棉花GhMADS41-A04基因在促进植物开花中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及ghmads41-a04基因在促进植物开花中的应用。

背景技术：

棉花是我国最重要的经济作物之一，在国民生产中占有重要地位，但由于粮棉争地，在一定程度限制了棉花的发展。短季棉品种的选育和推广，可以缓解粮棉争地的矛盾，是实现粮棉双丰收的有效途径。但目前短季棉存在早熟性不够的问题。

早熟性作为棉花的重要性状之一，成为陆地棉重要的育种目标。研究表明，开花早晚与棉花的早熟性密切相关。因此选取开花相关基因作为研究对象，对其进行表达分析和转基因功能验证，为短季棉育种提供优质的基因资源。

ap1基因的表达可以触发花的形成和提前开花。研究表明利用camv35s启动子使ap1基因在拟南芥组成型中表达，转基因拟南芥开花时间早于野生型，35s::ap1转基因植株不论在长日照还是在短日照条件下都能提早开花。将ap1基因转化到矮牵牛，转基因矮牵牛r0代表现出提前且持续不断的开花特性。同时将ap1基因和lfy基因导入柑橘，转基因柑桔当年开花结果。将ap1基因转入‘玉人面’地被菊、使之提早开花。由此说明，ap1基因具有促进植物开花的作用，且此作用在不同植物间具有保守性。

技术实现要素：

发明人从陆地棉中克隆出棉花ghmads41-a04基因，与陆地棉中的mads41基因具有高度同源性，与拟南芥中的ap1同源。表达模式发现其在棉花幼苗顶芽中优势表达，并且在棉花三叶期(花芽分化时期)表达量升高，并在早熟品种的表达量显著高于晚熟品种；构建该基因的过表达载体，蘸花法转化拟南芥，引起过表达拟南芥植株抽薹开花显著提前；利用病毒诱导的基因沉默(vigs)技术进一步验证了ghmads41-a04在棉花中的功能，并观察到被沉默的植株与在相同生长状态下生长的ck相比出现明显晚花。因此认为ghmads41-a04在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。从而完成本发明。

本发明提供了ghmads41-a04基因在提高促进植物开花中的应用，所述ghmads41-a04基因具有seqidno:1所示的核苷酸序列。该基因的开放阅读框为747bp。

在本发明的一些实施方案中，seqidno:1所示的核苷酸序列能够编码seqidno:2所示氨基酸序列。该氨基酸序列包含248个氨基酸，蛋白的相对分子量为28.76kda，等电点为8.92。

在本发明的一些实施方案中，在植物中提高ghmads41-a04基因的表达量，以促进植物开花。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的在植物中提高ghmads41-a04基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源ghmads41-a04基因的表达，或在植物中过表达外源ghmads41-a04基因。

在本发明的一个具体要求实施方案中所述过表达外源ghmads41-a04基因是指将所述ghmads41-a04基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。

进一步地，所述ghmads41-a04基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

更进一步地，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述ghmads41-a04基因的表达。

再进一步地，所述组成型启动子是35s启动子。

在本发明中，所述促进开花是指促使植物开花期提前。

在本发明中，所述植物是棉花、玉米、水稻、小麦或拟南芥。

本发明的有益效果

本发明通过转基因技术获得的转ghmads41-a04基因的拟南芥植株，使得拟南芥开花时间显著提前。进一步通过沉默棉花中ghmads41-a04基因，结果表明ghmads41-a04基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用。本发明为短季棉培育提供了有利的基因资源。

附图说明

图1a示出了野生型拟南芥(wild-type)的表型观察；图1b示出了转基因拟南芥35s::ghmads41-a04的表型观察；图1c示出了转基因株系和对照中ghmads41基因的表达量。

图2a示出了ghmads41-a04在不同生育期材料的表达量；图2b示出了ghmads41-a04在不同组织的表达量。

图3示出了病毒诱导的ghmads41-a04基因沉默及表达分析。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1

1.棉花材料

本实施例选取的棉花材料为陆地棉中50、中棉所74、国欣棉11号、渤棉1号，种植于中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室试验田(安阳白璧)，管理措施为正常大田管理。

