重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒弱毒株及其应用的制作方法

本发明涉及病毒重组领域，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒(tgev)弱毒株的重组及表达。

背景技术：

猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritis，tge)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)引起的猪的一种急性高度接触性传播的肠道疾病，其临床主要特征是呕吐、水样腹泻、脱水和哺乳仔猪的高死亡率。该病于1933年首次在美国的伊利诺斯州发生，随后在全美国流行。1946年，doyle等将该病的病原体确定为病毒，并作了详细报告。20世纪80-90年代，该病在全球范围内广泛流行，给各国的养猪业带来了巨大的经济损失。我国最早于1956年在广东省首次报道该病的发生，此后在其他省市均有报道，给我国养猪业造成了重大的经济损失。

tge的发生和流行具有明显的季节性，以冬春寒冷季节发生较为严重，发病高峰期为1～2月份。流行特点主要分为流行性、地方流行性和周期性地方流行性。猪群密集的猪舍发病率高，老疫区呈地方流行性或周期性流行，新疫区呈流行性。病毒可以通过猪只的直接接触进行传播，也可通过呼吸道传播、母猪乳汁传播。病猪和带毒猪是主要的传染源，鼻分泌物、呼出气体、乳汁、呕吐物和粪便是它们主要的排毒途径，通过污染空气、饲料、饮水和用具等将病毒传染给易感猪。

tgev是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科、α-冠状病毒属的重要成员，是一种单股正链rna病毒，其基因组不分节段，大小约为28kb，5'端含有帽子结构，3'端含有polya结构；含有9个开放阅读框(openreadingframe,orf)，即orfla、orf1b、orf2、orf3a、orf3b、orf4、orf5、orf6和orf7，其中orf2、orf4、orf5、orf6分别编码纤突(spike,s)蛋白、小膜(envelope,e)蛋白、膜蛋白(membrane,m)、核衣壳(nucleocapsid,n)蛋白四种结构蛋白，orfla、orf1b编码复制酶蛋白，orf3a、orf3b和orf7编码辅助蛋白p3a、p3b和p7。9个orf在基因组中的顺序为5'-orf(1a/1b)-s-3a-3b-sm-m-n-orf7-3'，每个相邻两个基因之间的间隔有1～15个碱基，每个间隔内均有转录起始信号序列5'aa(uu)cuaaac3'。tgev主要感染哺乳仔猪的小肠上皮细胞，使得小肠上皮细胞很快死亡脱落，由于哺乳仔猪小肠上皮细胞更新的较慢，从而导致仔猪发生腹泻，严重时表现为水样腹泻。另外，该病毒变异毒株-猪呼吸道冠状病毒也可以感染肺上皮细胞，主要引起猪肺部疾病。

病毒的分离和全基因组序列分析可为病毒的致病机理研究、病毒遗传进化和新疫苗的研发提供种毒来源和基础理论依据。tgev国外的代表毒株有英国的fs772/70毒株、美国的miller和purdue毒株、日本的to14毒株和韩国的hk12毒株，国内代表毒株有华毒株(h株)和th-98毒株。近年来，我国相继分离到sc-y、wh-1、xh和shxb等tgev流行毒株，这些毒株结构相似，与美国purdue代表毒株亲缘关系较近，而与miller毒株亲缘关系较远。h株由本实验室于20世纪70年代从上海某发病猪场腹泻猪的小肠内容物中分离、鉴定，随后在猪体内连续传代16次，命名为h16株；在此基础上，将其在pk15传代细胞系连续传代165次，期间经过5次噬斑克隆纯化、驯化致弱，从而获得目前在我国大陆广泛使用的中国经典弱毒疫苗株，该疫苗株背景清楚，抗原性好，能刺激机体产生高水平的保护抗体，给哺乳仔猪提供有效保护。ahhf株(简称ah株)是本实验室于2015年从安徽省合肥市某猪场收集小肠内容物在猪体内连续传代3次，然后在pk15细胞上盲传3代分离得到，并经过3次噬斑克隆后得到纯化的病毒。动物试验结果表明该毒株能引起哺乳仔猪发生严重的腹泻、呕吐等症状，与经典毒株h株的强毒株h16感染猪的临床表现相类似。

