一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产PHB的应用的制作方法

本发明涉及一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产phb的应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术：

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha)是一类由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。生长环境c:n比例越高，越有利于pha的合成。pha在胞内以疏水性颗粒的形式存在，在特定条件下其含量可以超过细胞干重的90％。pha根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。由于pha可由可再生资源为原料合成，进入自然界后可以被细菌等生物完全降解，替代常规石油基塑料可以缓解严重的“白色污染”问题，从而引起世界各国科学界和工业界的广泛重视。

聚3-羟基丁酸酯(phb)是pha中的一种，大肠杆菌常用于phb的工业生产。phb是一种胞内产物，phb颗粒是胞内的碳源储存物质，以不溶性微球状颗粒状形式存在于细胞质中。phb合成受到很多调控，如c:n比例，当碳过剩、氮缺乏时，phb更易合成，当胞内其他c源代谢旺盛时，或者氨基酸转运酶活低时，phb合成会受到影响。大肠杆菌合成phb的关键在于平衡产物和细胞生长，既要使得细胞生长好，又要增强其合成途径的代谢流，并通过控制产物形成途径的表达水平来提高产量。而原始大肠杆菌菌株合成phb的产量一般为细胞干重的0～50％，现有报道中主要通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善phb的合成。但是这些方法使得phb产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高phb合成的方法，对于进一步提高phb的合成具有十分重大的意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种生产聚3-羟基丁酸酯(phb)的重组菌，敲除大肠杆菌基因组上脂多糖的核心糖基因簇gmhd-waaq和o-抗原基因簇wbbl-rmlb，胞外多糖基因簇galf-wza，4型荚膜多糖合成基因簇yccc-ymcd，三个鞭毛基因簇flhe-mota、fliy-flir、flgn-flgl，和一个菌毛基因簇fimb-fimh；并将β-酮基硫解酶，乙酰辅酶a还原酶和phb合成酶的编码基因转化到菌株中。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌w3110。

在一种实施方式中，所述核心糖基因簇gmhd-waaq含有14个基因，分别为waaq，waag，waap，waas，waab，waao，waar，waay，waaz，waau，waal，waac，waaf，gmdd(rfad)，其序列的ncbi登录号依次为“bae77660.1”，“bae77661.1”，“bae77662.1”，“bae77663.1”，“bae77664.1”，“bae77665.1”，“bae77666.1”，“bae77667.1”，“bae77668.1”，“bae77669.1”，“bae77670.1”，“bae77671.1”，“bae77672.1”,“bae77673.1”。

在一种实施方式中，所述o-抗原基因簇wbbl-rmlb含有11个基因，分别为wbbl::is5，wbbk，wbbj，wbbi，wzy，glf，wzx，rmlc，rmla，rmld，rmlb，其序列登录号依次为“baa15873.1”，“baa15874.1”，“baa15875.1”，“baa15876.1”，“baa15877.1”，“baa15878.1”，“baa15879.1”，“baa15880.1”，“baa15881.1”，“baa15882.1”，“baa15883.1”，“baa15884.1”。

在一种实施方式中，所述胞外多糖基因簇galf-wza含有21个基因，分别为wza，wzb，wzc，wcaa，wcab，wcac，wcad，wcae，wcaf，gmd，wcag，wcah，wcai，manc，manb，wcaj，wzx，wcak，wcal，wcam，galf，其基因序列的ncbi登录号依次为“bae76576.1”、“bae76575.1”、“baa15913.1”、“baa15912.1”、“baa15911.1”、“bae76574.1”、“bae76573.1”、“bae76572.1”、“baa15910.1”、“baa15909.1”、“baa15908.1”、“baa15907.1”、“baa15906.1”、“baa15905.1”、“baa15901.1”“baa15900.1”、“baa15899.1”、“bae76571.1”、“baa15898.1”、“baa15897.1”、“baa15896.1”。

