短RNA片段文库的构建方法、试剂盒及应用与流程

短rna片段文库的构建方法、试剂盒及应用
技术领域
[0001]
本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种短rna片段文库的构建方法、试剂盒及应用。


背景技术：

[0002]
细胞外rna(extracellular rna或exrnas)在生命科学领域有极高的研究价值，应用于液体活检领域等更是研究热点。目前已知exrnas中包括含多种短rna片段，如mirna、sirna、snorna等，更包括大量长rna(如mrna、long non-coding rna等)的降解片段。这些片段在细胞外可能执行着重要功能，但目前短rna片段(small rna)的建库测序流程仅能研究其中的mirna组分，其他核酸序列无法被获取到。
[0003]
由此，针对短rna片段文库的建库测序流程还需要进一步改进，以尽量检测其他短rna片段组分。


技术实现要素：

[0004]
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种短rna片段文库的构建方法及试剂盒。
[0005]
本发明的发明人在研究过程中发现：
[0006]
如图1所示，目前small rna文库构建流程通常如下：1)电泳分离total rna，并回收18-30nt的组分；2)在small rna两端依次连接3’接头和5’接头；3)所获得的连接产物进行反转录和pcr扩增，得到small rna文库。然而在步骤2)利用酶在small rna两端连接3’接头和5’接头的过程中，只能以5’端为磷酸基且3’端为羟基末端的rna序列为反应底物，而当rna末端为5’三磷酸基(5’triphosphate)、5’羟基或3’磷酸基时，以上两款酶连接效率极低。
[0007]
然而细胞外rna包括含多种短rna片段，如mirna、sirna、snorna等，更包括大量长rna(如mrna、long non-coding rna等)的降解片段。其中，mirna在成熟过程中由dicer酶剪切加工，成熟mirna的结构特点为5’磷酸基且3’羟基。sirna在成熟过程中由rdrp酶加工，成熟sirna的结构特点为5’三磷酸基且3’羟基。长rna的降解片段则是经过了rnase a剪切，结构特点为5’羟基且3’磷酸基。按照现有的small rna建库方法，除mirna外，其他短rna片段均不能被测得。然而已有的研究表明，sirna在器官发育过程中起到了重要作用，而长rna的降解片段则扮演着在细胞间传递遗传信息或特异性的rna结合蛋白等作用。这两类短rna片段都有极高的研究价值，但现有的small rna建库方法无法开展。
[0008]
发明人在研究过程中发现：t4多聚核苷酸激酶(t4polynucleotide kinase，缩写为t4pnk)同时具有5’磷酸化酶活性和3’磷酸酶活性，常用于基因克隆实验。反应底物多为双链dna。可以将其应用于修饰长rna的降解片段，使长rna的降解片段的5’羟基3’磷酸基改变为5’磷酸基3’羟基。rna5’焦磷酸水解酶(rna 5'pyrophosphohydrolase，缩写为rpph)具有焦磷酸水解酶活性，可以将长rna 5’三磷酸基水解脱焦磷酸得到5’磷酸基，常用于mrna
的脱帽反应及转录起始位点研究。因此也可以将其应用于修饰sirna，使sirna的5’三磷酸基改变为5’磷酸基。同时，rpph的脱帽活性可以帮助捕获mrna的5’降解片段。借助于这些酶对短rna片段样本进行处理，使得处理后的短rna片段样本能够利用常规small rna分子文库构建的手段进行建库，测序，从而获知这些短rna片段的信息，用于科研或者临床分析等。当然，如果其他的核酸酶也可以实现上述功能，例如能够将rna分子的3’端转化为3’羟基，从而适于与3’接头连接；或者能够将rna分子5’端转化为仅带有一个磷酸基，从而适于与5’接头连接，其主旨与本发明相同，也可以应用于本发明。这些核酸酶也可以包含在本发明的保护范围之内。
[0009]
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
[0010]
根据本发明的第一方面，一种短rna片段文库的构建方法，包括：将短rna片段样本进行预磷酸化和去磷酸化处理，使得所述短rna片段中3’端磷酸基修饰为羟基，5’端羟基修饰为磷酸基，获得第一产物；将所述第一产物与3’接头进行第一连接，以便获得连接有3’接头的第一连接产物；将所述连接有3’接头的第一连接产物进行脱磷酸处理，以便获得5’端为磷酸基的第二产物；将所述5’端为磷酸基的第二产物与5’接头进行第二连接，以便获得连接有5’接头和3’接头的第二连接产物；将所述连接有5’接头和3’接头的第二连接产物进行反转录，扩增获得所述短rna片段文库。