反向遗传技术为研究病毒的复制特性、致病机制等分子机理提供了重要的科学手段，并为研制新型疫苗(嵌合疫苗、标记疫苗等)提供了可能。自1981年第一例rna病毒感染性克隆成功构建并拯救出小儿麻痹症病毒以来，反向遗传技术和重组病毒设计被应用于几乎所有病毒种群的研究，同时也显示了它的巨大科学价值。目前，用于构建冠状病毒全长cdna克隆的方法有3种，分别是细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,bac)载体系统、体外cdna片段连接系统和痘病毒载体系统。

bac载体是在大肠杆菌f’因子的基础上构建的。f’因子是一个与大肠杆菌染色体转移和接合性能有关的不相容组，它能够作为染色体外元件独立存在。最初的bac载体pbac108l，是在小f质粒pmbo131基础上构建的。pbac108l由单向自我复制基因(oris，repe)、维持大肠杆菌基因组1-2个拷贝数的基因(para，parb)、t7和sp6通用启动子、氯霉素抗性基因和多克隆位点组成。该载体能够插入的外源dna片段的大小为300kb。pbelobac11是在pbac108l的多克隆位点区插入完整的lacz基因，这样就可以在含有x-gal/iptg的平板上通过蓝白斑来筛选阳性克隆。由于para和parb的存在，pbelobac11仍然是一个低拷贝质粒。

不同病毒株之间的序列存在特异性，在前期研究的基础上，本研究以tgev中国经典弱毒株h165为研究对象，以bac载体pbelobac11为基本骨架，构建tgevh165株感染性克隆，在感染性克隆的基础上，构建表达外源基因的重组质粒，以拯救重组tgev-h165病毒。

技术实现要素：

本发明提供一种表达和生产tgev-h165病毒的方法，该方法以pbelobac11为载体，利用线性表达构建体重构tgev-h165病毒粒子。

由于不同毒株之间序列结构的差异性，在构建病毒的全长感染性克隆时如何对病毒基因组分段扩增是决定重组病毒是否能够被拯救且稳定传代的关键。

本发明进一步提供了针对tgev-h165毒株的病毒基因组进行克隆位点筛选的方法，通过该方法确定了在不改变病毒编码蛋白氨基酸序列的情况下，引入点突变获得了需要的限制性酶切位点。

根据确定的酶切位点，tgev-h165病毒基因组全长序列分为6个片段，每个片段长度控制在4-8kb左右，分别插入pbelobac11质粒中，快速有效的获得了拯救的tgev-h165的病毒粒子。

本发明进一步提供一种tgev拯救病毒的方法，该方法通过分析tgev-h165病毒基因组和pbelobac11载体序列，确定tgev-h165病毒基因组的克隆位点，并进一步分段扩增，插入pbelobac11质粒载体中，获得重组病毒的全长序列，经转染培养获得稳定传代的拯救病毒。

通过该方法获得的tgev-h165拯救病毒能够连续传代，具有非常好的稳定性。为tgev生物学特性、疫苗设计和抗病毒药物研究提供有力的工具。

本发明中重组猪传染性胃肠炎病毒强毒株[rtgev(a)-h165]，其微生物保藏号：cgmccno.17495；保藏时间：2019年4月17日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

表达绿色荧光蛋白重组猪传染性胃肠炎病毒强毒株[rtgev(h165)-gfp]，其微生物保藏号：cgmccno.17497；保藏时间：2019年4月17日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1pbac-tgev(h165)-fl构建策略.