2.试剂与耗材

2.1酶及试剂盒：gxldnapolymerase高保真酶、胶回收试剂盒、pcr产物纯化试剂盒均购自takara公司；rna反转录试剂盒、kodfxneo酶(code.no.kfx-201)购自toyobo公司；ultraonestepcloningkit试剂盒购自vazyme公司；质粒少量提取试剂盒购自magen公司；限制性内切酶(bamhi、saci)购自neb公司；dnamarkeriii、植物总rna提取试剂盒购自tiangen公司；荧光定量transstarttopgreenqpcrsupermix购自transgen公司。

2.2其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、蔗糖、silwetl-77、间苯三酚等为国产分析纯，卡纳霉素、硫酸链霉素、氨苄青霉素等购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌感受态细胞trans5α购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌感受态细胞lba4404购自上海唯地生物技术有限公司。

2.3培养基：lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l；lb固体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l、琼脂粉(agar)15g/l，定容至1l；lb选择培养基：在lb铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。本文中提到的但未列出的各种试剂溶液均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。

2.4主要仪器：pcr扩增仪(eppendorf)、高速离心机(eppendorf5427r)、电泳设备(北京六一)、凝胶成像系统(bio-rad)、荧光定量pcr仪(abi7500)、荧光显微镜(olympusbx43)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)等。

实验方法与结果

1棉花ghmads41-a04基因的生物信息学分析与克隆

1.1从ncbi上获得ghmads41-a04的基因序列，采用primerpremier5.0软件设计引物，采用pcr(polymerasechainreaction)的方法从陆地棉中50中扩增，其开放阅读框为747bp，编码248个氨基酸，蛋白的相对分子量为28.76kda，等电点为8.92。基因cds序列为(seqidno:1)：

atgggaagaggtagggttcaattaaaaaggattgaaaacaagatcaacagacaagttactttttccaaaagaagagctggtttattgaagaaagctcatgagatctctgttctttgtgatgctgaagttgctttaattgtcttctcccataaaggcaaactctttgagtactcaactgattcctgtatggaaaagatacttgaacgctatgaaaggtattcctatgctgagagacagcttgttgctactgaatctcaacctcagggcaactggtccatggagtataatagacttaaggctaaggttgacctcttgcagaaaaatcacaggcactatatgggagaagatttggactcactgagtctcaaggagctacagaatttggaacaacagcttgatactgctattaaacacattcgatctaaaaaaaaccaactcatctccgagtcaatctctgagttgcagagaaaggagaaggcaatacaggagcaaaacgccatgctagcaaagcagatcaaggaaagggagaaaacggtggcgcaggcacagcagtcgcagtgggggcagcaccaacagcagcttggcctcaacacatcaacatctttcctgctgcctcagccgccgcatccttgtttgaatatcggtgggacataccaggaagaagcaactgatcaagtgaggaggaatgaacttgaccttacccttgaacctatttatacctgccatctgggatattttgctgcatga

氨基酸序列为(seqidno:2)：

mgrgrvqlkrienkinrqvtfskrragllkkaheisvlcdaevalivfshkgklfeystdscmekileryerysyaerqlvatesqpqgnwsmeynrlkakvdllqknhrhymgedldslslkelqnleqqldtaikhirskknqlisesiselqrkekaiqeqnamlakqikerektvaqaqqsqwgqhqqqlglntstsfllpqpphpclniggtyqeeatdqvrrneldltlepiytchlgyfaa

1.2具体克隆基因的过程为：

(1)试验材料陆地棉早熟品种中50、中棉所74以及晚熟品种国欣棉11号、渤棉1号种植于中国农业科学院棉花研究所安阳试验基地，按一般大田管理。取样方式为从子叶展平时开始取棉一苗顶尖，每展平一片真叶取一次样，每次三个生物学重复，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。子叶展平时标记为0tls(0true-leafstage)，一片真叶展平时标记为1tls(1true-leafstage)，往后类推,一直取到第五片真叶完全展开。植物总rna提取采用tiangen公司试剂盒。

(2)rna的提取步骤为：

1)匀浆处理：取适量纤维样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μlsl(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀；

2)12,000rpm离心2min；

3)将上清液转移至过滤柱cs上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片；

4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱cr3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；

5)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；

6)dnasei工作液：取10μldnasei储存液和70μlrdd溶液轻柔混匀；

7)向cr3中加入80μl的dnasei工作液，室温静止15min；

8)静置完后，向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；

9)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；

10)重复步骤9；

11)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到rna溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。rna样品请在-70℃中保存。如果预期rna得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的rna溶液再加入吸附柱cr3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到rna溶液。