[0011]
通过对短rna片段样本进行预磷酸化和去磷酸化处理，可以使得短rna片段样本中例如长片段降解片段的3’端磷酸基修饰为3’羟基，5’端羟基修饰为5’磷酸基，使得修饰后的短rna片段适于连接3’接头和5’接头；然后将连接有3’接头的第一连接产物进行脱磷酸处理，使得某些短rna片段中的5’端的多个磷酸基修饰为一个磷酸基，以便于和5’接头连接，获得连接有5’接头和3’接头的第二连接产物。通过对第二连接产物进行反转录，扩增能够获得短rna片段文库。所获得的短rna片段文库中包含有长片段降解片段，mirna，sirna等众多短rna片段，通过测序可以获知这些短rna片段的信息，这些分子在生命科学领域起着重要的功能，通过这些信息，可以应用于科研或者临床治疗和研究中。
[0012]
根据本发明的实施例，以上所述短rna片段文库的构建方法可以进一步包括如下技术特征：
[0013]
在本发明的一些实施例中，将所述短rna片段样本和t4多聚核苷酸激酶进行第一混合孵育，以便进行所述预磷酸化和去磷酸化处理。利用t4多聚核苷酸激酶对所述短rna片段样本进行处理，能够使得其中的长rna的降解片段，即5’端为羟基且3’端为磷酸基的降解片段发生修饰，使得5’端修饰为磷酸基，3’端修饰为羟基，从而便于后续在建库过程中连接3’接头和5’接头。而且t4多聚核苷酸激酶对于短rna片段样本的处理，对于短rna片段样本中的其他片段，例如mirna，sirna等几乎不会产生影响，不会影响到这些短片段后续文库的构建。
[0014]
在本发明的一些实施例中，将所述连接有3’接头的第一连接产物和rna5’焦磷酸水解酶进行第二混合孵育，以便进行所述脱磷酸处理。
[0015]
在本发明的一些实施例中，所述第一混合孵育和所述第二混合孵育的温度为35～38摄氏度，孵育时间为25～35分钟。由此通过第一混合孵育，可以快速实现预磷酸化和去磷酸化处理，通过第二混合孵育，可以快速实现脱磷酸处理，而且不会对短rna片段中的其他rna，例如mirna产生影响。
[0016]
在本发明的一些实施例中，在进行所述第一混合孵育和所述第二混合孵育后，进一步包括：分别将孵育产物在60～70摄氏度下孵育5～10分钟，以灭活酶。
[0017]
在本发明的一些实施例中，所述短rna片段样本包括：mirna、sirna和长rna降解片段。
[0018]
在本发明的一些实施例中，所述短rna片段样本的长度为18-50nt。
[0019]
根据本发明的第二方面，本发明提供了t4多聚核苷酸激酶和/或rna 5’焦磷酸水解酶在短rna片段建库测序领域的中用途。
[0020]
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种短rna片段文库构建的试剂盒，包括：t4多聚核苷酸激酶和rna 5’焦磷酸水解酶。
[0021]
在本发明的一些实施例中，以上所述的试剂盒进一步包括下列中的至少一种：t4 rna连接酶，5’接头，3’接头，rnase抑制剂，t4 rna连接酶2，truncated，连接缓冲液。
附图说明
[0022]
图1是根据本发明的实施例提供的常规small rna文库制备的流程图。
[0023]
图2是根据本发明的实施例提供的应用本发明的small rna文库制备的流程图。
[0024]
图3是根据本发明的实施例提供的实验组和对照组的数据分析结果图。
具体实施方式
[0025]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0026]
本发明建立了一种可实践的、高效率的短rna片段片段建库方法。通过t4多聚核苷酸激酶(t4pnk)和rna5’焦磷酸水解酶(rpph)两种核酸酶的引入，并给出最优的反应条件和实验流程，从而对样本中除mirna外，sirna、长rna(如mrna、long non-coding rna等)的降解片段可同时展开深入研究。当然，本发明也不仅仅局限与t4pnk和rpph核酸酶，其他酶能够实现与这两种酶相同的功能也包含在本发明的保护范围之内。例如，在对3’端进行去磷酸化处理时，可以使用碱性磷酸酶alkaline phosphatase，calf intesinal(cip)；在对rna片段的5’端进行预磷酸化时，也可以使用rna 5’polyphosphatase。但是采用t4pnk可以同时实现预磷酸化和去磷酸化处理，能够以最简单的流程同时实现两端的修饰，而且无须引入cip处理。重要的是，采用t4pnk处理，不会对短rna片段中的其他片段产生影响，从而不影响这些其他片段后续文库的构建。