在一种实施方式中，所述4型荚膜多糖合成基因簇yccc-ymcd含有7个基因，分别为yccc，etp，yccz，ymca，ymcb，ymcc，ymcd，其基因序列的ncbi登录号依次为："baa35746.1"，"baa35747.2"，"baa35748.1"，"baa35749.1"，"baa35750.2"，"baa35751.1"，"baa35752.2"。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇flhe-mota包含flhe、flha、flhb、chez、chey、cheb、cher、tap、tar、chew、chea，motb，mota共13个基因；所述鞭毛基因簇fliy-flir包含fliy，fliz，flia、flic、flid、flis、flit、amya、yedd、yede、yedf、yedl，yedn，yedm，intg、flie、flif、flig、flih、flii、flij、flik、flil、flim、flin、flio、flip、fliq、flir共30个基因；所述鞭毛基因簇flgn-flgl包含flgn、flgm、flga、flgb、flgc、flgd、flge、flgf、flgg、flgh、flgi、flgj、flgk、flgl共14个基因；所述菌毛基因簇fimb-fimh包含fimb、fime、fima、fimi、fimc、fimd、fimf、fimg、fimh共9个基因。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇flhe-mota包含的flhe、flha、flhb、chez、chey、cheb、cher、tap、tar、chew、chea，motb，mota基因，序列ncbi上登录号分别为"baa15687.1"、"baa15688.2"、"baa15696.1"、"baa15697.1"、"baa15698.1"、"baa15699.1"、"baa15700.1"、"baa15701.1"、"baa15702.1"、"baa15703.1"、"baa15709.1"、"baa15710.1"、"baa15711.1"。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇fliy-flir包含的fliy，fliz，flia、flic、flid、flis、flit、amya、yedd、yede、yedf、yedl，yedn，yedm，intg、flie、flif、flig、flih、flii、flij、flik、flil、flim、flin、flio、flip、fliq、flir基因，序列ncbi上登录号分别为"baa15740.1"、"baa15741.1"、"baa15742.1"、"baa15751.1"、"baa15752.2"、"baa15753.1"、"baa15754.1"、"baa15755.1"、"baa15756.1"、"baa15757.1"、"baa15758.1"、"bae76552.1"、"bae76553.1"、"bae76553.1"、"bae76553.1"、"baa15760.1"、"baa15763.1"、"baa15764.1"、"baa15765.1"、"baa15766.1"、"baa15767.1"、"baa15768.1"、"baa15769.1"、"baa15770.1"、"baa15771.1"、"baa15772.2"、"baa15773.1"、"baa15774.1"、"baa15775.1"。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇flgn-flgl包含的flgn、flgm、flga、flgb、flgc、flgd、flge、flgf、flgg、flgh、flgi、flgj、flgk、flgl基因，序列ncbi上登录号分别为"baa35878.1"、"baa35879.1"、"baa35880.1"、"baa35881.1"、"baa35882.1"、"baa35883.1"、"baa35885.2"、"baa35886.1"、"baa35887.1"、"baa35888.2"、"baa35889.1"、"baa35890.1"、"baa35891.1"、"baa35892.1"。

在一种实施方式中，所述菌毛基因簇fimb-fimh包含的fimb、fime、fima、fimi、fimc、fimd、fimf、fimg、fimh基因，序列的ncbi上登录号分别为"bae78305.1"、"bae78306.1"、"bae78307.1"、"bae78308.1"、"bae78309.1"、"bae78310.1"、"bae78311.1"、"bae78312.1"、"bae78313.1"。

在一种实施方式中，所述β-酮基硫解酶的proteinid为qbk40993.1；所述乙酰辅酶a还原酶的proteinid为qbk40994.1；所述phb合成酶的proteinid为qbk40992.1。

在一种实施方式中，所述转化是将含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶a还原酶和phb合成酶的编码基因的phb合成基因簇phacab连接到表达质粒上后，转化到宿主大肠杆菌中。

在一种实施方式中，所述基因簇phacab的序列的ncbi登录号为“qbk40992.1”。

本发明的第二个目的是提供一种生产phb的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成包括：20g/l葡萄糖，17.1g/lna2hpo4·12h2o，3g/lkh2po4，0.5g/lnacl，添加1mmmgso4，0.1mmcacl2，10mg/ml维生素b1。

