本发明涉及水牛胚胎发育
技术领域：
，特别涉及一种提高河流型水牛体外受精胚胎发育率的方法。
背景技术：
：胚胎培养技术对于家畜的繁殖潜力挖掘、快速扩繁以及种质资源保护具有重要的价值。影响胚胎体外培养和体外胚胎保存的因素有很多，其中卵母细胞体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养以及胚胎冷冻是体外胚胎生产过程中的四个个主要环节。现行很多体外培养技术中体外成熟效果一直不是很理想，很难将该技术与胚胎移植、活体采卵(opu)技术相结合，应用于生产实践，推广应用；现有技术中也有关于利用卵泡液对卵母细胞成熟水牛卵母细胞体外受精效果的研究，例如，申请人自己发表的论文《不同品种牛卵泡液对水牛卵母细胞体外受精效果的影响》(中国畜牧兽医2010年第37卷第4期)；该文中就对不同品种的牛卵泡对水牛卵母细胞体外受精效果的研究，该文指出了卵泡液的最佳用量在5％-10％，并指出添加5％和10％卵泡液对屠宰场收集卵母细胞体外受精后的胚胎发育有明显促进作用，浓度过高或过低都会抑制水牛体外受精胚胎的发育，但是在实际操作中，卵泡液由于抽取难度大，往往不容易获得，为此，申请人在原研究的基础上研究如何改进配方和操作方法，使卵泡液在较低浓度下：1％-4％能达到促进水牛体外受精胚胎发育的目的。技术实现要素：鉴于上述内容，有必要提供一种提高河流型水牛体外受精胚胎发育率的方法，该方法能对成熟液进行改进，使卵泡液在较低浓度下：1％-4％仍能达到提高水牛体外受精胚胎发育率的目的。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种提高河流型水牛体外受精胚胎发育率的成熟培养液，所述成熟培养液包括质量百分数为1％-4％的卵泡液。进一步的，所述卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液。进一步的，所述氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500-700μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为300-500μmol/l、丙氨酸的终浓度为100-300μmol/l、赖氨酸的终浓度为100-300μmol/l、色氨酸的终浓度为50-100μmol/l、甘氨酸的终浓度为50-150μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养。进一步的，所述成熟培养液包括用于屠宰场采卵体外培养的成熟液a和/或用于活体采卵体外培养的成熟液b。进一步的，所述成熟液a的制备方法如下：取50ml的基础液然后向cm基础液中添加200μl的fsh-lh储存液，45μl的e2储存液，100μl的egf液，50μl的半胱胺储存液，再添加卵泡液，使卵泡液的终浓度为1％-4％。进一步的，其特征在于，所述cm基础液的配制方法如下：(1)配置cm-stock溶液：称取2.45～3.65g的tcm199，0.18～0.30g的nahco3，1.0～2.0mg的丙酮酸钠，35～45μl百分含量为70％的乳酸钠，18～22mg的青霉素，17～27mg的链霉素，9～13mg的酚红；并将上述成分溶解于200ml的生理盐水中，混合均匀得到所述cm-stock溶液；(2)制备cm基础液：将15ml-25ml的胎牛血清溶解于50ml的步骤(1)cm-stock溶液中得到cm基础液；所述fsh-lh储存液的配制方法如下：取120～150ug的卵泡刺激素溶解于10ml生理盐水得到卵泡雌激素溶液，再称取2.11～3.04mg的促黄体生成素溶解于上述的卵泡刺激素溶液中混匀后，分装成10μl/管后，在-20℃保存得到fsh-lh储存液；所述e2储存液的配制方法如下：取2.01～2.43mg的雌二醇溶解于1ml的乙醇混匀后，分装成10μl/管，在-20℃保存得到e2储存液；所述egf液的配制方法如下：用蒸馏水将表皮细胞生长因子配置成溶质含量为10～18ng/ml的溶液得到egf液；所述半胱胺储存液的配制方法如下：称取7.0～7.5mg的半胱胺溶解于10ml步骤(2)的cm基础液中，分装为100μl每管，在-20℃保存得到半胱胺储存液。进一步的，所述成熟液b由如下成分组成：8％的胎牛血清、10μg/ml的卵泡刺激素、15μg/ml促黄体生成素、5μg/ml的雌二醇、0.9mmol/l的丙酮酸钠、100μmol/l的半胱氨酸、35ng/ml的上表皮生长因子、1％-4％的卵泡液、余量为tcm199溶液。