具有如下优势：

1无需进行二次接种，节省人工和财力；

2操作简便易行，利用高压水枪对叶片进行压力喷打处理，模拟田间植株间摩擦在叶片上造成的机械损伤，为灰斑病菌孢子完成侵染提供条件；

3不受年份间自然条件变化的影响，可在室内进行接种鉴定，环境可控；

4鉴定结果重复性好，稳定性高；

5显症时间更短，显症效果更好，准确性高，更易判断病情等级；

6可区分同种病原物不同生理小种对大豆品种侵染的差异性；

7对环境友好，不易造成大面积的环境污染；

8理论上可对任意大豆品种材料进行抗病性鉴定分析和比较。

附图说明

图1不同叶面湿润期处理下病斑面积的比较；

图2钢化塑料白盆和支撑物的正、侧面图片。

具体实施方式

制备PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g蔗糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，定容至1000ml分装，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟，冷却至40℃，超净工作台内倒入直径9cm培养皿中，自然冷却凝固，备用。

制备高粱粒培养基：高粱粒培养基制备方法：取未脱粒的高梁种子1000g，蒸馏水冲洗后，加水煮沸30分钟后，将高梁分装到250ml三角瓶的100ml刻线处，封口，高压蒸汽灭菌(121℃)灭菌20分钟，备用。

制备例1制备灰斑病原菌孢子悬浮液

将4℃冰箱内保存的灰斑病原菌(东北农业大学植物病理学教研室)接种到平板PDA培养基上，活化培养7d(培养条件：于恒温培养箱内，25℃条件培养7d)。将活化好的灰斑病菌随PDA培养基琼脂块切成小块，并接种到高粱粒培养基上，扩繁培养14天(培养条件于恒温培养箱内，25℃条件培养14d)。

一次取5瓶完成扩繁的高粱粒培养基(瓶内病粒体积为100ml)，将瓶内高粱粒倒入2000ml的塑料烧杯内，在烧杯内可观察到高粱粒的体积约为500ml，基础加入蒸馏水225ml，刚好使菌粒都能浸泡在蒸馏水中；后再加水120ml，使水面上升10.0cm(即2000ml的塑料烧杯上，100ml的高度)，最终塑料烧杯内水和高粱粒所占的总体积约为600ml。适宜力度揉搓菌粒，将菌丝洗下，过大力度易导致高粱粒破损形成小颗粒碎块，增加过滤时孢子悬浮液的浪费体积。在另一个2000ml的塑料烧杯上用皮筋固定4层纱布来过滤孢子悬浮液，可得菌液200ml，因初始过滤纱布为干燥状态，浸湿纱布会消耗部分菌液。重复以上操作，因纱布过滤能力较初次过滤减弱，部分菌液浪费，可得180ml菌液。经统计，15瓶高粱粒培养基，共需加水约1040ml，经过滤，可得到510ml的孢子悬浮液。

把孢子悬浮液配成3种浓度，分别为6×104个/ml/、6×105个/ml和1×106个/ml。

制备例2制备保持叶片正常存活的环境

制作标准鉴定白盆的盆底支撑物

将内径为41.5×27.5×5.5cm，外径为46×32×5.5cm的钢化塑料白盆清洗干净，取宽约20.5cm的纱布卷(展开宽度为82cm)和宽约30cm的成卷脱脂棉，根据标准鉴定白盆内径的长，剪下约41.5cm长的纱布块；根据鉴定白盆内径的长和宽，撕取所需脱脂棉。将剪下的纱布于鉴定白盆内横向展开，将撕取的脱脂棉平整地铺满整个纱布表面，脱脂棉的厚度为9mm左右，再将展开的纱布放回盆内，置于脱脂棉之上，使脱脂棉夹在纱布中间，形成脱脂棉和纱布混用物作为盆底支撑物，并将脱脂棉和纱布混用物的盆底支撑物压实。

向鉴定白盆内加蒸馏水时，依据脱脂棉和纱布混用物的盆底支撑物厚度不同，每次加水体积并不固定，一般围绕总水量800ml上下浮动。需从中间至四周加水，将鼓起不平的脱脂棉处推平，尽量使整个平面平整无凸起部位。应注意，在离体鉴定实验预处理时，要以保持叶片正常存活的最低需水量为标准来制作盆底支撑物。通常保持表层纱布湿润即可。