本发明还提供所述重组菌或所述方法在药物制备、材料或环保领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明敲除野生型大肠杆菌w3110基因组上脂多糖的核心糖基因簇δgmhd-waaq和o-抗原基因簇δwbbl-rmlb，胞外多糖基因簇galf-wza，4型荚膜多糖合成基因簇yccc-ymcd，三个鞭毛基因簇flhe-mota、fliy-flir、flgn-flgl，和一个菌毛基因簇fimb-fimh最终得到菌株wjw08，然后将β-酮基硫解酶，乙酰辅酶a还原酶和phb合成酶的编码基因转化到菌株中得到重组菌wjw08/pbhr68。在正常的发酵条件下重组菌wjw08/pbhr68可以合成细胞干重81.9％的phb，phb体积产量是野生对照菌w3110/pbhr68(1.5％)的54.6倍。

生物材料

野生型大肠杆菌w3110购买自atcc，保藏编号为atcc39936。

大肠杆菌wjw00(基因型为e.coliw3110δgmhd)已经于专利《一种产kdo2-lipida的基因工程菌及其构建方法和应用》(公布号：cn103820377a，公开日：2014.05.28)中公开，其是在野生型大肠杆菌w3110中，敲除核心糖中l-d-庚糖合成关键基因gmhd(又名rfad)获得。

表1菌株

表2序列表

附图说明

图1：大肠杆菌基因簇。

图2：质粒pdtw202-cat的构建。

图3：lps精简菌株wjw02的构建。

图4：pcr验证wjw02的构建；泳道1：在w3110中敲除基因簇waaq-gmhd；泳道2：在w3110中敲除基因簇wbbl-rmlb；泳道3和4：野生菌w3110对照。

图5：pcr验证基因簇yccc-ymcd的敲除。

图6：细胞形态的观察。

图7：细胞的生长曲线。

图8：重组菌株wjw08/pbhr68和对照菌w3110/pbhr68合成phb的摇瓶发酵。

具体实施方式

(1)基因的敲除方法

采取组合式位点特异性重组方法和crispr/cas9敲除系统两种方法进行大片段基因簇敲除。其中，组合式位点特异性重组方法如图1所示，在靶基因簇的一端通过red重组引入loxl-kan片段，接着在另一端通过red重组引入cat-loxr片段，然后通过cre酶表达，识别位点loxl和loxr，进行位点重组，并采用amp抗性筛选，通过抗性验证获得无kan、cm抗性的转化子，进一步采用pcr验证基因型，确定转化子正确无误。采用frt位点的精简方法类似，在靶基因簇的两端引入frt位点(可以为两个)，然后通过flp酶表达，识别frt位点，通过抗性筛选即可获得正确敲除突变株。flp酶可以不断识别frt位点，直到将不含必需基因的最远端frt位点重组。

crispr/cas9敲除系统的工具质粒pcas和ptargetf购买于淼灵质粒公司。敲除流程参考jiang等的方法(jiang,y.,chen,b.,duan,c.,et.al.multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system[j].applenvironmicrobiol,2015,81(7):2506-1410.1128/aem.04023-14)。具体敲除流程为：首先向大肠杆菌出发菌w3110中转入pcas质粒，然后进行l-阿拉伯糖诱导后制备电转感受态，以备敲除；其次需要通过重叠pcr连接上下游同源臂构建敲除片段；再通过ptargetf质粒重构建引入20nt与目的基因靶序列相同的n20序列，构建敲除质粒ptargetf-gene；将敲除片段和敲除质粒同时电转入含有pcas的相应菌株中，进行筛选获得敲除转化子，最后去除敲除质粒和pcas，获得正确无抗无痕敲除突变株。

(2)phb产量测定方法

将发酵液倒入离心管中静止放置2h，弃去上清后，冷冻菌体，并冷冻干燥。称取一定量冷冻干燥菌体进行甲酯化，采用已报道的常规甲酯化方法甲酯化，最后进行常规气象色谱定量。