一种利用培养液进行体外培养的方法，所述方法包括如下步骤：(1)屠宰场采卵体外培养：收集水牛卵巢，去除卵巢多余组织，用含双抗的生理盐水清洗2-3遍，用注射器吸取卵泡，在体视镜下选取胞质均匀、胞外有3层以上颗粒细胞的卵母细胞，洗涤2～3次，置于成熟液a中，在39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养；培养22-24h后将卵母细胞周围的卵丘细胞吹掉，然后用新的成熟液a洗涤两遍后悬浮，制成微滴后覆盖石蜡，在39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养；将水牛精子孵化后与卵母细胞进行受精、体外胚胎培养；记录各胚胎发育情况；收集发育至第7d的囊胚在显微镜下观察记录囊胚细胞总数；(2)活体采卵体外培养：对活体水牛进行活体采卵，收集卵母细胞，在体视镜下挑选胞质均匀并包裹一层以上卵丘细胞的cocs，在含5％的胎牛血清和20mmol/lhepes的tcml99液中洗2次，再用成熟液b清洗1次，转入50μl/滴的成熟液b中，在39℃、5％co2，最大相对湿度的培养箱中成熟培养22～24h；培养后与孵化后的水牛精子进行受精、体外胚胎培养、记录各胚胎发育情况；收集发育至第7d的囊胚在显微镜下观察记录囊胚细胞总数。本发明具有如下有益效果：1、本发明主要研究对水牛卵母细胞成熟培养液进行改进，在低浓度卵泡液(1％-4％)的中，仍然能达到提高水牛受精卵的分裂率和囊胚率，从而提高水牛体外胚胎发育率和生产效率的效果；在配方中，为了激活卵母细胞的活性，申请人经过大量研究发现利用半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中再与卵泡液混合鳌合可明显提高卵泡液对胚胎发育率的影响，目前影响机理尚不明确，申请人认为是某种氨基酸配方的协同作用提高了卵泡液中来自血清的生化因子及卵母细胞和卵泡细胞的分泌因子等活性物质所带来的效果。【具体实施方式】为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。实施例1：屠宰场采卵体外培养方法：1.体外成熟培养：从屠宰场收集水牛卵巢，置于内含30℃生理盐水的保温壶中保温，2h以内送到实验室，确保到达实验室后保温壶中的温度仍在30℃最好。倒出卵巢，去除卵巢系膜和输卵管等多余组织，再用含双抗的生理盐水清洗2遍，清洗干净后用10ml注射器抽取直径为2mm的卵泡，缓慢注入平皿中在体视显微镜下迅速选取胞质均匀、胞外有3层以上颗粒细胞的卵母细胞，洗涤2次，采用平皿培养，置于成熟液a中39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养，其中，成熟液a的制备方法如下：取50ml的基础液然后向cm基础液中添加200μl的fsh-lh储存液，45μl的e2储存液，100μl的egf液，50μl的半胱胺储存液，再添加卵泡液，使卵泡液的终浓度为1％。2.颗粒细胞单层制备：将成熟22h的卵母细胞周围卵丘细胞轻轻吹掉，剩余在成熟液a中的颗粒细胞用新的成熟液a离心洗涤两遍后悬浮，控制细胞密度2×106/ml左右，用35mm的塑料培养皿制成30μl的微滴，覆盖石蜡油，39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养备用，培养三天后换cm基础液后隔天换一次cm基础液。3.体外受精：将水牛冻精解冻后置于爬高液约30min，在此期间将成熟22h的水牛卵母细胞周围的卵丘细胞轻轻吹打掉，置于受精液中，每微滴10枚卵子，孵育约30min,将爬高、洗涤后的精子加入受精液微滴中，控制精子浓度1×106/ml，将受精盘置于培养箱中孵育。4.体外胚胎培养：受精18h后将附着在受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗2遍后转移到事先准备好的单层培养盘中，于39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养，记录胚胎各个阶段发育情况。5.囊胚总细胞数计数：收集发育至第7d的囊胚，于pbs缓冲液中清洗2次后，置于无水乙醇稀释的10μmol/mlhoechst33342染液，室温中避光染色过夜，取出于pbs缓冲液中清洗2次，石蜡-凡士林封片，于荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。