从米糠粗甾醇中分离三萜醇和甾醇的方法与流程

本发明涉及米糠粗甾醇，尤其是涉及一种从米糠粗甾醇中分离三萜醇和甾醇的方法。

背景技术：

随着人们对健康的日益重视，三萜及植物甾醇在食品、医药、保健、饲料添加、美容护肤等领域的作用越来越大。三萜是一类基本母核由30个碳原子所组成的萜类化合物，具有降低胆固醇、润肤护肤、保肝护肝、抗肿瘤、调节免疫、抗炎、镇痛镇静、抗衰老、抗氧化等作用。甾醇是一种固醇类化合物，广泛分布于自然界，具有良好的抗炎抗氧化作用，能抑制人体对胆固醇的吸收，预防治疗冠状动脉粥样硬化类心脏病，促进伤口愈合，使肌肉增生，增强毛细血管循环，保持皮肤表面水份，促进皮肤新陈代谢，可以作为重要的甾体药物和维生素d3的生产原料，还有生发、养发等功效。

目前三萜主要直接从植物性前体或灵芝、牛樟芝等菌类中得到，也有发明直接由谷维醇水解得到。如中国专利cn109364119a从青钱柳叶中，经醇提、萃取、聚酰胺柱分离、大孔树脂柱分离得到三萜，但成本高、产量低、操作复杂；如中国专利cn109265510a从苦瓜叶粗粉经浸提、萃取、梯度洗脱、半制备液相色谱纯化等步骤得到三萜，但该方法难以工业化；如中国专利cn1261448c从灵芝中超声循环浸提、氯仿溶解、超声循环碱提、盐酸酸化、超声循环萃取、减压蒸干提取灵芝三萜，但该方法过程复杂、溶剂毒性高；如中国专利cn103080124a从γ-谷维醇经碱水解、提取、冷却得到三萜醇，该发明的三萜醇由γ-谷维醇经化学反应得到。也有发明从米糠中得到三萜醇，如中国专利cn106102746a由米、米糠及其提取物、植物油、γ-谷维素等经醇提、水解、再结晶纯化得到三萜醇，该三萜醇再经硅胶色谱和ods色谱分离得到两类三萜，但一方面，该方法未实现甾醇和三萜醇的分离；另一方面，该方法的米糠提取物本身可直接作为产品，原料具有经济价值。

植物甾醇主要从各类植物油脱臭馏出物中通过分离提取、重结晶提纯等程序得到，操作简单但提取率低。如中国专利cn109422792a用植物油脱臭馏出物经过酯化、结晶、重结晶的方法得到甾醇。植物油脱臭馏出物产量有限，需要大量进口，且其中甾醇含量很少。目前也有发明从植物油精炼副产物中得到甾醇，如中国专利cn102898491a用稻米油碱炼皂角经乙醚萃取、冷冻结晶、醇溶和活性炭脱色得到植物甾醇。如中国专利cn101643495a使用脂肪酸或脂肪酸甲酯蒸馏黑脚经皂化，钙皂化、萃取和重结晶等工艺得到甾醇，但这些发明未能在获取甾醇的同时实现三萜醇的富集。

米糠油是一种从稻谷加工副产物米糠中得到的油，在我国，米糠油原料十分丰富。米糠油中含有丰富的b族维生素、维生素e、阿魏酸、角鲨烯、谷维素、甾醇、三萜醇等几十种天然生物活性成分，是一种利于高血脂、心脑血管患者的油。目前，工厂常由米糠毛油经脱胶、脱色、脱酸等工艺或多级分子蒸馏等方法得到米糠油和谷维素、阿魏酸、甾醇、米糠蜡、脂肪酸等。在提取谷维素、米糠蜡和脂肪酸时会产生废弃物米糠粗甾醇，米糠粗甾醇中含有丰富的植物甾醇和三萜醇等有效成分。据调查发现，米糠粗甾醇的来源非常丰富，一座年产10万吨的米糠油厂，一年会产生约500吨的废弃米糠粗甾醇，由于技术限制，目前还未实现对米糠粗甾醇的利用，导致宝贵的米糠粗甾醇资源被闲置或作为固废被丢弃，造成了环境污染和巨大的资源浪费。随着米糠油的作用越来越被人们熟知，米糠油的销量也越来越广，其生产过程中产生的废弃物米糠粗甾醇的量也越来越多，因此如何实现废物资源化，对米糠粗甾醇的利用就显得非常必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于从米糠粗甾醇中分离得到高纯度三萜醇和甾醇；本发明可以直接从废弃物米糠粗甾醇中分离得到两种有用物质：甾醇和三萜醇，实现了废物利用，避免了米糠粗甾醇固废对环境的污染；本发明工艺步骤少，可实现工厂化，操作条件温和，溶剂毒性低，产品收率高，产品纯度高达99％。