(3)发酵参数测定方法

①od和ph测定

用去离子水调零，调整稀释倍数至在比色皿中测的od600在0.2至0.8之间。待示数稳定后记录读数，乘以稀释倍数，即得od。

对刚取的发酵样品直接进行ph测定，采用ph计测定直接读数。

②残糖测定

sba-40c生物传感器是通过葡萄糖分子和反应膜上的受体结合所反映出电信号变化来定量葡萄糖浓度的；测定方法是将样品10000rpm离心2min，将20μl上清液加入到总体系为1000μl的待测体系中，并剧烈震荡均匀；准确吸取25μl标样(含有1g/l葡萄糖)快速打入进样孔内，等待仪器平衡后，待指示灯不闪烁后，重复3针以上，均基本一致，视为定标完成；准确吸取25μl样品快速打入进样孔内，记录仪器显示屏指数，除以2即得残糖数值。

③phb的提取和测定

取不同发酵时间的phb合成细胞，离心收集5ml细胞，采用ph7.4的pbs缓冲液洗涤两次，离心收集后，将细胞转移到预先准确称重的离心管中，包上保鲜膜，并扎出多个小洞，使得水分可以蒸干，又避免菌液喷出，在真空冷冻干燥机中冻干48h至完全干燥，一般触摸管底为常温状态，表明已经完全干透，或者用手指轻弹管底，菌体可以散开并轻易脱离管壁，则视为菌体完全干燥。称重量，计算出干重。

称取1-10mg完全干燥的干菌体，同时称取phb标准样品约10mg转移至预先准确称重的酯化管中，以便准确计算称得的样品重量。然后进行酯化操作，加入2ml甲醇(含有3％硫酸)和2ml氯仿，加上酯化管盖子并盖紧，期间可以超声，帮助样品散开，使得酯化更彻底，沸水浴6h以上。大约半小时后，即可观察到phb标样一般以粉末形式迅速熔化。若未观察到半小时后标准品的形态变化与溶解，则应更换整套试剂，甲醇和氯仿的变质都会导致酯化无法正常进行，而更换新开封的试剂往往可以解决上述问题，经过六小时沸水浴后，在通风橱中冷却充分后，小心打开酯化管并加入1ml去离子水，这时需要分别将盖子旋紧并激烈震荡至体系完全充分混匀，此时将酯化管置于通风处中静置3h以上以分相，分相后，上层为水相，下层为有机相，取适量有机相加入到气相样品瓶中，盖紧盖子保持密封，保存在-80℃中。气相色谱是定量phb含量的准确灵敏的手段。气相定量采用岛津gc2010气相色谱，使用安捷伦dbwax30m-0.32mm气相色谱柱和火焰离子化检测器，进样温度为250℃。以不同量的商业化phb作为标样绘制各标准样品的标准曲线。

实施例1工程菌wjw00的构建

工程菌wjw00已经在sci论文《constructionandcharacterizationofanescherichiacolimutantproducingkdo2-lipida》中公开(公开日：2014年3月13日)。具体构建过程如下：

(1)gmhd基因敲除片段的获得

采用化学全合成或pcr分步扩增的方法获得gmhd基因敲除片段，其两端为gmhd基因上下游同源臂、中间为带有frt位点的kan片段。gmhd基因敲除片段的核苷酸序列如seqidno.2所示。将gmhd基因敲除片段克隆到质粒pbluescriptiisk(+)，获得重组质粒pbluescriptiisk(+)-gmhdu-fkan-gmhdd。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段gmhdu-fkan-gmhdd。

(2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有red重组辅助质粒pkd46(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌w3110(atcc39936)于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mllb液体培养基，30℃，200rpm培养至od600＝0.2时加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导重组酶的表达，继续培养至od600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50ml离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1ml10％甘油悬浮，每管80μl分装至预冷的无菌ep管中。

将500-1000ng的gmhd敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/ml卡那霉素及100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，pcr验证，将得到的菌株命名为wjw00-fkan。

(3)突变株抗性标记的去除

将pcr验证阳性的菌株接种含30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为w3110△gmhd::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pcp20质粒(cherepanovpp,wackernagelw.genedisruptioninescherichiacoli:tcrandkmrcassetteswiththeoptionofflp-catalyzedexcisionoftheantibiotic-resistancedeterminant.gene,1995,158(1):9-14)，42℃热激表达flp酶，将阳性菌株于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导flp重组酶的表达，介导frt位点特异性重组，pcr验证挑选转化子。结果见图1，在大肠杆菌wjw00，wjw00-fkan和w3110染色体中gmhd区域周围扩增的dna片段大小分别为552，1854和889bp。