本实施例成熟液a中所用的卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液，其中，氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为300μmol/l、丙氨酸的终浓度为100μmol/l、赖氨酸的终浓度为100μmol/l、色氨酸的终浓度为50μmol/l、甘氨酸的终浓度为50μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养1h。本实施例中，所用到的cm基础液、fsh-lh储存液、e2储存液、egf液和半胱胺储存液的制备方法如下：(1)cm基础液的配制方法如下：①配置cm-stock溶液：称取2.45g的tcm199，0.18g的nahco3，1.0mg的丙酮酸钠，35μl百分含量为70％的乳酸钠，18mg的青霉素，17mg的链霉素，9mg的酚红；并将上述成分溶解于200ml的生理盐水中，混合均匀得到所述cm-stock溶液；②制备cm基础液：将15ml的胎牛血清溶解于50ml的步骤(1)cm-stock溶液中得到cm基础液；(2)fsh-lh储存液的配制方法如下：取120ug的卵泡刺激素溶解于10ml生理盐水得到卵泡雌激素溶液，再称取2.11mg的促黄体生成素溶解于上述的卵泡刺激素溶液中混匀后，分装成10μl/管后，在-20℃保存得到fsh-lh储存液；(3)e2储存液的配制方法如下：取2.01mg的雌二醇溶解于1ml的乙醇混匀后，分装成10μl/管，在-20℃保存得到e2储存液；(4)egf液的配制方法如下：用蒸馏水将表皮细胞生长因子配置成溶质含量为10ng/ml的溶液得到egf液；(5)半胱胺储存液的配制方法如下：称取7.0mg的半胱胺溶解于10ml步骤(2)的cm基础液中，分装为100μl每管，在-20℃保存得到半胱胺储存液。实施例2：1.体外成熟培养：从屠宰场收集水牛卵巢，置于内含39℃生理盐水的保温壶中保温，3h以内送到实验室，确保到达实验室后保温壶中的温度仍在33℃最好。倒出卵巢，去除卵巢系膜和输卵管等多余组织，再用含双抗的生理盐水清洗3遍。清洗干净后用10ml注射器抽取直径为6mm的卵泡，缓慢注入平皿中在体视显微镜下迅速选取胞质均匀、胞外有3层以上颗粒细胞的卵母细胞，洗涤3次，采用平皿培养，置于成熟液a中39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养，其中，成熟液a的制备方法如下：取50ml的基础液然后向cm基础液中添加200μl的fsh-lh储存液，45μl的e2储存液，100μl的egf液，50μl的半胱胺储存液，再添加卵泡液，使卵泡液的终浓度为4％。2.颗粒细胞单层制备：将成熟24h的卵母细胞周围卵丘细胞轻轻吹掉，剩余在成熟液a中的颗粒细胞用新的成熟液a离心洗涤两遍后悬浮，控制细胞密度2×106/ml左右，用35mm的塑料培养皿制成30μl的微滴，覆盖石蜡油，在39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养备用，培养三天后换cm基础液后隔天换一次cm基础液。3.体外受精：将水牛冻精解冻后置于爬高液约30min，在此期间将成熟24h的水牛卵母细胞周围的卵丘细胞轻轻吹打掉，置于受精液中，每微滴15枚卵子，孵育约30min,将爬高、洗涤后的精子加入受精液微滴中，控制精子浓度1.5×106/ml，将受精盘置于培养箱中孵育。4.体外胚胎培养：受精18h后将附着在受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗3遍后转移到事先准备好的单层培养盘中，于39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养，记录胚胎各个阶段发育情况。5.囊胚总细胞数计数：收集发育至第7d的囊胚，于pbs缓冲液中清洗3次后，置于无水乙醇稀释的10μmol/mlhoechst33342染液，室温中避光染色过夜，取出于pbs缓冲液中清洗3次，石蜡-凡士林封片，于荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。