本发明包括以下步骤：

1)将米糠粗甾醇与醇、碱混合得混合液a，皂化反应后得到皂化液b；

2)将皂化液b进行蒸发，蒸发浓缩后加入水，再用有机溶剂萃取，合并有机溶剂层得萃取液；

3)将萃取液加入酸，中和ph值后水洗、旋干，回收有机溶剂层得到不皂化物c；

4)将步骤3)所得不皂化物c上硅胶柱过柱分离，用流动相洗脱，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，旋干即得所述甾醇和三萜醇。

在步骤1)中，由米糠毛油分离得到米糠油层和含脂肪酸、甾醇、谷维素等的有机溶剂层，该有机溶剂层分离谷维素、米糠蜡和脂肪酸之后得到的废弃物即为米糠粗甾醇；所述醇可选自乙醇或甲醇等中的至少一种；所述碱可选自氢氧化钠、氢氧化钾等中的至少一种；所述碱、米糠粗甾醇、醇的配比可为1g︰(1.2～5)g︰(50～1000)ml，其中，碱、米糠粗甾醇以质量计算，醇以体积计算；所述皂化反应可选择常温皂化或热皂化；所述常温皂化的具体方法为：将混合液a加入醇、碱后超声，在功率为250～300w，赫兹为20～50khz下，超声分散10～30min，然后常温放置12～48h得到皂化液；所述热皂化的具体方法可为：将混合液a加入醇、碱后，在功率为250～300w，赫兹为20～50khz下，超声分散10～30min，然后在60～80℃下回流皂化2～6h，得到皂化液b；

在步骤2)中，所述蒸发可在30～45℃下蒸发至原体积的一半；所述水与蒸发浓缩后的皂化液的体积比可为(0.8～100)︰1；所述有机溶剂可选自乙酸乙酯、乙醚、石油醚、正己烷等中的至少一种；所述萃取可萃取至少一次。

在步骤3)中，所述酸可选自稀盐酸或稀硫酸，所述稀盐酸质量百分数可为10％～35％，所述稀硫酸质量百分数可为10％～80％。

在步骤4)中，所述过柱用的填料可为100～300目硅胶；所述洗脱可采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂或乙醚和石油醚的混合溶剂进行洗脱，流速为1滴/s；所述乙酸乙酯和石油醚的体积比可为1︰(1～8)，所述乙醚和石油醚的体积比可为1︰(1～8)；

在步骤4)中，所述硅胶柱也可采用再生硅胶柱；所述再生硅胶柱可由使用后的硅胶柱再生处理获得；所述硅胶柱再生处理的具体方法可为：将使用后的硅胶柱先用高极性溶剂洗脱，再用流动相洗脱平衡，得到再生硅胶柱；所述高极性溶剂可为2～10倍柱体积的纯乙酸乙酯、纯乙醚溶剂；所述流动相洗脱可采用2～10倍柱体积的乙酸乙酯和石油醚混合溶剂或乙醚和石油醚混合溶剂，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比可为1︰(1～8)，所述乙醚和石油醚的体积比可为1︰(1～8)；所述使用后的硅胶柱可重复再生3次，依然能达到较好的分离效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明提供了一种由米糠粗甾醇直接分离得到三萜醇和甾醇的生产工艺。

2)与传统甾醇分离工艺相比，本发明工艺直接采用米糠油提取过程中得到的废料米糠粗甾醇，不但解决了废料米糠粗甾醇的固废处理问题，还实现了废物资源化，创造可观的经济效益。

3)本发明在分离三萜醇的同时，还能得到精甾醇。由于植物甾醇和三萜都由甲戊二羟酸的生物途径合成得到，结构类似，且两者都为混合物，理化性质相似；而且植物甾醇和三萜醇在分离过程中会残留在硅胶柱中，难以全部洗脱收集；同时米糠粗甾醇中的杂质难以与甾醇和三萜醇分离，所以，甾醇和三萜醇的分离难度很大。在本发明中，使用的米糠粗甾醇中甾醇含量为22.09％，三萜醇含量为77.60％，杂质含量为0.31％，分离得到的甾醇的纯度高达99％,收率高达27％；三萜醇的纯度高达99％,收率高达55％。