将pcr验证正确的菌株42℃热激后划线lb平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，对两种抗生素均敏感的菌株即为e.coliw3110△gmhd，将其命名为wjw00并保藏。

实施例2lps精简菌株wjw01的构建

脂多糖(lipopolysaccharide，lps)包括类脂a、核心糖和o-抗原三部分，其中类脂a为高度保守区，而核心糖和o-抗原由不同的糖分子组成。其中核心糖合成基因簇包含14个基因，分别是waaq，waag，waap，waas，waab，waao，waar，waay，waaz，waau，waal，waac，waaf，gmdd。在实施例1得到的菌株wjw00基础上继续敲除核心糖基因簇gmdd(gmhd)-waafc-waaqgpsboryzul中除gmhd基因外剩余的13个基因。

(1)参照实施例1中gmhd基因的敲除过程敲除waaq基因

1)waaq基因敲除片段的获得

采用化学全合成或pcr分步扩增的方法获得waaq基因敲除片段，其两端为waaq基因上下游同源臂、中间为带有frt位点的kan片段。waaq基因敲除片段的核苷酸序列如seqidno.3所示。将waaq基因敲除片段克隆到pbluescriptiisk(+)，获得重组质粒pbluescriptiisk(+)-waaqu-fkan-waaqd。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段waaqu-fkan-waaqd。

2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有red重组辅助质粒pkd46(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌w3110(atcc39936)于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mllb液体培养基，30℃，200rpm培养至od600＝0.2时加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导重组酶的表达，继续培养至od600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50ml离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1ml10％甘油悬浮，每管80μl分装至预冷的无菌ep管中。

将500-1000ngwaaq敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/ml卡那霉素及100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，pcr验证结果。

3)突变株抗性筛选

将pcr验证阳性的菌株接种含30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为wjw00△waaq::kan并保藏。

(2)核心糖基因簇的敲除

步骤(1)得到的菌株wjw00△waaq::kan基因组上存在三个frt位点，分别为gmhd敲除遗留的1个frt位点和waaq敲除引入的抗性标记两端的2个frt位点。

以菌株wjw00△waaq::kan为出发菌株做感受态，转入pcp20质粒(cherepanovpp,wackernagelw.genedisruptioninescherichiacoli:tc^randkm^rcassetteswiththeoptionofflp-catalyzedexcisionoftheantibiotic-resistancedeterminant.gene,1995,158(1):9-14)，42℃热激表达flp酶，将阳性菌株于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导flp重组酶的表达，介导所有的frt位点特异性重组，因此将三个frt位点重组后，不仅删除了卡那霉素抗性标记，也删除了gmhd和waaq之间的所有基因。

采用引物waaq-u-f和gmhd-d-rpcr验证挑选转化子，将pcr验证正确的菌株42℃热激后划线lb平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为wjw01并保藏。

表3引物序列表

实施例3lps精简菌株wjw02的构建

o-抗原合成基因簇rmlbrmlbdacx-glf-wbbhijkl包含11个基因，分别是wbbl::is5，wbbk，wbbj，wbbi，wzy，glf，wzx，rmlc，rmla，rmld，rmlb。在wjw01基础上进一步敲除o-抗原合成基因簇后获得wjw02。具体操作如下：

(1)工具质粒pdtw202-cat的构建

o-抗原基因簇wbbl-rmlb的敲除采取loxlr位点特异性重组方法。因此在构建大肠杆菌基因组精简系统时，需要构建1个工具质粒pdtw202-cat。该质粒的构建过程具体为：

1)以质粒pdtw109(参见谭延振的硕士学位论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建》3.2.1节，公开日：2012.03.27)为模板，利用引物tac-m-cat-f和tac-m-cat-r，扩增带有tac-m-cat基因盒，并以酶切位点smai进行单酶双切，得到抗性片段以备连接。