本实施例成熟液a中所用的卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液，其中，氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为700μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为500μmol/l、丙氨酸的终浓度为300μmol/l、赖氨酸的终浓度为300μmol/l、色氨酸的终浓度为100μmol/l、甘氨酸的终浓度为150μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养2h。本实施例中，所用到的cm基础液、fsh-lh储存液、e2储存液、egf液和半胱胺储存液的制备方法如下：(1)cm基础液的配制方法如下：①配置cm-stock溶液：称取3.65g的tcm199，0.30g的nahco3，2.0mg的丙酮酸钠，45μl百分含量为70％的乳酸钠，22mg的青霉素，27mg的链霉素，13mg的酚红；并将上述成分溶解于200ml的生理盐水中，混合均匀得到所述cm-stock溶液；②制备cm基础液：将25ml的胎牛血清溶解于50ml的步骤(1)cm-stock溶液中得到cm基础液；(2)fsh-lh储存液的配制方法如下：取150ug的卵泡刺激素溶解于10ml生理盐水得到卵泡雌激素溶液，再称取3.04mg的促黄体生成素溶解于上述的卵泡刺激素溶液中混匀后，分装成10μl/管后，在-20℃保存得到fsh-lh储存液；(3)e2储存液的配制方法如下：取2.43mg的雌二醇溶解于1ml的乙醇混匀后，分装成10μl/管，在-20℃保存得到e2储存液；(4)egf液的配制方法如下：用蒸馏水将表皮细胞生长因子配置成溶质含量为18ng/ml的溶液得到egf液；(5)半胱胺储存液的配制方法如下：称取7.5mg的半胱胺溶解于10ml步骤(2)的cm基础液中，分装为100μl每管，在-20℃保存得到半胱胺储存液。实施例3：1.体外成熟培养：从屠宰场收集水牛卵巢，置于内含33℃生理盐水的保温壶中保温，2.5h以内送到实验室，确保到达实验室后保温壶中的温度仍在32℃最好。倒出卵巢，去除卵巢系膜和输卵管等多余组织，再用含双抗的生理盐水清洗3遍。清洗干净后用10ml注射器抽取直径为5mm的卵泡，缓慢注入平皿中在体视显微镜下迅速选取胞质均匀、胞外有3层以上颗粒细胞的卵母细胞，洗涤3次，采用平皿培养，置于成熟液a中39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养，其中，成熟液a的制备方法如下：取50ml的基础液然后向cm基础液中添加200μl的fsh-lh储存液，45μl的e2储存液，100μl的egf液，50μl的半胱胺储存液，再添加卵泡液，使卵泡液的终浓度为3％。2.颗粒细胞单层制备：将成熟23h的卵母细胞周围卵丘细胞轻轻吹掉，剩余在成熟液a中的颗粒细胞用新的成熟液a离心洗涤两遍后悬浮，控制细胞密度2×106/ml左右，用35mm的塑料培养皿制成30μl的微滴，覆盖石蜡油，39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养备用，培养三天后换cm基础液后隔天换一次cm基础液。3.体外受精：将水牛冻精解冻后置于爬高液约30min，在此期间将成熟23h的水牛卵母细胞周围的卵丘细胞轻轻吹打掉，置于受精液中，每微滴12枚卵子，孵育约30min,将爬高、洗涤后的精子加入受精液微滴中，控制精子浓度1.2×106/ml，将受精盘置于培养箱中孵育。4.体外胚胎培养：受精18h后将附着在受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗3遍后转移到事先准备好的单层培养盘中，于39℃、5％co2饱和空气湿度培养箱中培养，记录胚胎各个阶段发育情况。5.囊胚总细胞数计数：收集发育至第7d的囊胚，于pbs缓冲液中清洗2次后，置于无水乙醇稀释的10μmol/mlhoechst33342染液，室温中避光染色过夜，取出于pbs缓冲液中清洗3次，石蜡-凡士林封片，于荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。