一种表达瑞替普酶rPA的细胞株及方法与流程

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种以人源细胞分泌表达瑞替普酶rpa的新方法。

背景技术：

当前，血栓栓塞是严重危害人类健康的常见心血管疾病，给病患个人、家庭及社会带来沉重负担。溶栓治疗是目前治疗血栓栓塞疾病的最有效手段。而瑞替普酶rpa是临床应用较好的第三代溶栓药物，rpa是人组织纤溶酶原激活剂tpa的缺失突变体，是一个单链非糖基化蛋白，分子量为39kda，含9对二硫键。临床上，rpa更容易作用于血栓内部，纤溶效果强、起效迅速。

鉴于栓塞病人的逐年增长，临床上对瑞替普酶的需求量非常高。然而当前制备瑞替普酶的工艺主要是以大肠杆菌瞬时表达。该工艺生产的瑞替普酶多以包涵体形式存在，包涵体没有生物学活性，必须经复性才有活性。然而包涵体复性损失量大，并且分子不均一。此外大肠杆菌表达产物常混有内毒素等致热源物质，临床使用需要特定工序清除致热源。另外有应用酵母、哺乳动物细胞生产瑞替普酶，成本高、周期长且得率较低。

本发明采用慢病毒载体将包含分泌信号的瑞替普酶编码基因序列整合至人源细胞293f中，筛选可稳定分泌表达瑞替普酶的细胞株，由此得到的瑞替普酶可溶性表达、不含内毒素，且分泌表达简化后续纯化工艺，真正做到一步纯化，活性鉴定也表明以此方法制备的瑞替普酶具有较好生物学活性。

技术实现要素：

在一个方面，本发明提供了一种表达瑞替普酶rpa的方法，包括如下步骤：将包含编码瑞替普酶基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞；培养所述宿主细胞用于表达瑞替普酶；分离得到所述瑞替普酶。

在一个方面，所述宿主细胞为人源细胞。

在一个或多个实施方式中，所述人源细胞为293细胞，优选的，为293f细胞。

在一个实施方式中，所述慢病毒颗粒由plenti-rpa-puro质粒包装得到。

在一个或多个实施方式中，所述质粒携带分泌信号及编码瑞替普酶的cdna序列。

在一个实施方式中，所述cdna序列为：seq.idno.2。

在一个实施方式中，其中，所述瑞替普酶的氨基酸序列为：seq.idno.1。

在一个方面，本发明还提供了一种稳定高效表达瑞替普酶rpa的细胞株，由包含编码瑞替普酶基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞得到，所述宿主细胞为人源细胞，优选的为293细胞，更优选的，为293f细胞。

在一个实施方式中，所述瑞替普酶的氨基酸序列为：seq.idno.1。

在一个实施方式中，所述慢病毒颗粒由plenti-rpa-puro质粒包装得到。

在一个或多个实施方式中，所述质粒携带分泌信号及编码瑞替普酶的cdna序列。

在一个实施方式中，所述cdna序列为：seq.idno.2。

在另一个方面，本发明还提供了一种表达瑞替普酶rpa的方法，包括如下步骤：将慢病毒颗粒lenti-rpa-puro感染人源胚胎肾细胞293f，筛选得到高抗性的293f细胞株；筛选表达瑞替普酶的高抗性的单克隆细胞株293f-rpa；检测瑞替普酶表达量；验证表达高浓度且高活性rpa的单克隆细胞株。

在一个实施方式中，所述慢病毒颗粒由plenti-rpa-puro质粒包装得到。

在一个或多个实施方式中，所述质粒携带分泌信号及编码瑞替普酶的cdna序列，所述分泌信号选自引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。

在一个实施方式中，所述cdna序列为：seq.idno.2。

在一个实施方式中，所述高抗性的293f细胞株通过梯度浓度的嘌呤霉素筛选得到。

在一个实施方式中，以倍比稀释培养法筛选表达瑞替普酶的高抗性的单克隆细胞株293f-rpa。

在一个实施方式中，以酶联免疫方法检测瑞替普酶表达量。

在一个实施方式中，以溶栓法检测瑞替普酶活性，验证表达高浓度且高活性rpa的单克隆细胞株。

在一个实施方式中，其中，所述瑞替普酶的氨基酸序列为：seq.idno.1。

附图说明

图1是上清中rpa的免疫印迹鉴定。1：293f-rpa1#细胞株表达上清；2：293f-rpa2#细胞株表达上清；3：293f-rpa3#细胞株表达上清；4：空病毒感染的293f细胞表达上清。