[0027]
同样地，也可以使用烟草酸焦磷酸酶tobacco acid pyrophosphataste(tap)进行脱磷酸处理，但是tap使用成本较高，而且反应耗时长，例如至少需要在37摄氏度下处理1～2小时。采用rpph对短rna片段进行脱磷酸处理，能够简单快速获得5’端为磷酸基的短rna片段，成本低。同时，rpph表现出比tap更优的脱帽(decapping)活性，可以帮助在此步反应的同时捕获mrna的5’降解片段。重要的是，在进行所述脱磷酸处理时，不会对其他短rna片段产生影响，从而不会影响这些其他短rna片段的建库和测序。
[0028]
无论是利用酶进行预磷酸化和去磷酸化处理，还是利用酶进行脱磷酸处理时，选择有效的发挥与上述所提到的酶类似功能的酶，对于短rna片段文库的构建和测序来说很
重要，会直接影响到于短rna片段中各目标片段的建库以及检测。以rna 5’polyphosphatase为例，其也能够实现将5’三磷酸化的rna转换为5’单磷酸化的rna，但是该酶为atp依赖酶，且在atp和磷酸盐同时存在的情况下酶活会显著降低。atp是进行5’接头连接步骤所必要的组分，磷酸盐则是各酶反应常用的缓冲环境。因此，如果实验过程中使用rna 5’polyphosphatase进行脱磷酸处理，会触发后续连接反应效率的改变，并经证实会对其他片段的检测效率产生影响。因此，在至少一些优选实施方式中，所提供的短rna片段文库的构建方法，利用t4多聚核苷酸激酶对短rna片段样本进行与磷酸化和去磷酸化处理，不仅可以使得短rna片段中3’端磷酸基修饰为羟基，5’端羟基修饰为磷酸基，重要的是不会对其他短rna片段带来影响；利用rna 5’焦磷酸水解酶进行脱磷酸处理，不仅可以使得短rna片段的5’端变为磷酸基，而且还不会对其他短rna片段带来影响，不会影响目标短rna片段的检测效率。
[0029]
在本发明的至少一些实施方式中，提供了一种短rna片段文库的构建方法，包括：将短rna片段样本和t4多聚核苷酸激酶孵育，进行预磷酸化和去磷酸化处理，使得所述短rna片段中3’端磷酸基修饰为羟基，5’端羟基修饰为磷酸基，获得第一产物；将所述第一产物与3’接头进行第一连接，以便获得连接有3’接头的第一连接产物；将所述连接有3’接头的第一连接产物和rna5’焦磷酸水解酶孵育，进行脱磷酸处理，以便获得5’端为磷酸基的第二产物；将所述5’端为磷酸基的第二产物与5’接头进行第二连接，以便获得连接有5’接头和3’接头的第二连接产物；将所述连接有5’接头和3’接头的第二连接产物进行反转录，扩增获得所述短rna片段文库。
[0030]
本文中，短rna片段意指任何长度短的短rna片段，例如包括mirna、sirna、snorna等，还可以包括大量长rna(如mrna、long non-coding rna等)的降解片段。在至少一些实施方式中，这些短rna片段的长度可以为18-50nt。
[0031]
本文中“预磷酸化和去磷酸化处理”指的是通过修饰，使得短rna片段中5’端羟基进行预磷酸化，修饰为5’端磷酸基，使得短rna片段中3’端磷酸基进行去磷酸化，即去掉磷酸基团，修饰为3’端羟基。本文中“脱磷酸处理”与“去磷酸化处理”不同，脱磷酸处理指的是脱除掉5’端多余的磷酸基，例如将5’端的三磷酸基团通过脱磷酸处理，变为5’端仅为一个磷酸基，即变为单磷酸基。
[0032]
另外，本文中如无特别说明，当表述5’端磷酸基或者3’端磷酸基时，按照本领域技术人员的通常解释，仅指一个磷酸基。
[0033]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0034]
实施例1
[0035]
使用人标准rna样品uhrr(agilent,lot.#740000)构建small rna文库。实验分2组：实验组(使用本发明所提供的短rna片段文库的构建方法，如附图2所示)和对照组(常规短rna片段文库的构建方法)；每组分别设置3个重复。
[0036]
其中，图1为常规的small rna文库制备流程图。即对照组在构建small rna文库的过程中，在短rna片段的3’末端连接上3’接头；然后在短rna片段的5’末端连接上5’接头；在
反应中，由于连接酶只能以5’磷酸基且3’羟基末端的rna序列为反应底物，因此只能捕获样本中的mirna组分，其他短rna片段的捕获效率非常低；最后经过反转录和后续的扩增反应，得到最终的文库。
[0037]