本实施例成熟液a中所用的卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液，其中，氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为600μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为400μmol/l、丙氨酸的终浓度为200μmol/l、赖氨酸的终浓度为200μmol/l、色氨酸的终浓度为80μmol/l、甘氨酸的终浓度为100μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养1.5h。本实施例中，所用到的cm基础液、fsh-lh储存液、e2储存液、egf液和半胱胺储存液的制备方法如下：(1)cm基础液的配制方法如下：①配置cm-stock溶液：称取2.95g的tcm199，0.20g的nahco3，1.5mg的丙酮酸钠，40μl百分含量为70％的乳酸钠，20mg的青霉素，22mg的链霉素，11mg的酚红；并将上述成分溶解于200ml的生理盐水中，混合均匀得到所述cm-stock溶液；②制备cm基础液：将20ml的胎牛血清溶解于50ml的步骤(1)cm-stock溶液中得到cm基础液；(2)fsh-lh储存液的配制方法如下：取130ug的卵泡刺激素溶解于10ml生理盐水得到卵泡雌激素溶液，再称取2.88mg的促黄体生成素溶解于上述的卵泡刺激素溶液中混匀后，分装成10μl/管后，在-20℃保存得到fsh-lh储存液；(3)e2储存液的配制方法如下：取2.21mg的雌二醇溶解于1ml的乙醇混匀后，分装成10μl/管，在-20℃保存得到e2储存液；(4)egf液的配制方法如下：用蒸馏水将表皮细胞生长因子配置成溶质含量为14ng/ml的溶液得到egf液；(5)半胱胺储存液的配制方法如下：称取7.2mg的半胱胺溶解于10ml步骤(2)的cm基础液中，分装为100μl每管，在-20℃保存得到半胱胺储存液。实施例4：活体采卵体外培养方法1.活体采卵：活体采卵仪为日本honda公司生产的hs2000b型超声波显像仪，阴道扇形扫描探头(aloka)，探头上安装19g采卵针(长60cm)，真空泵以硅胶导管连接采卵针和装有采卵液的50ml试管，试管则放置在恒温槽内保持38℃。对供体水牛进行保定，操作者一手经直肠把握固定卵巢，一手将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道穹隆处采卵一侧，并将卵巢牵引紧贴在探头前端，这时从b超显示器上可显示出卵巢图像和卵泡位置，推动采卵针穿刺卵泡，以40mm汞柱左右的负压进行采卵，每吸取2个可视卵泡后，立即用采卵液冲冼管道。回收卵泡液。采完2头供体后，将回收液送回实验室收集卵母细胞。2.卵母细胞的体外成熟：将活体收集的回收液倒入胚胎过滤杯内，用含3％fbs的dpbs清洗2次，在体视镜下收集活体采集卵母细胞；而注射器抽取的卵泡液直接在体视镜下挑选胞质均匀并包裹一层以上卵丘细胞的cocs，在含5％fbs和20mmol/lhepes的tcml99液中洗2次，再用成熟液b液洗1次，转入50μl/滴的成熟液b中在39℃、5％co2，最大相对湿度的培养箱中成熟培养22h，其中，成熟液b由如下成分组成：8％的胎牛血清、10μg/ml的卵泡刺激素、15μg/ml促黄体生成素、5μg/ml的雌二醇、0.9mmol/l的丙酮酸钠、100μmol/l的半胱氨酸、35ng/ml的上表皮生长因子、1％的卵泡液、余量为tcm199溶液。3.体外受精方法：与实施例1相同；4.体外胚胎培养观察方法：与实施例1相同。本实施例成熟液b中所用的卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液，其中，氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为300μmol/l、丙氨酸的终浓度为100μmol/l、赖氨酸的终浓度为100μmol/l、色氨酸的终浓度为50μmol/l、甘氨酸的终浓度为50μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养2h。实施例5：1.活体采卵：活体采卵仪为日本honda公司生产的hs2000b型超声波显像仪，阴道扇形扫描探头(aloka)，探头上安装19g采卵针(长60cm)，真空泵以硅胶导管连接采卵针和装有采卵液的50ml试管，试管则放置在恒温槽内保持38℃。对供体水牛进行保定，操作者一手经直肠把握固定卵巢，一手将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道穹隆处采卵一侧，并将卵巢牵引紧贴在探头前端，这时从b超显示器上可显示出卵巢图像和卵泡位置，推动采卵针穿刺卵泡，以40mm汞柱左右的负压进行采卵，每吸取3个可视卵泡后，立即用采卵液冲冼管道。