(3)cdna的合成。将500ngrna反转录为cdna，采用toyobo的反转录试剂盒fsq-201，反转录体系为：

按下列组份配制rt反应液(反应液配制在冰上进行)：

反转录反应条件如下：

37℃15min(反转录反应)，

98℃5s(反转录酶的失活反应)；

将反转录产物cdna溶液稀释6倍作为pcr反应模板。

(4)pcr扩增目的基因

在冰上配制以下体系，用tm-1的cdna为模板扩增目的基因ghmads41-a04。根据takaragxldnapolymerase高保真酶说明书，pcr反应体系如下：

pcr扩增程序为：

引物序列：

ghmads41-a04-f：5′-atgggaagaggtagggttcaa-3′(seqidno:3)

ghmads41-a04-r：5′-tcatgcagcaaaatatcccag-3′(seqidno:4)

反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果。

(5)对目的片段使用胶回收试剂盒进行切胶回收。

(6)将上述胶回收的产物根据ultraonestepcloningkit试剂盒进行连接t载体构建和转化大肠杆菌。

(7)37℃过夜培养从抗性lb培养基上挑取单克隆后37℃摇菌培养。

(8)菌液pcr验证，挑取阳性克隆样品，送样至金唯智生物科技有限公司测序，测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-70℃保存。

2植物过表达载体pbi121-35s::ghmads41-a04的构建

2.1质粒提取及酶切

质粒提取采用magen公司质粒少量提取试剂盒，提取含有目的基因ghmads41-a04片段的克隆载体质粒，质粒浓度经检测为200ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，无蛋白污染，达到试验要求；同时提取过表达载体pbi121，选用内切酶bamhi、saci进行双酶切，酶切后纯化获得线性化的pbi121载体。

2.2pbi121-35s::ghmads41-a04过表达载体的构建

本试验载体构建采用ultraonestepcloningkit试剂盒，该试剂盒适用于任意载体与任意基因片段的连接，反应时间仅需15min，要求插入片段与线性化载体分别在5′端和3′端有15bp重叠区域。

扩增引物为：

oe-ghmads41-a04f(seqidno:5)：

5′-ggactctagaggatccatgggaagaggtagggttcaa-3′

oe-ghmads41-a04r(seqidno:6)：

5′-gatcggggaaattcgagctctcatgcagcaaaatatcccag-3′

其操作程序如下：以目的基因ghmads41-a04的克隆载体为模板，扩增后纯化插入片段；将获得的插入片段ghmads41-a04与pbi121线性化载体按照2:1的摩尔比例配置体系。

将上述溶液混匀，50℃下反应10min，然后放在冰上，转化trans5α感受态细胞，挑取单克隆，送样测序，获得包含正确目的基因的过表达载体。

该过程使用平板为抗卡那霉素的lb抗性培养基，配制的卡那霉素50mg/ml，用时稀释1000倍，即100ml的培养基加入100μl的50mg/ml卡那霉素。

3ghmads41-a04基因棉花vigs载体构建及侵染

病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilence，vigs)是一种依赖于植物对病毒的防御机制而产生的，由rna介导的转录后基因沉默。将目标基因ghmads41-a04的一段长度为322bp的片段连接到穿梭质粒pclcrv中，构建载体(pclcrv-ghmads41-a04)转化大肠杆菌(escherichiacoli)，挑单克隆，送样测序(金唯智，苏州)。测序成功的单克隆，扩摇，提取质粒。将阳性对照载体(pclcrv-va)、阴性对照(pclcrv)、辅助质粒(pclcrv-vb)以及构建的含有ghmads41-a04基因目标片段的载体(pclcrv-ghmads41-a04)分别转化农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株lba4404。在子叶展平而真叶还没有长出的时期，采用农杆菌注射、侵染棉花子叶的方法，详细操作步骤参加gao等人(2013)关于棉花病毒诱导的基因沉默的报道(gaoetal.，functionalgenomicanalysisofcottongeneswithagrobacterium-mediatedvirus-inducedgenesilencing.methodsmolbiol(2013),975157-65；guetal.，aversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicrornasincotton，plantbiotechnologyjournal(2014)12,pp.638–649，通过引用全文并入此处)。侵染后的棉花幼苗避光处理24h，40天后提取棉花叶片的总rna，利用qrt-pcr技术检测基因的沉默情况。