图2pbac-tgev(h165)-fl、pbac-tgev(h165)-gfp-fl全长质粒质量分析。

图3全长质粒稳定性分析：m：trans2kplusimarker；p3-20：克隆菌的代次；

nc：阴性对照。

图4pbac-tgev(h165)-△3-trsn-gfp示意图。

图5拯救毒株rtgev(v)-h165的rt-pcr鉴定：rtgev(v)-h165：h165株的拯救病毒；

nc：阴性对照；pc：阳性对照。

图6tgev拯救毒株rtgev(a)-h165在pk15细胞上的病变：

a：pk15细胞感染tgev拯救毒株rtgev(a)-h165后36h(100×)；

b：pk15细胞感染tgev拯救毒株rtgev(a)-h165后36h(200×)；

c：正常pk15细胞(100×)；d：正常pk15细胞(200×)。

图7tgev拯救毒株rtgev(a)-h165间接免疫荧光(ifa)鉴定：

a：感染拯救毒株rtgev(a)-h165后24h的pk15细胞的ifa实验(200×)；b：感染拯救毒株rtgev(a)-h165后24h的pk15细胞dapi染色(200×)；c：感染拯救毒株rtgev(a)-h165后24h的pk15细胞ifa实验和dapi染色重叠图(200×)；d：未感染病毒的正常pk15细胞的ifa实验对照(200×)；e：未感染病毒的正常pk15细胞的ifa实验dapi染色(200×)；f：未感染病毒的正常pk15细胞的ifa实验和dapi染色重叠图(200×)。

图8拯救毒株rtgev(a)-h165的分子标签检测：

亲本毒株h165的18997位是t，拯救毒株rtgev(a)-h165的18997位是c。

图9tgev拯救病毒株rtgev(a)-h165的电镜图(负染染色)

a：rtgev(a)-h165的病毒粒子照片；b：对a图中方框区域放大四倍。

图10拯救毒株rtgev(a)-h165不同代次的病毒滴度测定。

图11拯救毒株rtgev(a)-h165和亲本毒株h165生长动力学曲线(moi＝5)

rtgev(a)-h165：tgevh165株的拯救病毒；rtgev(v)-ah：tgevah株的拯救病毒。

图12带gfp标签的tgev重组报告病毒的拯救：rtgev(h165)-gfp：h165株的报告病毒；

mock：未感染报告病毒的st细胞；p2：拯救病毒传至p2代；p3：拯救病毒传至p3代；p20：拯救病毒传至p5-20代，荧光细胞数大体相同。

图13tgev报告病毒的稳定性的westernblotting鉴定：

rtgev(h165)-gfp：h165株的报告病毒；p5、p10、p15、p20：感染报告病毒相应代次18h后收取的细胞；n：用抗tgev的n蛋白的特异性抗体检测；gfp：用抗gfp蛋白特异性抗体检测。

具体实施方式：

本发明所述tgev-h165病毒基因组全长序列是指在tgev-h165基因组5’端上游引入人的巨细胞病毒(cytomegalovirus,cmv)的早期启动子序列，在3’端下游引入丁型肝炎病毒(hepatitisdeltavirus,hdv)核酶序列、牛生长激素(bovinegrowthhormone,bgh)等元件后的全长序列。

本发明所述的tgev-h165毒株的病毒基因组克隆位点筛选方法是建立在限制性酶切位点的确定之上，本发明限制性酶切位点的选择遵循如下原则：即选择符合下述4个条件的限制性内切酶：(1)在pbelobacll载体和病毒基因组上均不存在的酶切位点，简称absentsites；(2)pbelobacll载体序列上不存在，但病毒基因组上唯一存在的酶切位点，简称siglesites；(3)pbelobacll载体序列上不存在，在病毒基因组上存在2个的酶切位点，简称doublesites；(4)pbelobacll载体序列上不存在，在病毒基因组上存在3个的酶切位点，简称threesites。

根据tgev-h165病毒株基因组的序列结构特点，按照上述限制性酶切位点的选择原则，确定如下酶切位点：kasi、sacii、xhoi、nhei、bstbi和noti6个酶切位点。

在上述6个酶切位点的位置，将tgev-h165病毒基因组全长序列分为h165-5’、h165-a、h165-b、h165-c1、h165-c2、h165-3’共6个片段,分别插入bac载体，构建的多克隆质粒的序列与参考序列一致则表明构建成功。

具体来说，本发明提供的表达和生产tgev-ah病毒的方法，所述方法的步骤包括：

1、pbelobacll载体和tgev-h165病毒基因组限制性内切酶的分析及切割位点的选择。

2、pbac-tgev(h165)-fl全长质粒构建的设计。

3、pbac-tgev(h165)5’-3’中间质粒的构建。

4、pbac-tgev(h165)-fl的构建

5、全长质粒的质量及稳定性分析

6、病毒拯救及鉴定。

进一步优选，在全长质粒中含有报告基因gfp。

实施例：

用于本发明实施例的材料和方法：

病毒、细胞

tgevh株弱毒疫苗株(h165)由本实验室分离、鉴定、传代致弱和保存；pk15、st细胞购自atcc，稳定表达tgev受体猪氨基肽酶n(papn)的bhk-papn细胞由西班牙国家生物技术中心luisenjuanes教授惠赠。