图2为应用本发明所提供的small rna文库制备流程图。即实验组在构建small rna文库的过程中，短rna片段预先经t4pnk处理后，再连接3’接头，经过t4pnk处理后，5’羟基3’磷酸基的长rna降解产物被修饰为5’磷酸基3’羟基，从而可以参与连接反应；然后将所获得的连接产物经rpph处理后连接5’接头，经过rpph处理后，5’三磷酸基的sirna等被修饰为5’磷酸基的sirna，从而可以参与连接反应；最后，经过反转录和后续的扩增反应，得到最终的文库，所有rna组分均转化为可被测序的文库。
[0038]
具体的实验流程如下，其中实验组和对照组相同的处理步骤时，不再专门区分说明是实验组还是对照组，针对实验组和对照组不同的处理步骤时，在以下步骤中会专门进行说明：
[0039]
(1)small rna富集：取total rna 1μg，点样至15％浓度的聚丙烯酰胺变性胶，切胶回收18-50nt的片段，溶于5μl nuclease-free water。
[0040]
其中18-30nt为mirna及sirna的长度范围，同时为保证长rna的降解片段与参考序列比对的正确性，选择长rna的降解片段的长度范围在25-50nt左右。
[0041]
(2)其中对照组置于冰上，不做其他处理；
[0042]
实验组加入1μl t4polynucleotide kinase(购自于neb公司，货号m0201s，10000units/ml)，混匀后37℃孵育30分钟；磷酸化处理后，65℃孵育20分钟使其失活；
[0043]
(3)3’接头连接：加入3'adapter 1μl(该接头序列如seq id no:1所示，购自于illumina公司，truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012)，混匀后70℃孵育2分钟，然后置于冰上；依次加入ligation buffer 2μl、rnase inhibitor 1μl(ligation buffer和rnase inhibitor购自于illumina公司，truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012)、t4 rna ligase 2,truncated 1μl(购自于neb，货号m0242s,200,000units/ml)，混匀后28℃孵育1小时；
[0044]3’
adapter(3’接头):tggaattctcgggtgccaagg(seq id no:1)。
[0045]
(4)其中对照组置于冰上，不做其他处理；
[0046]
实验组加入rna 5'pyrophosphohydrolase 1μl(购自于neb，货号m0356s，5000units/ml)，混匀后37℃孵育30分钟；脱帽反应后，65℃孵育5分钟使其失活。
[0047]
(5)反应体系中加入stop oligo 1μl(购自于illumina公司，truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012)，混匀后28℃孵育15分钟，用于防止接头自连。
[0048]
(6)5’接头连接：向上步反应体系中依次加入5'adapter(如seq id no:2所示)1μl、10mm atp 1μl、t4 rna ligase 1μl(均购自于illumina公司，truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012)，混匀后28℃孵育1小时；
[0049]
其中，5’adapter(5’接头)为:guucagaguucuacaguccgacgauc(seq id no:2)
[0050]
(7)rna反转录：取6ul连接反应产物，加入rna rt primer 1ul，混匀后70℃孵育2分钟，然后置于冰上；依次加入5x first strand buffer 2μl、12.5mm dntp mix 0.5μl、100mm dtt 1ul、rnase inhibitor 1μl、superscript ii reverse transcriptase 1μl，混
匀后50℃孵育1小时；其中除superscript ii reverse transcriptase购自于invitrogen，货号18064014，200u/μl，其他试剂均购自于illumina公司，truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012。
[0051]
其中所用到的rna rt primer(rna反转录引物)来自于truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012，其序列为seq id no:3所示：