4)本发明还对硅胶柱进行了再生处理，并对其再生之后分离效果进行了研究，发现硅胶柱重复再生3次依然能达到较好的分离效果，节约了硅胶成本。

附图说明

图1为实施例1中米糠粗甾醇的gc-ms图。

图2为实施例1中硅胶使用一次时由米糠粗甾醇分离得到的甾醇的gc-ms图。

图3为甾醇的gc-ms图中峰1的质谱信息。

图4为在gc-ms库中搜索得到的与峰1相似的甾醇分子1的质谱信息。

图5为甾醇的gc-ms图中峰2的质谱信息。

图6为在gc-ms库中搜索得到的与峰2相似的甾醇分子2的质谱信息。

图7为实施例1中硅胶使用一次时由米糠粗甾醇分离得到的三萜醇的gc-ms图。

图8为三萜醇的gc-ms图中峰3的质谱信息。

图9为在gc-ms库中搜索得到的与峰3相似的三萜醇分子3的质谱信息。

图10为三萜醇的gc-ms图中峰4的质谱信息。

图11为在gc-ms库中搜索得到的与峰4相似的三萜醇分子4的质谱信息。

图12为三萜醇的gc-ms图中峰5的质谱信息。

图13为在gc-ms库中搜索得到的与峰5相似的三萜醇分子5的质谱信息。

图14为三萜醇的gc-ms图中峰6的质谱信息。

图15为在gc-ms库中搜索得到的与峰6相似的三萜醇分子6的质谱信息。

由每个峰的质谱信号和谱库检索结果对比可知峰1、2为甾醇类物质的峰，峰3、4、5、6为三萜醇类物质的峰。由图1、图2、图7可知本发明可以实现在米糠粗甾醇中分离得到高纯度的甾醇和三萜醇。

具体实施方式

为使得本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，以下实施例将结合附图对本发明的做详细的说明。

本发明实施例所使用的米糠粗甾醇来自于米糠油精制过程中经米糠毛油提取米糠油、谷维素、米糠蜡和脂肪酸之后得到的废弃物。其中甾醇含量为22.09％，三萜醇含量为77.60％，其他物质含量为0.31％；本发明实施例中所使用的硅胶购于上海泰坦科技股份有限公司；本发明中所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用气相色谱-质谱联用仪检测各物质的含量。

实施例1：一种从米糠粗甾醇中分离甾醇和三萜醇的方法，包括以下步骤：

1)皂化：将1g米糠粗甾醇与100ml乙醇，1.4g氢氧化钾混合，在40khz下超声分解10mi后，放入烧瓶中在氮气保护下加热回流约6h，得到皂化液。

2)萃取：皂化结束后立即打开回流装置，继续加热，蒸发掉约一半的乙醇。蒸发浓缩后加入100ml水，再用乙醚多次萃取，合并有机溶剂层得到萃取液。

3)中和、蒸发：将萃取液加入质量百分数为25％的稀盐酸，使得中和后ph为7，再水洗分液，蒸发旋干，得到不皂化物c。

4)过柱分离：将步骤3)所得的不皂化物c湿法上硅胶柱(硅胶粒径300～400目，质量50g，柱径高比为10︰1)吸附，用乙醚︰石油醚(体积比为1︰4)的流动相洗脱，洗脱液流速为1滴/s，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，减压蒸馏得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

5)硅胶柱再生：将使用后的硅胶柱用纯乙醚洗脱约3个柱体积后，再用乙醚︰石油醚(体积比为1︰4)的洗脱平衡约3个柱体积，并使用洗脱液浸泡硅胶柱过夜，得到再生硅胶柱。

6)再生硅胶柱过柱分离：将再次获得的不皂化物c上再生硅胶柱，用乙醚︰石油醚(体积比为1︰4)的洗脱液洗脱，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，浓缩得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