质粒、感受态细胞

pgem-teasy载体购自promega公司；pbelobac11质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王云峰研究员惠赠；pbac-tgev-5’-3’中间质粒、dh10b电转感受态细胞种由西班牙国家生物技术中心luisenjuanes教授惠赠；dh10b化学感受态细胞、stbl3化学感受态细胞购自北京博迈德生物；dh5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司。

主要试剂

dmem培养基、胎牛血清购自gibico公司；gelextractionkit、qiagenplasmidminikit购自qiagen公司；axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒购自axygen公司；dnamarker(dl2,000、dl5,000、dl8,000)购自北京全式金生物技术有限公司；primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(dyeplus)购自takara公司。dmem培养基购自gibico公司；胎牛血清购自sigma公司；细胞培养板、细胞培养瓶购自corning公司；apai、apali、noti、bamhi、bstbi、clai、nhei、xhoi、kasi、saci、sacii、spei、sphi等限制性内切酶、t4dnaligase、alkalinephosphatase,calfintestinal(cip)、q5hotstarthigh-fidelity2×mastermix购自neb公司；gelextractionkit、qiagenplasmidminikit、endofreeplasmidmaxkit、attractenetransfectionreagent购自qiagen公司；病毒rna提取trizol试剂、lipofectamine^tm2000reagent购自invitrogen公司；rapiddnaligationkit购自thermo公司；primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(dyeplus)、emeraldamp^tmpcrmastermix、speedstar^tmhsdnapolymerase购自宝生物工程(大连)有限公司。

实施例1：pbelobacll载体和h165病毒基因组限制性内切酶位点的确定

利用lasergene(dnastar)软件包中的seqbuilder软件对tgev流行毒株ah-p5代全基因组序列和pbelobacll载体序列进行分析，选择符合下述4个条件的限制性内切酶：(1)在pbelobacll载体和病毒基因组上均不存在的酶切位点，简称absentsites；(2)pbelobacll载体序列上不存在，但病毒基因组上唯一存在的酶切位点，简称siglesites；(3)pbelobacll载体序列上不存在，在病毒基因组上存在2个的酶切位点，简称doublesites；(4)pbelobacll载体序列上不存在，在病毒基因组上存在3个的酶切位点，简称threesites。

如图1，根据tgevh165株全长基因组和pbelobac11的酶切位点分析，将tgevh165株全长基因组分为了h165-5’、h165-a、h165-b、h165-c1、h165-c2、h165-3’共6个片段。设计时在基因组的3012位利用无义突变引入了mlui位点。

实施例2：pbac-tgev(h165)-fl全长质粒的构建策略

在pbelobacll载体和h165病毒基因组限制性内切酶位点确定的基础上，将h165病毒基因组全长序列切割分为6个片段，每个片段长度控制在4-8kb左右，并且两端的酶切位点要在整个即将构建好的全长质粒pbac-tgev(h165)-fl中是唯一的。在tgev基因组5’端上游引入人的巨细胞病毒(cytomegalovirus,cmv)的早期启动子序列，在3’端下游引入丁型肝炎病毒(hepatitisdeltavirus,hdv)核酶序列、牛生长激素(bovinegrowthhormone,bgh)等元件。见图1

实施例3：pbac-tgev(h165)5’-3’中间质粒的构建

首先以pbac-tgev-5’-3’中间质粒为模板，以bac-u:gcaatcaaggcgccgagtgtccgcggatcgaatataacttcgtataatgtatg(seqidno.1)(下划线为顺次引入的kasi和sacii位点)和bac-l:cgaatcaactcgagttaccatgctagcttcacggttcgaaccttgcggccgcccgggccgtcgaccaattctc(seqidno.2)(下划线为顺次引入的xhoi、nhei、bstbi和noti位点)为配对引物扩增bac载体片段。然后以(ah)d-f21485：ataatgatacagtgagtgactcgag(seqidno.3)(xhoi)和(h165)d-r23476：aaggtatagccacggcgcctccac(seqidno.4)(kasi)为配对引物，以ah株p5代cdna为模板扩增原始的d片段。使用omega公司生产的gelextractionkit对载体和d片段产物进行胶回收，然后进行酶切、连接和转化反应。利用菌液pcr筛选重组阳性克隆，对阳性重组质粒进行测序分析。