[0052]
gccttggcacccgagaattcca(seq id no:3)。
[0053]
(8)模板扩增：向上步反应体系中依次加入ultra pure water 8.5μl、pcr mix 25μl(购自于illumina公司，truseq small rna library preparation kits，货号rs-200-0012)、rna pcr primer(如seq id no:4所示)2μl、rna pcr index primer(如seq id no:5所示)2μl，混匀后进入pcr反应程序：
[0054]
98℃变性30秒，三步法11个循环：98℃变性10秒、60℃退火30秒、72℃延伸15秒，72℃延伸10分钟，降温至4℃。
[0055]
其中，rna pcr primer为：
[0056]
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga(seq id no:4)
[0057]
rna pcr index primer为：
[0058]
caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seq id no:5)
[0059]
(9)上机测序：取pcr产物，点样至6％浓度的聚丙烯酰胺胶，切胶回收140-200bp片段。并使用illumina nextseq 500 se75测序。
[0060]
(10)数据分析：
[0061]
首先，测序数据过滤处理，去除符合以下条件的tag：
[0062]
1)去除测序质量较低的tag；
[0063]
2)去除有5’接头污染的tag；
[0064]
3)去除没有3’接头序列的tag；
[0065]
4)去除没有插入片段的tag；
[0066]
5)去除小于1 8nt的tag；
[0067]
6)去除大于50nt的tag；
[0068]
然后将过滤处理后的数据与参考数据库进行比对：
[0069]
1)将长度为18-29nt的tag，比对到含mirbase、rfam、sirna、pirna、snorna在内的数据集合；
[0070]
2)长度为30-50nt的tag，比对到含refseq和noncode在内的数据集合；
[0071]
根据比对结果，整理见下表1和图3所示。
[0072]
表1 数据比对结果
[0073][0074]
表1和图3中，ribosomal rna gene指的是核糖体rna，序列通常高度保守，研究价值不大；incrna fragments指的是长链非编码rna；small nucleolar rna指的是小核rna，序列通常高度保守，研究价值不大。
[0075]
从表1所示出的结果可以看出，对照组中，测得数据几乎全部来自mirna(在76％左右)；而实验组数据中，则包含除mirna(约24％)外的其他大量组分(mrna片段9.4％、incrna片段17％，sirna 8.8％)。本发明所提供的方法能够减少mirna的相对丰度，用来检测更多的mrna、incrna以及sirna等组分，对展开下游其生物学意义的研究具有重要价值。
[0076]
对比例1
[0077]
对比例1提供了一种small rna文库的制备方法，其与实施例1实验组不同的是，在制备small文库的过程中，首先将富集的small rna同时和t4多聚核苷酸激酶以及rna 5’焦磷酸水解酶进行孵育，将孵育后的产物再依次连接3’接头和5’接头，并进行后续的rna反转录，模板扩增，上机测序等步骤。
[0078]
实验结果发现：在测序数据中，sirna的tags占比没有明显提高，也就是说，sirna在测得数据中的占比相较于实施例1中的对照组来说没有明显提高。不受理论限制，其中一个原因是：当反应底物序列较短时，rpph的工作效率可能会降低，因此在建库过程中，将富集的small rna同时和t4多聚核苷酸激酶以及rpph孵育，再依次连接3’接头和5’接头，此时rpph的作用底物未连接3’接头，序列较短，酶作用效率低，影响到目标短rna片段的检测效率。因此应先进行3’接头的连接反应(例如，此时可以使得序列长度增加21nt)，然后再利用rpph进行脱磷酸处理，有助于提高rpph的工作效率。
[0079]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0080]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0081]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述
实施例进行变化、修改、替换和变型。