2)以工具质粒pdtw202质粒(参见谭延振的硕士学位论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建》2.4.2节，公开日：2012.03.27)为模板，利用引物pdtw202-loxre-f和pdtw202-loxle-r，扩增不含有kan抗性基因片段的剩余质粒片段，也采用smai进行单酶双切，所扩增的质粒片段带有loxl和loxr特异性位点。

3)将步骤1)与步骤2)中得到的片段利用t4连接酶进行连接，构建得到带有loxl-cat-loxr基因盒的质粒pdtw202-cat(见图2)，其含带有较强启动性的氯霉素抗性基因cat，可以用于基因簇敲除筛选标记。酶切和pcr验证均正确。

(2)wbbl和rmlb基因的敲除

1)wbbl和rmlb基因敲除片段的获得

wbbl基因敲除片段的构建：采用化学全合成或pcr分步扩增的方法获得wbbl基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pdtw202为模板，采用引物wbbl-u-loxle-kan和wbbl-d-kan直接扩增获得wbbl敲除片段，该敲除片段只含有loxl位点，而不含有loxr位点。wbbl基因敲除片段的核苷酸序列如seqidno.4所示。

rmlb基因敲除片段的构建：采用化学全合成或pcr分步扩增的方法获得rmlb基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pdtw202-cat为模板，采用引物rmlb-u-cat和rmlb-d-loxre-cat直接扩增获得rmlb敲除片段，该敲除片段只含有loxr位点，而不含有loxl位点。rmlb基因敲除片段的核苷酸序列如seqidno.5所示。

2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有red重组辅助质粒pkd46(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌w3110(atcc39936)于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mllb液体培养基，30℃，200rpm培养至od600＝0.2时加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导重组酶的表达，继续培养至od600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50ml离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1ml10％甘油悬浮，每管80μl分装至预冷的无菌ep管中。

将500-1000ngwbbl敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/ml卡那霉素及100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，采用引物wbbl-f和wbbl-rpcr验证结果。正确菌株命名为wjw01δwbbl::loxl-kan。

在wjw01δwbbl::loxl-kan菌株中进一步敲除rmlb基因，将500-1000ngrmlb敲除片段加入感受态细胞中，涂布30μg/ml氯霉素的lb固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/ml卡那霉素及30μg/ml氯霉素的lb液体培养基中培养，采用引物rml-f和rml-rpcr验证结果。

将pcr验证阳性的菌株接种含30μg/ml卡那霉素及30μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/ml卡那霉素及30μg/ml氯霉素的lb固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性和氯霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为w3110△wbbl::kan△rmlb::cat并保藏。

(3)o-抗原合成基因簇的敲除

步骤(2)得到的菌株w3110△wbbl::kan△rmlb::cat基因组上存在1个loxl位点和1个loxr位点。以此为出发菌株做感受态，转入pkd-cre质粒(韩雅宁硕士毕业论文《合成不同结构类脂a分子的大肠杆菌的构建》，公开日：2013-12-31)，表达cre酶，将阳性菌株于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导cre重组酶的表达，介导loxl和loxr位点特异性重组，不仅删除了卡那霉素抗性标记和氯霉素抗性标记，也删除了wbbl和rmlb之间的所有基因。采用引物wbbl-f和rmlb-r进行pcr验证，将pcr验证正确的菌株42℃热激后划线lb平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的敏感性，选取对三种抗生素均敏感的菌株命名为wjw02并保藏。

精简菌株wjw02的基因型经过pcr验证正确，而对照野生型的片段太长，扩增不出条带，说明精简菌株wjw02的lps基因簇已经被成功删除。

表4引物序列表

实施例4精简菌株wjw03的构建

采用上述实施例3中wjw02构建方法，在wjw02基础上进一步敲除胞外多糖合成及转运基因簇(包含wza，wzb，wzc，wcaa，wcab，wcac，wcad，wcae，wcaf，gmd，wcag，wcah，wcai，manc，manb，wcaj，wzx，wcak，wcal，wcam，galf共21个基因)，获得wjw03。由于在w3110基因组上，胞外多糖合成及转运基因簇和o-抗原合成转运基因簇紧邻，即galf的紧邻基因为o-抗原合成基因rmlb，因此在单敲除wbbl并已经引入loxle位点的菌株中继续敲除wza，并引入loxre，再进行位点特异性重组删除wbbl和wza之间所有的基因和抗性标记基因，最终去除pkd-cre质粒获得无抗突变株wjw03。具体步骤如下：