图2是rpa的溶栓活性检测。1：tpa标准品；2：293f-rpa1#细胞株表达上清；3：293f-rpa2#细胞株表达上清；4：293f-rpa3#细胞株表达上清；5：空病毒感染的293f细胞表达上清。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

定义

“血栓栓塞”是严重危害人类健康的常见心血管疾病，给病患个人、家庭及社会带来沉重负担，溶栓治疗是目前治疗血栓栓塞疾病的最有效手段。

“治疗”可以通过多种不同的方式实施，包括治愈、减轻和作为预防(prophylaxis)。治愈性治疗一般旨在治愈已经存在于被治疗个体中的临床症候，例如疾病或病症。减轻性治疗一般是指旨在改善个体中已存在的临床症候的治疗，而无需治愈该疾病或病症。预防性治疗一般旨在防止临床症状的发生或恶化，即防止其发展到更严重的阶段。

“瑞替普酶rpa”是临床应用较好的第三代溶栓药物，rpa是人组织纤溶酶原激活剂tpa的缺失突变体，是一个单链非糖基化蛋白，分子量为39kda，含9对二硫键。临床上，rpa更容易作用于血栓内部，纤溶效果强、起效迅速。

详细说明

在一些实施例中，一种表达瑞替普酶rpa的方法包括如下步骤：将包含编码瑞替普酶基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞，培养所述宿主细胞用于表达瑞替普酶，分离得到所述瑞替普酶。

在至少一个实施例中，采用慢病毒载体将包含分泌信号的瑞替普酶编码基因序列整合至人源细胞293f中，筛选可稳定分泌表达瑞替普酶的细胞株，由此得到的瑞替普酶可溶性表达、不含内毒素，且分泌表达简化后续纯化工艺，真正做到一步纯化，活性鉴定也表明以此方法制备的瑞替普酶具有较好生物学活性。

慢病毒颗粒

本文中使用的“慢病毒颗粒”是复制缺陷型慢病毒颗粒。这种慢病毒颗粒能够从包含下述元件的慢病毒载体产生：5’慢病毒ltr、trna结合位点、包装信号、与编码所述融合蛋白的多核苷酸信号可操作连接的启动子、第二链dna合成起点和3’慢病毒ltr。

在至少一个实施例中，慢病毒颗粒是以hiv-1(人类免疫缺陷i型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

在至少一个实施例中，按照3质粒系统(pmd2.g、pspax2、plenti-rpa-puro)包装慢病毒颗粒，将3个质粒按照特定比例(pmd2.g:pspax2:plenti-rpa-puro＝5:10:15μg)，以脂质体转染法导入宿主细胞中，然后将宿主细胞置于co2培养箱中培养。

在至少一个实施例中，以化学合成的方法体外全基因合成得到编码rpa的dna序列(seq.idno.1)，并且在rpa的5端与3端分别引入ecori和noti酶位点，然后以限制内切酶法将rpa重组至慢病毒表达载体plenti-puro中，经测序得到正确的rpa表达质粒plenti-rpa-puro。

宿主细胞

本文中使用的“宿主细胞”为人源细胞。在至少一个实施例中，用于包装病毒的细胞包括hek293、cho细胞等，优选的，为293f细胞。在至少一个实施例中，采用慢病毒载体将包含分泌信号的瑞替普酶编码基因序列整合至人源细胞293f中，筛选可稳定表达瑞替普酶的细胞株，由此得到的瑞替普酶不含内毒素。

在至少一个实施例中，按照3质粒系统(pmd2.g、pspax2、plenti-rpa-puro)包装慢病毒颗粒，将3个质粒按照特定比例(pmd2.g:pspax2:plenti-rpa-puro＝5:10:15μg)，以脂质体转染法导入10⁶个人源293t细胞中，然后将293t细胞置于co2培养箱中培养。

分泌信号

本文中使用的“分泌信号”是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。细胞外蛋白质在多细胞生物体的形成、分化和保持等过程中发挥重要作用。许多细胞个体的命运，例如生长包括生存、增殖、迁移、分化或与其它细胞的互作，典型地受到从其它细胞和/或直接环境(immediateenvironment)接收的信息的控制。这一信息经常通过分泌性多肽(例如有丝分裂因子、存活因子、细胞毒因子、分化因子、神经肽和激素)传送，这些多肽则被各种细胞受体或膜结合蛋白质接收和诠释(interpreted)。这些分泌性多肽或信号分子通常通过细胞分泌途径到达其在细胞外环境中的作用位点。