实施例1

植物材料及供试菌种

植物材料为感病品种大豆合丰45，供试菌种为黑龙江省优势灰斑病生理小种7号小种(东北农业大学植物病理学教研室)。

选取同一位节生长势相近的新鲜大豆完全展开叶，将带柄三出复叶剪下后再将三出复叶的三片小叶按顺序分别剪下，用无菌水冲洗干净，按品种号整齐有序地将叶片正面朝上摆放在标准鉴定白盆内的表层纱布表面，上下左右均留5-7cm长的空白距离。在摆放时应注意，将叶片的叶柄向下轻压，使叶片叶柄与盆底支撑物紧密接触，叶片能够更好地吸收水分，以维持良好的生命状态。

用高压水枪对叶片进行蒸馏水喷打压力处理；用高压喷雾器将灰斑病原菌孢子悬浮液均匀喷洒到叶片表面进行接种；所得叶片培养14天后统计叶片发病情况，从而判定待测品种的抗病性。

所述高压水枪处理，具体为：使高压水枪的出水方向垂直于叶片表面，边向叶片表面喷水边移动，移动方式为：对同一叶片，横向移动完成全部叶片表面的喷水处理后，再纵向移动完成全部叶片表面的喷水处理，最后以螺旋方式移动，完成全部叶片表面的喷水处理。高压水枪额定排气压力为0.7Mpa。高压水枪枪头与叶片的距离为20cm。

所述高压喷雾器喷头与叶片表面垂直，喷头与盆底的距离为5.5cm。孢子悬浮液浓度分别为6×104个/ml/、6×105个/ml和1×106个/ml。所述接种需进行2次，每次接种需进行喷洒10次，每次喷洒灰斑病原菌孢子悬浮液体积约12ml。接种完成后，叶片用透明保鲜膜密封。最后所述接种后培养，培养温度为28℃，叶面湿润期为48h，培养期间向保持叶片正常存活的环境中补充足量的蒸馏水保证叶片存活。

菌悬液浓度的优化：

把接种的孢子悬浮液配成3种浓度，分别为6×104个/ml/、6×105个/ml和1×106个/ml。结果表明孢子悬浮液浓度为1×106个/ml时，具有蛙眼特征的病斑明显且迅速，可作为大豆灰斑病离体叶片高压喷雾法的接种浓度(表1)。

表1不同孢子悬浮液浓度接种效果的比较

实施例2

温度的优化

与实施例1不同之处在于：孢子悬浮液浓度为1×106个/ml，接种后培养温度分别设定为24℃、26℃、28℃进行平行试验。

在不同温度条件下，对感病品种合丰45进行大豆灰斑病离体叶片高压喷雾法的接种鉴定，7d后，统计合丰45在不同温度下病斑面积占离体叶片面积的比值，结果表明不同温度条件下接种病斑扩展面积和离体叶片面积比值差异达到显著水平，说明不同温度对灰斑病菌侵染有显著的影响。同时，结果还表明在最适灰斑病生长温度的25-28℃范围中，随着温度的升高病斑扩张速度也加快(表2)。综上，同时考虑菌丝和大豆生长的最适温度，选择28℃作为接种菌丝体的最适温度。

表2温度对接种病斑面积占离体叶片面积比值的影响

实施例3

叶面湿润期的优化

与实施例2的区别在于：接种后培养温度选定28℃，分别设定叶面湿润期为12h、24h、36h、48h、60h、72h进行平行试验。

设计6种不同叶面湿润期的处理，分别为叶面湿润12h、24h、36h、48h、60h、72h。结果表明，在28℃最适接种温度下，叶面湿润期为12h时叶片不发病；在叶面湿润期24h时叶片上出现病斑，但数量较少；叶面湿润期为24-48h时叶片病斑面积增长迅速；叶面湿润期为48-72h时病斑面积尽管仍增加但增加缓慢(图1)。蛙眼病斑面积在48h，60h和72h叶面湿润期差异并不显著。综合接种环境温度较高、水分蒸发较快，因此，选择48h作为接种菌丝体的叶片湿润期。

实施例4

叶片不同生长状态对侵染的影响

与实施例3的区别在于：选择48h作为接种菌丝体的叶片湿润期，分别选取幼叶、正在扩展的叶片、完全展开的叶片、老化的叶片作为待测叶片进行平行试验。

对不同生长状态的叶片对侵染的影响进行分析，结果表明取幼叶或正在展开叶片用于接种鉴定时，其不易发病且在离体状态下不易存活；当选取老化叶片时虽离体存活时间较长，但其发病症状较轻，也不适合用来做离体鉴定；而完全展开叶片离体存活时间长且显症迅速且稳定，因此选取完全展开叶片进行接种鉴定(表3)。