回收卵泡液。采完3头供体后，将回收液送回实验室收集卵母细胞。3.卵母细胞的体外成熟：将活体收集的回收液倒入胚胎过滤杯内，用含3％fbs的dpbs清洗3次，在体视镜下收集活体采集卵母细胞；而注射器抽取的卵泡液直接在体视镜下挑选胞质均匀并包裹一层以上卵丘细胞的cocs，在含5％fbs和20mmol/lhepes的tcml99液中洗2次，再用成熟液b液洗1次，转入50μl/滴的成熟液b中在39℃、5％co2，最大相对湿度的培养箱中成熟培养24h，其中，成熟液b由如下成分组成：8％的胎牛血清、10μg/ml的卵泡刺激素、15μg/ml促黄体生成素、5μg/ml的雌二醇、0.9mmol/l的丙酮酸钠、100μmol/l的半胱氨酸、35ng/ml的上表皮生长因子、4％的卵泡液、余量为tcm199溶液。4.体外受精方法：与实施例2相同；5.体外胚胎培养观察方法：与实施例2相同。本实施例成熟液b中所用的卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液，其中，氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为700μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为500μmol/l、丙氨酸的终浓度为300μmol/l、赖氨酸的终浓度为300μmol/l、色氨酸的终浓度为100μmol/l、甘氨酸的终浓度为150μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养3h。实施例6：1.活体采卵：活体采卵仪为日本honda公司生产的hs2000b型超声波显像仪，阴道扇形扫描探头(aloka)，探头上安装19g采卵针(长60cm)，真空泵以硅胶导管连接采卵针和装有采卵液的50ml试管，试管则放置在恒温槽内保持38℃。对供体水牛进行保定，操作者一手经直肠把握固定卵巢，一手将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道穹隆处采卵一侧，并将卵巢牵引紧贴在探头前端，这时从b超显示器上可显示出卵巢图像和卵泡位置，推动采卵针穿刺卵泡，以40mm汞柱左右的负压进行采卵，每吸取3个可视卵泡后，立即用采卵液冲冼管道。回收卵泡液。采完2头供体后，将回收液送回实验室收集卵母细胞。6.卵母细胞的体外成熟：将活体收集的回收液倒入胚胎过滤杯内，用含3％fbs的dpbs清洗3次，在体视镜下收集活体采集卵母细胞；而注射器抽取的卵泡液直接在体视镜下挑选胞质均匀并包裹一层以上卵丘细胞的cocs，在含5％fbs和20mmol/lhepes的tcml99液中洗2次，再用成熟液b液洗1次，转入50μl/滴的成熟液b中在39℃、5％co2，最大相对湿度的培养箱中成熟培养23h，其中，成熟液b由如下成分组成：8％的胎牛血清、10μg/ml的卵泡刺激素、15μg/ml促黄体生成素、5μg/ml的雌二醇、0.9mmol/l的丙酮酸钠、100μmol/l的半胱氨酸、35ng/ml的上表皮生长因子、3％的卵泡液、余量为tcm199溶液。4.体外受精方法：与实施例3相同；5.体外胚胎培养观察方法：与实施例3相同。本实施例成熟液b中所用的卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液，其中，氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为600μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为400μmol/l、丙氨酸的终浓度为200μmol/l、赖氨酸的终浓度为200μmol/l、色氨酸的终浓度为70μmol/l、甘氨酸的终浓度为100μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养2.5h。屠宰场采卵体外成熟培养验证：对照组1：本对照组的其它实验手段与实施例1完全一致，唯一不同的是，卵泡液为不经过氨基酸鳌合处理的卵泡液。