在至少一个实施例中，一种表达瑞替普酶rpa的方法，包括如下步骤：将慢病毒颗粒lenti-rpa-puro感染人源胚胎肾细胞293f，筛选得到高抗性的293f细胞株；筛选表达瑞替普酶的高抗性的单克隆细胞株293f-rpa；检测瑞替普酶表达量；验证表达高浓度且高活性rpa的单克隆细胞株。

在至少一个实施例中，所述慢病毒颗粒由plenti-rpa-puro质粒包装得到。

在至少一个实施例中，所述质粒携带分泌信号及编码瑞替普酶的cdna序列。

在至少一个实施例中，所述cdna序列为：seq.idno.2。

在至少一个实施例中，所述高抗性的293f细胞株通过梯度浓度的嘌呤霉素筛选得到。

在至少一个实施例中，以倍比稀释培养法筛选表达瑞替普酶的高抗性的单克隆细胞株293f-rpa。

在至少一个实施例中，以酶联免疫方法检测瑞替普酶表达量。

在至少一个实施例中，以溶栓法检测瑞替普酶活性，验证表达高浓度且高活性rpa的单克隆细胞株。

在至少一个实施例中，其中，所述瑞替普酶的氨基酸序列为：seq.idno.1。

在至少一个实施例中，采用化学合成的方法合成含分泌信号的瑞替普酶编码dna序列(rpa)，在序列两端分别引入ecori与noti酶位点，然后亚克隆至慢病毒表达载体plenti-puro中，得到重组质粒plenti-rpa-puro。以4质粒系统包装得到慢病毒颗粒lenti-rpa，该慢病毒颗粒携带编码rpa基因序列。以慢病毒颗粒lenti-rpa感染人源细胞293f，mol值设定为10。以嘌呤霉素筛选含高拷贝病毒颗粒的细胞株293f-rpa，嘌呤霉素梯度浓度为0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml。以悬浮培养基小试培养筛选得到的细胞株293f-rpa，连续培养5天，每天留取100ul上清，以酶联免疫方法测定细胞表达上清中rpa含量。以溶栓法测定rpa溶栓活性。

在至少一个实施例中，本发明提供的rpa表达方法简单易行，可稳定分泌表达，易于规模化且产品方便纯化。

在至少一个实施例中，将包含编码瑞替普酶基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞，培养所述宿主细胞用于表达瑞替普酶，构建的分泌表达rpa的单克隆细胞株可分泌较好生物学活性的rpa，本发明产生的瑞替普酶rpa可作用于血栓内部，纤溶效果强、起效迅速，可作为溶栓药物，通过溶栓治疗血栓栓塞疾病。

实施例

实施例1

rpa慢病毒表达质粒的构建

1.经文献资料检索分析得到rpa完整dna序列，以化学合成的方法体外全基因合成得到编码rpa的dna序列(seqidno.2)，并且在rpa的5端与3端分别引入ecori(cas：1040s，宝生物工程有限公司)和noti酶(cas：1166s，宝生物工程有限公司)位点，然后以限制内切酶法将rpa重组至慢病毒表达载体plenti-puro(cas：39481，addgene)中，经测序得到正确的rpa表达质粒plenti-rpa-puro。

实施例2

rpa表达细胞株的构建

1.表达rpa的慢病毒颗粒制备。

(1)按照3质粒系统(pmd2.g、pspax2、plenti-rpa-puro)(addgene)包装慢病毒颗粒，将3个质粒按照特定比例(pmd2.g:pspax2:plenti-rpa-puro＝5:10:15μg)，以脂质体转染法(cas:40802es02，上海翊圣生物科技有限公司)导入10⁶个人源293t细胞(atcc)中，然后将293t细胞置于co2培养箱中培养；

(2)在培养48h离心收集培养上清，1200rpm，5min，细胞中加入等量培养基，继续培养；

(3)继续培养24h后，离心收集培养上清，1200rpm，5min；

(4)合并两次收集的细胞培养上清，并加入10％体积的peg8000/nacl溶液(cas:a100159-0500，生工生物工程股份有限公司)，混匀，冰浴1h；

(5)15000g离心冰浴溶液，15min；

(6)倒弃上清，管壁及底部的沉淀以适量pbs(cas:e607008-0500，生工生物工程股份有限公司)重悬并按照100μl分装，得到表达rpa的慢病毒颗粒lenti-rpa，低温保存。

2.293f细胞准备。

(1)取冻存细胞293f细胞1管，以37℃水浴复苏，加入1ml新鲜dmem培养基(cas:11965092，thermofisherscientific)，1200rpm离心5min；