扩增引物为：

pclcrv-ghmads41-a04f(seqidno:7)：

5′-atgcctgcagactagtaaaaaaaaccatctcatctccg-3′

spei

pclcrv-ghmads41-a04r(seqidno:8)：

5′-agacctaggggcgcgccgcaggtataaataggttcaagg-3′

asci

4利用农杆菌介导的方法转化ghmads41-a04基因于拟南芥

4.1利用冻融法转化根癌农杆菌lba4404感受态细胞，具体转化过程如下：

(1)向上海唯地生物的根癌农杆菌lba4404感受态细胞100μl中加入构建好的目的基因过表达载体质粒1μg(2-10μl)，混匀后冰浴30min；液氮速冻2-3min，37℃热激90s；

(2)冰浴5min，再加入800μllb液体培养基；

(3)190rpm，28℃，培养4h后，4000rpm离心5分钟，吸去上清液至剩余400-500μl，反复吸打混匀后取200μl菌液涂在含有卡那霉素、硫酸链霉素和利福平的三抗筛选培养基上，28℃培养大约36-48h，抗性菌落可见；

(4)挑取单菌落在1ml的含有三抗的lb液体培养基中培养16h左右，直至浑浊；

(5菌落pcr和酶切鉴定，筛选出阳性农杆菌株，20％甘油菌液于-80℃保存。

4.2采用花序浸染法转化拟南芥

(1)将-80℃保存的农杆菌菌液20μl接种到1mllb液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μl加入到20mllb液体培养基28℃、180rpm振荡培养；

(2)待菌液od值约为1.2-1.6时，3000rpm离心菌液收集菌体；

(3)转化介质配方为：5％蔗糖，0.03％silwetl-77(stevenj，1998)；

(4用上述转化介质悬浮菌体，调od600＝0.8开始浸染；

(5)将拟南芥花序置于转化介质中30-50s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养24h后置于正常条件下培养，待成熟后收获种子。

5转基因拟南芥植株的鉴定与检测

5.1将收获的种子后用0.1％hgcl溶液对种子进行消毒，然后在4℃条件下纯化3-4天后，种植于含卡那霉素的1/2ms上(琼脂浓度0.6％)，10天左右会观察到阳性、阴性植株区别，能够正常生长的可能为阳性株，移栽能够正常生长的拟南芥到培养室。

5.2对于转基因植株筛选所用的酶为kodfxneo的pcr酶，该酶的最大特点是不用提取拟南芥的dna，可以直接用活体叶片进行pcr。鉴定时用ghmads41-a04的农杆菌菌液作为阳性对照，灭菌水为模板的pcr体系为阴性对照。检测时所用引物为：

上游引物f1(seqidno:9)：5’-gacgcacaatcccactatcc-3’

下游引物r1(seqidno:10)：5’-tcatgcagcaaaatatcccag-3’

pcr的反应体系：

pcr的扩增程序：

5.3分别取适量扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

5.4根据电泳结果筛选出35s::ghmads41-a04阳性株系共5株，收获t0代种子。

6转基因植株的鉴定、表型观察与数据统计

6.1将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2ms上，后进行4℃春化3天，转移到人工气候培养箱中，10天左右阳性植株生长正常，而阴性植株子叶变黄，不再生长。

6.2将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取dna再用pcr进行检测。每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至t3代，获得纯合转基因拟南芥株系。

6.3t3代纯合转基因株系用做植株表型观察及数据统计，如图1；

对t3代转基因株系及野生型拟南芥的植株表型观察，我们发现ghmads41-a04基因的过表达株系能使拟南芥开花时间显著提前(图1a和b)，莲座叶数目显著减少，茎生叶数目增多。对转基因株系进行基因检测发现：过表达ghmads41-a04基因后，转基因拟南芥株系中ghmads41-a04基因的表达量显著升高(图1c)。

7ghmads41-a04在不同生育期材料中的表达模式分析

7.1试验材料陆地棉早熟品种中50、中棉所74以及晚熟品种国欣棉11号、渤棉1号种植于中国农业科学院棉花研究所安阳试验基地，按一般大田管理。取样方式为从子叶展平时开始取棉一苗顶尖，每展平一片真叶取一次样，每次三个生物学重复，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。子叶展平时标记为0tls(0true-leafstage)，一片真叶展平时标记为1tls(1true-leafstage)，往后类推，一直取到第五片真叶完全展开。