对照组2：本对照组的其它实验手段与实施例1完全一致，唯一不同的是，卵泡液为的氨基酸鳌合处理过程中，氨基酸鳌合液不含甲硫氨酸和丙氨酸；即氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500μmol/l、赖氨酸的终浓度为100μmol/l、色氨酸的终浓度为50μmol/l、甘氨酸的终浓度为50μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养1h。对照组3：本对照组的其它实验手段与实施例1完全一致，唯一不同的是，不使用卵泡液，而使用氨基酸鳌合液替代，即使用1％的氨基酸鳌合液，即：氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为300μmol/l、丙氨酸的终浓度为100μmol/l、赖氨酸的终浓度为100μmol/l、色氨酸的终浓度为50μmol/l、甘氨酸的终浓度为50μmol/l。对照组4：本对照组的其它实验手段与实施例1完全一致，唯一不同的是，不使用卵泡液而使用胎牛血。按照实施例1-3和对照组1-4的方法处理水牛卵母细胞，之后进行受精、发育研究，在胚胎发育至第7d时，收集囊胚，在pbs缓冲液中清洗后，进行避光染色过夜，取出于pbs缓冲液中清洗，石蜡-凡士林封片，于荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。其中，胚胎分裂率的计算公式为：胚胎分裂率＝分裂数/总受精卵数；囊胚率＝囊胚数/总受精；具体实验结果见表1：表1由上表可知，实施例1-3的卵细胞分裂率和囊胚率均大于对照组1-4，说明，本申请的氨基酸鳌合液与卵泡液协同作用能提高水牛胚胎的体外发育率。活体采卵体外成熟培养对照组a：本对照组的其它实验手段与实施例4完全一致，唯一不同的是，卵泡液为不经过氨基酸鳌合处理的卵泡液。对照组b：本对照组的其它实验手段与实施例4完全一致，唯一不同的是，卵泡液为的氨基酸鳌合处理过程中，氨基酸鳌合液不含色氨酸和甘氨酸；即氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和赖氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为300μmol/l、丙氨酸的终浓度为100μmol/l、赖氨酸的终浓度为100μmol/l；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养2h。对照组c：本对照组的其它实验手段与实施例4完全一致，唯一不同的是，不使用卵泡液，而使用氨基酸鳌合液替代，即使用1％的氨基酸鳌合液，即：氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于tcm199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500μmol/l、甲硫氨酸的终浓度为300μmol/l、丙氨酸的终浓度为100μmol/l、赖氨酸的终浓度为100μmol/l、色氨酸的终浓度为50μmol/l、甘氨酸的终浓度为50μmol/l。对照组d：本对照组的其它实验手段与实施例4完全一致，唯一不同的是，不使用卵泡液而使用胎牛血。按照实施例1-3和对照组1-4的方法处理水牛卵母细胞，之后进行受精、发育研究，在胚胎发育至第7d时，收集囊胚，在pbs缓冲液中清洗后，进行避光染色过夜，取出于pbs缓冲液中清洗，石蜡-凡士林封片，于荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。其中，胚胎分裂率的计算公式为：胚胎分裂率＝分裂数/总受精卵数；囊胚率＝囊胚数/总受精；具体实验结果见表2：表2试验重复培养卵数分裂卵数分裂率囊胚率囊胚总细胞数/个实施例410827793.9054.8845实施例510807492.5056.2545实施例610867991.8660.4752对照组a10794962.0334.1827对照组b10915560.4431.8729对照组c10965658.3330.2129对照组d10945659.5730.8529由上表可知，实施例4-6的卵细胞分裂率和囊胚率均大于对照组a-d，说明，本申请的氨基酸鳌合液与卵泡液协同作用能提高水牛胚胎的体外发育率。综上所述，本申请的成熟培养液经过改良后，可在卵泡液较低浓度下就能达到提高水牛胚胎发育率的作用，而且对于屠宰取卵和活体取卵的两种方式均适用。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12