(1)wza敲除片段的构建

wza基因敲除片段的构建：采用化学全合成或pcr分步扩增的方法获得wza基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pdtw202-cat为模板，采用引物wza-d-cat和wza-d-loxre-cat直接扩增获得wza敲除片段，该敲除片段只含有loxr位点，而不含有loxl位点。wza基因敲除片段的核苷酸序列如seqidno.6所示。

表5引物序列

(2)接下来的敲除步骤同实施例3，最终得到菌株w3110δgmhd-waaqδwbbl-rmlbδgalf-wza，将其命名为wjw03。

实施例5精简菌株wjw04的构建

采用crispr/cas9敲除的方法，在wjw03菌株中敲除4型荚膜多糖合成基因簇yccc-ymcd(包含yccc，etp，yccz，ymca，ymcb，ymcc，ymcd共7个基因)，其中yccc-ymcd基因敲除片段的核苷酸序列如seqidno.7所示，验证正确后得到菌株w3110δgmhd-waaqδwbbl-rmlbδgalf-wzaδyccc-ymcd，将其命名为wjw04。

敲除过程需要构建1个敲除质粒ptargetf-yccc-ymcd和一个含有上下游同源臂的敲除片段，构建过程具体为：

①通过网站http://crispr.mit.edu/的分析，选取20nt与目的基因靶序列互补的n20序列(参见表6引物ptargetf-yccc-ymcd-f的下划线序列)。

②以质粒ptargetf为模板，使用正向引物ptargetf-yccc-ymcd-f(5’端为步骤(1)中的n20序列)和反向引物ptargetf-r，扩增后去磷酸化并连接得到引入了n20序列的敲除质粒ptargetf-galf-wza。

表6引物序列

③同源臂敲除片段的构建

以w3110基因组为模板，用同源臂引物yccc-ymcd-u-f/yccc-ymcd-u-r，yccc-ymcd-d-f/yccc-ymcd-d-r分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，并用重叠pcr的方法连接，得到基因簇yccc-ymcd的敲除片段(核苷酸序列如seqidno.1所示)。

表7引物序列

④基因的电转敲除

向大肠杆菌wjw03/pcas感受态细胞中加入100ng敲除质粒ptargetf-yccc-ymcd和500ng敲除片段电转复苏培养。用引物yccc-ymcd-u-f/yccc-ymcd-d-r进行菌落pcr验证(图2)。

⑤敲除质粒ptargetf-yccc-ymcd和温敏质粒pcas的去除

通过iptg诱导去除敲除质粒ptargetf-yccc-ymcd的酶表达，筛选出对壮观霉素敏感的单菌落，即得到去除ptargetf-yccc-ymcd敲除质粒的突变菌株。将去除敲除质粒的突变菌株接至lb试管，42℃振荡培养，在lb平板上划线分离单菌落。筛选出对卡那霉素敏感的单菌落，即得到去除pcas的无抗突变菌株，将其命名为wjw04。

实施例6精简菌株wjw05、wjw06、wjw07和wjw08的构建

采用实施例5类似的方法，敲除大肠杆菌wjw04的鞭毛合成及转运基因簇flhe-mota，获得wjw05；采用crispr/cas9敲除系统敲除大肠杆菌wjw05的鞭毛合成及转运基因簇fliy-flir，获得wjw06；采用crispr/cas9敲除系统敲除大肠杆菌wjw06的鞭毛合成及转运基因簇flgn-flgl，获得wjw07。采用crispr/cas9敲除系统敲除大肠杆菌wjw07的菌毛合成及转运基因簇fimb-fimh，获得wjw08。其中基因簇flhd-mota、fliy-flir、flgn-flgl和fimb-fimh敲除片段的核苷酸序列分别如seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10和seqidno.11所示。