表3不同生长状态叶片的接种效果比较

实施例5

高压水枪处理压力的筛选

与实施例4的区别在于：选取完全展开的叶片作为待测叶片，选取高压水枪枪头与叶片的距离分别为：10-15cm、15-20cm、20-25cm、25-30cm，进行平行试验。

高压水枪具有额定排气压力为0.7Mpa，但可通过改变高压水枪和叶片之间的处理距离的方式来调控喷打压力。在不同处理距离条件下对感病品种合丰45进行压力测试分析，结果表明不同压力下的高压水枪对叶片造成的损伤程度不同，当高压水枪枪头距离叶片较近(10-15cm和15-20cm)时容易对叶片表面造成较大的损伤；而20-25cm处理距离为适宜的处理压力，其可对叶片造成适当微伤口，满足病原菌对叶片的侵染要求；而25-30cm处理距离，其对叶片造成的压力较小，其制造的伤口无法满足鉴定需要。因此，选择20-25cm处理距离作为最佳处理距离，即适宜的处理压力(表5)。

表5不同压力强度对叶片损伤程度的比较

对大豆灰斑病常见鉴定容器内支撑物滤纸、蛭石、纱布、脱脂棉的单用和混用的支撑效果进行比较分析，研究表明滤纸的持水性较差且不具备可塑性；蛭石和纱布的混用物无法保证支撑物具备稳固性；纱布的持水性较好但可塑性较差。脱脂棉和纱布的混用物可使支撑物具备良好的吸水性、持水性、可塑性和稳固性。标准鉴定白盆和支撑物如图2所示。

实施例6

通过实施例5得到最佳方案，即在实施例5基础上，取高压水枪枪头与叶片的距离为：20-25cm。

利用最佳方案对72份种质资源进行离体鉴定验证并同大田鉴定结果做比较(或大豆灰斑病离体叶片高压喷雾法的验证)

1田间自然发病调查

根据表6所示的抗性评价标准进行抗病性评价，具体为：首先对每个病叶的病斑面积进行估计，根据病斑面积确定叶片病情等级，并进一步计算病情指数，并根据病情指数确定抗病级别，病情指数计算公式如下：

表6大豆灰斑病田间抗性评价标准

大田鉴定72份种质资源，鉴定结果如表7所示。在鉴定的种质资源中，病情指数在61-80之间的感病材料占大多数，有44份，占供试材料的61.11％。中抗品种有18个，占供试材料的25.00％；高感品种有10个，占供试材料的13.89％；无高抗和抗病品种。

表7大豆品种田间自然发病调查结果

2本发明方法准确性的验证

使用最佳方案对48个大田自然发病中已经调查出抗感病等级的种质资源进行进一步验证，比较48个品种大田自然发病和温室离体鉴定的实验结果表明(表7)：温室和大田抗病等级均为中抗的品种有10个，中抗品种鉴定的符合度为83.33％；温室和大田抗病等级均为感病的品种有26个，感病品种鉴定的符合度为81.25％；温室和大田抗病等级均为高感的品种有4个，高感品种鉴定的符合度为100％，即共有83.33％的品种温室和大田的抗病等级相同，符合度较好，验证了本发明提供的方法的可靠性和准确性。且在温室的显症时间更短，显症效果更好，更容易判断叶片的病情等级。

表7相同品种大田自然发病和温室鉴定结果的比较

注：MR＝中抗S＝感病HS＝高感

3本发明方法平行性的验证

使用最佳方案对剩余的24个大田自然发病中已经调查出抗感病等级的品种进行室内接种鉴定，比较24个品种相同处理不同批次间的温室离体鉴定结果表明(表8)：大田和温室三批抗病等级均为中抗的品种有4个，室内不同批次之间中抗品种的总符合率为83.33％；大田和温室三批抗病等级均为感病的品种有5个，室内不同批次之间感病品种的总符合率为80.56％；大田和温室三批抗病等级均为高感的品种有2个，室内不同批次之间高感品种的总符合率为81.25％。由此可见，相同品种重复试验3次鉴定出的抗病等级相同或相近，鉴定结果的平均符合度较高，实验结果较稳定，不同批次间的平均符合率为81.71％；批次和批次间的平行性较好，验证了本发明提供的鉴定方法的平行性和稳定性。

表8相同品种大田调查和温室平行性实验的比较

注：MR＝中抗S＝感病HS＝高感

以上验证结果说明本发明经过筛选和优化得到的鉴定方法是可靠，准确且稳定的。