(2)倒弃上清，细胞沉淀以新鲜dmem培养基重悬，转移至250ml摇瓶中，添加dmem培养基至50ml，然后将摇瓶置于co2培养箱中振荡培养，转速100rpm；

(3)培养48h后，当细胞处于对数生长期时，1200rpm离心5min收集细胞；

(4)以新鲜dmem培养基重悬细胞沉淀，并计数调节细胞密度为107/1ml，备用。

3.慢病毒颗粒lenti-rpa感染293f细胞。

(1)将步骤1中制备的慢病毒颗粒lenti-rpa，按照moi值(病毒滴度/细胞数)为10、20、30、40加入步骤2中准备好的293f细胞中，轻轻混匀后置于co2培养箱中静置30min；

(2)将静置的293f细胞混合物转移至250ml摇瓶中，添加dmem培养基至50ml，置于co2培养箱中振荡培养，100rpm；

(3)培养72h后，1200rpm离心5min，收集细胞沉淀；

(4)以rna提取试剂盒(cas:9767，宝生物工程有限公司)提取细胞中总rna，然后以rt-pcr法检测rpa全长表达，以qpcr法检测rpa相对量，验证rpa成功整合至293f细胞的基因组中，得到携带rpa基因的混合细胞。

4.筛选携带高拷贝rpa的单克隆细胞株。

(1)培养步骤3中验证正确的混合293f细胞培养于24孔板中，4000个/1孔；

(2)设计嘌呤霉素(cas:a610593-0025，生工生物工程股份有限公司)梯度浓度0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml，加入含有细胞的24孔板中，继续培养；

(3)每天观察细胞生长状态，并适量补充dmem培养基与嘌呤霉素；

(4)选择最高浓度嘌呤霉素(2.0mg/ml)里生长状态较好的293f细胞，然后按照10倍倍比稀释培养该孔中的细胞，筛选单克隆细胞株；

(5)每天观察稀释培养的细胞并适量补充dmem培养基与嘌呤霉素(2mg/ml)；

(6)显微镜下观察稀释后每孔中细胞数量，取只有1个细胞的孔扩增培养；

(7)连续扩增培养该孔细胞至107总数后，冻存备用，得到含高拷贝rpa的单颗粒细胞株293f-rpa共3株，分别编号为s1、s2、s3号。

5.rpa表达检测。

(1)取步骤4中筛选得到的单克隆细胞株293f-rpa，置于5ml的dmem培养基中振荡培养，100rpm；

(2)设计时间点包括4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h，每个时间点取上清0.2ml，1200rpm离心5min，收集上清；

(3)以bca定量试剂盒(cas:c503021，生工生物工程股份有限公司)检测上清中rpa含量，确证s1号细胞株表达24h分泌的rpa含量达到60μg/ml；

(4)制备15％浓度的sds-page胶(cas:c631100-0100，生工生物工程股份有限公司)，以免疫印迹技术鉴定rpa表达，结果表明筛选的3株细胞株均可分泌表达rpa。

实施例3

rpa溶栓活性测定

1.制备纤维蛋白平板：称取0.02g纤维蛋白(cas:9001-32-5，sigma-aldrich)，加入5ml的pbs，混合后置于37℃水浴预热至充分溶解，同时另取适量凝血酶(cas:9002-04-4，sigma-aldrich)加入1ml的pbs溶液中，轻轻混匀，置于37℃水浴预热；称取0.07g琼脂糖(cas:9012-36-6，sigma-aldrich)，加入7ml的pbs溶液，加热溶解后冷却至50℃左右，得到琼脂糖溶液；将准备的凝血酶溶液与纤维蛋白溶液混匀后立即加入琼脂糖溶液中，混匀后倒入10cm直径平板中，室温冷却得到纤维蛋白平板。

2.用枪头在步骤1中制备的纤维蛋白平板中打孔，加入实施例2中制备的rpa样品5μl，然后置于37℃培养箱中孵育12h后观察溶栓圈的大小。以感染空慢病毒载体的293f细胞表达上清为阴性对照，以人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂tpa(cas:t0831，sigma-aldrich)为阳性对照。

3.结果评价：实验组中出现明显的溶栓圈，而对照组中没有，该结果表明本发明中构建的分泌表达rpa的单克隆细胞株可分泌较好生物学活性的rpa，与阳性对照tpa活性相当。

序列表

<110>谢伟全

<120>一种表达瑞替普酶rpa的细胞株及方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>377

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<213>artificialsequence

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