实施例1所得甾醇和三萜醇纯度测定使用气相色谱-质谱联用检测。硅胶使用一次时得到的甾醇纯度、三萜醇纯度测定结果及谱库检索结果见说明书附图。

图1给出实施例1中米糠粗甾醇的gc-ms图，可知米糠粗甾醇中甾醇含量为22.09％，三萜醇含量为77.60％，杂质含量为0.31％。

图2给出实施例1中硅胶使用一次时由米糠粗甾醇分离得到的甾醇的gc-ms图，可知此甾醇纯度为99.26％。

图3给出甾醇的gc-ms图中峰1的质谱信息。

图4给出在gc-ms库中搜索得到的与峰1相似的甾醇分子1的质谱信息。

图5给出甾醇的gc-ms图中峰2的质谱信息。

图6给出在gc-ms库中搜索得到的与峰2相似的甾醇分子2的质谱信息。

图7给出实施例1中硅胶使用一次时由米糠粗甾醇分离得到的三萜醇的gc-ms图，可知此三萜醇纯度为99.35％。

图8给出三萜醇的gc-ms图中峰3的质谱信息。

图9给出在gc-ms库中搜索得到的与峰3相似的三萜醇分子3的质谱信息。

图10给出三萜醇的gc-ms图中峰4的质谱信息。

图11给出在gc-ms库中搜索得到的与峰4相似的三萜醇分子4的质谱信息。

图12给出三萜醇的gc-ms图中峰5的质谱信息。

图13给出在gc-ms库中搜索得到的与峰5相似的三萜醇分子5的质谱信息。

图14给出三萜醇的gc-ms图中峰6的质谱信息。

图15给出在gc-ms库中搜索得到的与峰6相似的三萜醇分子6的质谱信息。

由每个峰的质谱信号和谱库检索结果对比可知峰1、2为甾醇类物质的峰，峰3、4、5、6为三萜醇类物质的峰。由图1、图2、图7可知本发明可以实现在米糠粗甾醇中分离得到高纯度的甾醇和三萜醇。

实施例1所得甾醇和三萜醇纯度及得率的测定结果见表1。

表1

实施例2：一种从米糠粗甾醇中分离甾醇和三萜醇的方法，包括以下步骤：

1)皂化：将1g米糠粗甾醇与100ml乙醇，1.4g氢氧化钾混合，在40khz下超声分解10min后，室温放置约24h，得到皂化液。

2)萃取：皂化结束后，加热皂化液蒸发掉约一半的乙醇。蒸发浓缩后加入100ml水，再用乙酸乙酯多次萃取，合并乙酸乙酯层得到萃取液。

3)中和、蒸发：将萃取液加入质量百分数为25％的稀盐酸，使得中和后ph为7，再水洗分液，蒸发旋干，得到不皂化物c。

4)过柱分离：将步骤3)所得的不皂化物c湿法上硅胶柱(硅胶粒径300～400目，质量50g，柱径高比为10︰1)吸附，用乙酸乙酯︰石油醚体积比为3︰7为流动相洗脱，洗脱液流速为1滴/s，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，减压蒸馏得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

5)硅胶柱再生：将使用后的硅胶柱用纯乙酸乙酯洗脱约3个柱体积后，再用乙酸乙酯︰石油醚体积比为3︰7洗脱平衡约3个柱体积，并使用洗脱液浸泡硅胶柱过夜，得到再生硅胶柱。

6)再生硅胶柱过柱分离：将再次获得的不皂化物c上再生硅胶柱，用乙酸乙酯︰石油醚体积比为3︰7洗脱，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，浓缩得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

实施例2所得甾醇和三萜醇纯度及得率的测定结果见表2，纯度测定方法与实施例1相同，使用气相色谱-质谱联用检测。

表2

实施例3：一种从米糠粗甾醇中分离甾醇和三萜醇的方法，包括以下步骤：

1)皂化：将5g米糠粗甾醇与500ml乙醇，9g氢氧化钾混合，在40khz下超声分解30min后，室温放置约24h，得到皂化液。

2)萃取：皂化结束后，加热皂化液蒸发掉约一半的乙醇。蒸发浓缩后加入300ml水，再用乙酸乙酯多次萃取，合并乙酸乙酯层得到萃取液。

3)中和、蒸发：将萃取液加入质量百分数为25％的稀盐酸，使得中和后ph为7，再水洗分液，蒸发旋干，得到不皂化物c。

4)过柱分离：将步骤3)所得的不皂化物c湿法上硅胶柱(硅胶粒径300～400目，质量200g，柱径高比为3︰2)吸附，用乙酸乙酯︰石油醚体积比为3︰7为流动相洗脱，洗脱液流速为1滴/s，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，减压蒸馏得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