7.2取上述不同样品，提取rna，反转录成cdna，对不同材料中的ghmads41-a04基因的表达量进行分析，ghactin作为内参基因，其荧光定量pcr的引物如下：

冰上配制qrt-pcr反应体系，进行荧光定量pcr反应。

qrt-pcr反应体系为：

qrt-pcr反应程序：

植物的顶端分生组织类似于动物的干细胞，不断分化出植物的各种地上组织器官，当内外条件合适时，顶端分生组织就会分化出花芽。从qrt-pcr的结果可以看出，ghmads41-a04基因在整花、顶芽、小蕾中优势表达，在小蕾中表达量最高(图2，b)。随着棉花顶芽的发育，ghmads41-a04基因在不同生育期材料中的表达量都呈上升趋势，从第三片真叶展开时期，在两个早熟品种中50和盐早2号的表达量显著高于晚熟材料中的表达(图2，a)。表明ghmads41-a04基因可能与陆地棉花芽分化甚至花器官的发育有关。

7病毒诱导的ghmads41-a04基因沉默

分别用阳性对照(pclcrva)，阴性对照(pclcrv)以及ghmads41-a04的病毒载体(pclcrv-ghmads41-a04)的农杆菌菌液分别注射棉花幼苗的子叶。注射四周后检测被注射植株的ghmads41-a04基因表达情况。如图3，被含有pclcrv-ghmads41-a04病毒载体侵染后，ghmads41-a04基因的表达量与空载体对照相比较极显著下调。与空载体pclcrva植株相比，ghmads41-a04基因表达量极显著下调的pclcrv-ghmads41-a04植株出现显著晚花表型，并且植株表现矮小(图3，a)。研究表明，ghmads41-a04在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所、山东众力棉业科技有限公司

<120>棉花ghmads41-a04基因在促进植物开花中的应用

<130>xy-2019-1-w-035

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>747

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgggaagaggtagggttcaattaaaaaggattgaaaacaagatcaacagacaagttact60

ttttccaaaagaagagctggtttattgaagaaagctcatgagatctctgttctttgtgat120

gctgaagttgctttaattgtcttctcccataaaggcaaactctttgagtactcaactgat180

tcctgtatggaaaagatacttgaacgctatgaaaggtattcctatgctgagagacagctt240

gttgctactgaatctcaacctcagggcaactggtccatggagtataatagacttaaggct300

aaggttgacctcttgcagaaaaatcacaggcactatatgggagaagatttggactcactg360

agtctcaaggagctacagaatttggaacaacagcttgatactgctattaaacacattcga420

tctaaaaaaaaccaactcatctccgagtcaatctctgagttgcagagaaaggagaaggca480

atacaggagcaaaacgccatgctagcaaagcagatcaaggaaagggagaaaacggtggcg540

caggcacagcagtcgcagtgggggcagcaccaacagcagcttggcctcaacacatcaaca600

tctttcctgctgcctcagccgccgcatccttgtttgaatatcggtgggacataccaggaa660

gaagcaactgatcaagtgaggaggaatgaacttgaccttacccttgaacctatttatacc720

tgccatctgggatattttgctgcatga747

<210>2

<211>248

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metglyargglyargvalglnleulysargilegluasnlysileasn

151015

argglnvalthrpheserlysargargalaglyleuleulyslysala

202530

hisgluileservalleucysaspalagluvalalaleuilevalphe

354045

serhislysglylysleupheglutyrserthraspsercysmetglu

505560

lysileleugluargtyrgluargtyrsertyralagluargglnleu

65707580

valalathrgluserglnproglnglyasntrpsermetglutyrasn

859095

argleulysalalysvalaspleuleuglnlysasnhisarghistyr

100105110

metglygluaspleuaspserleuserleulysgluleuglnasnleu

115120125

gluglnglnleuaspthralailelyshisileargserlyslysasn

130135140

glnleuilesergluserilesergluleuglnarglysglulysala

145150155160

ileglngluglnasnalametleualalysglnilelysgluargglu

165170175

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180185190

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