实施例4：pbac-tgev(h165)-fl的构建

将tgevh165株全长基因组分为了h165-5’、h165-a、h165-b、h165-c1、h165-c2、h165-3’共6个片段，在基因组的3012位引入了mlui位点，首先构建了中间质粒pbac-tgev(h165)5’-3’，然后将上述片段顺次插入到该中间质粒中，得到pbac-tgev(h165)-△clai。含有毒性的△clai(4418-9616)片段首先克隆到pbac载体中，最后将其插入到pbac-tgev(h165)-△clai，得到全长质粒pbac-tgev(h165)-fl。因为前边用到clai位点，故按照无义突变设计，需完成18997t-c突变。同时，也作为拯救毒株的分子标签。

实施例5：全长质粒的质量及稳定性分析

按照bac质粒大量制备的方法制备质粒，进行电泳分析。另根据实验时发现在基因组4243-4244之间容易插入大肠杆菌k12染色体0.777kb序列的特性，设计了一对引物bstbi-1:tgttaaacttgaattcgaatttgacaatgaaattgtaactgg(seqidno.5)和clai-2:ccagtgaaaacatcgatggctcttgcgacaccacccatgtgt(seqidno.6)对全长质粒在宿主菌dh10b传代过程中的稳定性进行分析。另对p5代、p10代、p20代宿主菌大量制备质粒进行测序分析，以研究其稳定性。

将大量制备好的质粒用nanodrop2000c测定其浓度和纯度，选取od260/od280在1.8到2.0之间的质粒进行电泳分析。如图2，电泳分析表明，制备的质粒条带单一，浓度很高，没有降解，可以用于转染。

实验过程中发现在基因组4242-4243位容易插入0.777kb的大肠杆菌k12染色体的序列，这种插入的概率很高，有时高达90％。说明该处质粒稳定性较差，需要进行时时监控。插入序列如下：

>pbac-a/pok-a(斜体下划线区域为插入的k12染色体序列)

对p1-p20代全长质粒利用bstbi-1和clai-2为配对引物进行分析，表明全长质粒是稳定的，没有插入k12染色体序列。若插入了k12染色体序列，片段大小应该为2.1kb。对p5代、p10代、p20代进行测序表明，该全长质粒确实是稳定的，足够后续转染救毒试验使用。见图3

实施例6：含报告基因gfp的全长质粒的构建

h165株含报告基因gfp的全长质粒的构建是在pok3’的基础上进行的，如图1，只需将3-2片段中相应orf3基因敲除掉，然后替换为带gfp的片段，同时带上trsn，序列引物设计如下：

3-2-f：tcagcctagagttgcaactagttct(seqidno.7)

3-2-1-r：taacgcgtaaagactttattcatcatccttaac(seqidno.8)610bp

3-2-2-f：aataaagtctttacgcgttataactaaacttctaaatgg(seqidno.9)

3-2-2-r：aaccgcctgagaaaaggctgcattgttaattaa(seqidno.10)787bp

3-2-3-f：cagccttttctcaggcggttctaaacg(seqidno.11)

3-2-r：e1-r：tccacatgcgcatgcaatcacacacgctaa(seqidno.12)360bp

其中，3-2-2-f和3-2-2-r为扩增gfp基因序列的引物。先单独将上述三段扩增出来，然后通过融合pcr的方法得到3-2e片段，然后通过spei和sphi将其替换到pok3’中，得到pok3’e。将pbac-tgev(h165)-fl和pok3’e两个质粒分别用xhoi和sacii进行双酶切，然后将pok3’e段切下来的片段插入到pbac-tgev(h165)-fl中，获得pbac-tgev(h165)-δ3-trsn-gfp。