5)硅胶柱再生：将使用后的硅胶柱用纯乙酸乙酯洗脱约3个柱体积后，再用乙酸乙酯︰石油醚体积比为3︰7洗脱平衡约3个柱体积，并使用洗脱液浸泡硅胶柱过夜，得到再生硅胶柱。

6)再生硅胶柱过柱分离：将再次获得的不皂化物c上再生硅胶柱，用乙酸乙酯︰石油醚体积比为3︰7洗脱，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，浓缩得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

实施例3所得甾醇和三萜醇纯度及收率的测定结果见表3，纯度测定方法与实施例1相同，使用气相色谱-质谱联用检测。

表3

实施例4：一种从米糠粗甾醇中分离甾醇和三萜醇的方法，包括以下步骤：

1)皂化：将5g米糠粗甾醇与500ml乙醇，9g氢氧化钾混合，在40khz下超声分解30min后，放入烧瓶中在氮气保护下加热回流约6h，得到皂化液。

2)萃取：皂化结束后立即打开回流装置，继续加热，蒸发掉约一半的乙醇。蒸发浓缩后加入300ml水，再用乙醚多次萃取，合并有机溶剂层得到萃取液。

3)中和、蒸发：将萃取液加入质量百分数为25％的稀盐酸，使得中和后ph为7，再水洗分液，蒸发旋干，得到不皂化物c。

4)过柱分离：将步骤(1)所得的不皂化物c湿法上硅胶柱(硅胶粒径300～400目，质量200g，柱径高比为3︰2)吸附，用乙醚︰石油醚体积比为1︰4为流动相洗脱，洗脱液流速为1滴/s，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，减压蒸馏得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

5)硅胶柱再生：将使用后的硅胶柱用纯乙醚洗脱约3个柱体积后，再用乙醚︰石油醚体积比为1︰4洗脱平衡约3个柱体积，并使用洗脱液浸泡硅胶柱过夜，得到再生硅胶柱。

6)再生硅胶柱过柱分离：将再次获得的不皂化物c上再生硅胶柱，用乙醚︰石油醚体积比为1︰4洗脱，收集洗脱液，通过薄层检测，合并甾醇洗脱液以及三萜醇洗脱液，浓缩得到所述高纯度甾醇和三萜醇。

实施例4所得甾醇和三萜醇纯度及收率的测定结果见表4，纯度测定方法与实施例1相同，使用气相色谱-质谱联用检测。

表4甾醇和三萜醇的纯度和得率测定结果

依据《gc-ms测定海龙与海星中甾醇类化合物的研究》中对甾醇类物质的测定使用气相色谱—质谱法，依据《气相色谱法测定竹茹中三萜化合物木栓酮的含量》中测定三萜使用气相色谱—质谱法，本发明使用气相色谱—质谱法，根据质谱裂解规律，并结合谱库检索结果，对各组分进行分析鉴定来检测样品中甾醇和三萜的含量。

实验证明，本发明在分离三萜醇的同时，还能得到精甾醇。由于植物甾醇和三萜都由甲戊二羟酸的生物途径合成得到，结构类似，且两者都为混合物，理化性质相似；而且植物甾醇和三萜醇在分离过程中会残留在硅胶柱中，难以全部洗脱收集；同时米糠粗甾醇中的杂质难以与甾醇和三萜醇分离，所以，甾醇和三萜醇的分离难度很大。在本发明中，使用的米糠粗甾醇中甾醇含量为22.09％，三萜醇含量为77.60％，杂质含量为0.31％，分离得到的甾醇的纯度高达99％,收率高达27％；三萜醇的纯度高达99％,收率高达55％。

本发明采用米糠油精炼过程中的废弃物米糠粗甾醇作为原料，实现了废物资源化，避免了废弃米糠粗甾醇污染环境；该方法绿色环保、工艺简单；该方法在得到高纯度三萜醇的同时还得到了高纯度植物甾醇，甾醇和三萜醇可应用于医药、保健品、化妆品、饲料添加等各种行业；本发明还研究了硅胶柱重复使用三次后仍然有较好的分离效果，节约了硅胶成本。

以上所述仅为本发明示意性的具体实施形式，在不脱离本发明构思和原则的前提下，任何本领域的技术人员所作出的等同变化与修改，均应属于本发明的保护范围。