验证正确后得到菌株w3110δgmhd-waaqδwbbl-rmlbδgalf-wzaδyccc-ymcdδflhe-motaδfliy-flirδflgn-flglδfimb-fimh，将其命名为wjw08。

实施例7菌株wjw08和w3110的细胞形态和生长曲线

lb培养基组成：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l和nacl10g/l。

m9g培养基的组成：20g/l葡萄糖(glucose)，17.1g/l十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)，3g/l磷酸二氢钾(kh2po4)，0.5g/l氯化钠(nacl)，添加1mm硫酸镁(mgso4)，0.1mm氯化钙(cacl2)，10mg/ml维生素b1(vb1)。

(1)在lb固体平板培养14h后，进行磷钨酸负染进行透射电镜观察。发现精简菌株的细胞形态较野生型w3110有很大变化。首先野生型w3110的细胞呈杆状，周围有鞭毛结构，菌毛结构和胞外多糖分泌物；而精简菌株wjw08的细胞大小明显增大，约增大1倍，且细胞表面无鞭毛结构、菌毛结构和胞外多糖分泌物，细胞表面和周围较干净。

(2)采用基本培养基m9g培养菌体，并测定其生长曲线。

结果表明：精简菌株wjw08较野生对照w3110生长加快，尤其是对数期，od600一直高于w3110，甚至高出1倍，进入稳定期时间为10h，与w3110一致，15h时达到最高od600，为3.33，此时较w3110提高15.2％。结果表明一系列膜壁结构相关合成和转运基因簇的删除，使得精简菌株wjw08的生长明显变好，有利于生物量增加，有利于工业生产应用。

实施例8重组菌w3110/pbhr68、wjw08/pbhr68的构建

(1)质粒pbhr68的构建

质粒pbhr68公开于sci论文(spiekermann,p.,rehm,b.h.,kalscheuer,r.,baumeister,d.,steinbuchel,a.,1999.asensitive,viable-colonystainingmethodusingnileredfordirectscreeningofbacteriathataccumulatepolyhydroxyalkanoicacidsandotherlipidstoragecompounds.arch.microbiol.171(2),73-80，公开日：1999.01.17)，其含有phacab基因簇并含有氨苄青霉素抗性标记，其中phacab基因簇含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶a还原酶和phb合成酶的编码基因。

(2)感受态的制备

分别接种大肠杆菌w3110(atcc39936)、wjw00～wjw06于lb液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接到50mllb液体培养基，37℃，200rpm培养至od600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50ml离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01m的cacl2洗涤3次，最后用1ml0.01m的cacl2悬浮，加入1m30％甘油混匀，每管200μl分装至预冷的无菌ep管中。

(3)转化

将100-200ng的质粒pbhr68加入感受态细胞中，涂布100μg/ml氨苄霉素的lb固体平板，37℃培养，挑取转化子验证正确后分别命名为w3110/pbhr68、wjw08/pbhr68。

实施例9重组菌发酵生产phb

lb培养基组成：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l和nacl10g/l。

m9g培养基的组成：20g/l葡萄糖(glucose)，17.1g/l十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)，3g/l磷酸二氢钾(kh2po4)，0.5g/l氯化钠(nacl)，添加1mm硫酸镁(mgso4)，0.1mm氯化钙(cacl2)，10mg/ml维生素b1(vb1)。

(1)种子液培养

分别挑取1环实施例4中得到的重组菌w3110/pbhr68、wjw08/pbhr68菌苔至25mllb培养基中，并添加100μg/ml氨苄青霉素，37℃、200rpm培养5h至对数中期。

(2)发酵合成phb

培养方法：将种子液(od600＝1.8左右)按照初始od600＝0.25转接至常规phb发酵培养基m9g，并加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/ml，37℃、200rpm，发酵48h。

结果表明：精简菌株重组菌wjw08/pbhr68合成phb占细胞干重比达到81.9％，较野生对照菌提高54倍；细胞干重达到5.03g/l，较野生对照菌提高2.8倍；葡萄糖转化率达到0.356g/g，较野生对照提高147倍。该结果说明精简菌株wjw08可以显著促进phb的合成，在工业生产应用有良好的应用前景。

表8菌株的摇瓶发酵

虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产phb的应用

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