如下序列，其中前边阴影序列表示s基因的结尾部分序列；加框序列为trsn序列；下划线序列atggtg------aagtaa表示引入的gfp基因序列，共740bp，编码239aa；后边阴影序列为e基因开始部分序列。

h165株含gfp基因的全长质粒命名为pbac-tgev(h165)-△3-trsn-gfp，示意图见4。

实施例7：病毒拯救及鉴定

转染试剂选择使用阳离子脂质体lipofectamine2000；细胞选用表达tgev受体氨基肽酶n的bhk-papn细胞和tgev易感的pk15细胞。转染试验按下述在直径为35mm的小皿进行：

1)转染前一天，铺4×105bhk-papn细胞于35mm小皿，加2ml细胞生长液(含10％fbs)，不加抗生素，待到细胞密度达到90-95％时进行转染试验。

2)转染前，将opti-memi无血清培养基置于室温，将全长质粒和lipofectamine2000置于冰上；对于每个转染样品，都按下述准备转染混合液：

a)将5μg全长质粒混于250μlopti-memi无血清培养基中，注意轻轻混匀，不要过长时间涡旋或吹打，防止质粒断裂。

b)使用之前将转染试剂lipofectamine2000混匀，取12μl加入到250μlopti-memi无血清培养基中，涡旋，将稀释好的转染试剂室温孵育5min。

c)将稀释好的全长质粒和稀释好的lipofectamine2000混在一起，室温孵育20min，以使脂质体充分包裹质粒dna。

3)在孵育期间，将长成单层的bhk-papn细胞用不含血清和抗生素的细胞生长液洗一次，然后每个小皿加1ml细胞生长液。

4)将500μl质粒dna-lipofectamine2000混合液加入到洗过的bhk-papn细胞中，上下轻微颠倒混匀，37℃培养6h。

5)弃掉转染混合液，加2ml细胞生长液(含10％fbs)，37℃继续培养3天。

6)吸取上清液1ml感染铺于25cm2细胞瓶的长成单层的pk15细胞，37℃培养直到细胞病变效应产生。

7)将拯救病毒株在pk15细胞上连续传代6次。

待拯救病毒株rtgev(a)-h165传至p4代时，取上清液提取rna进行rt-pcr试验以验证是否拯救出病毒。rna提取方法按照axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒说明书参考前述进行，rt-pcr按照primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(dyeplus)说明书进行，选择针对n基因的特异性引物进行。上游引物tnu：gcattacccagcaggac，下游引物tnl：aataaatacagcatggaggaggac，扩增目的片段大小为1360bp。如图5，经针对tgevn基因的特异性引物进行rt-pcr鉴定，以rtgev(a)-h165p4代rna为模板成功扩增出了大小约1360bp的片段，说明成功拯救出了中国经典疫苗毒株h165。

实施例8：拯救病毒株的细胞病变效应(cpe)和间接免疫荧光(ifa)试验

待拯救病毒株传至p4代时，观察pk15细胞接种拯救病毒后不同时间的细胞病变情况。并用基于tgevn蛋白特异性的单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验(ifa)鉴定拯救病毒株。ifa试验在6孔板进行，待pk15细胞长成单层后，感染约200tcid50的拯救病毒，感作1h后，换成含2％fbs的细胞维持液，继续培养24h，然后进行ifa试验。用倒置荧光显微镜进行观察。

如图6中国经典疫苗毒株h165的拯救毒株rtgev(a)-h165p1代就开始出现稳定典型的细胞病变效应，pk15细胞在感染rtgev(a)-h165后24h即可看见明显的cpe，感染后36h病变更加典型，细胞出现聚合现象，有些细胞膨大、死亡、脱落，到感染后48h病变脱落细胞达到70-80％，适宜收毒。

如图7，用抗tgevn蛋白的特异性鼠源单克隆抗体5g8做间接免疫荧光试验，显示拯救毒株rtgev(a)-h165呈阳性。

实施例9：拯救病毒株分子标签检测

在构建h165株全长质粒pbac-tgev(h165)-fl时，只进行了18997t-c无义突变，突变掉clai18994这个酶切位点，同时作为拯救毒株rh165的分子标签。根据该设计，设计了2对检测分子标签的引物，对拯救病毒株进行鉴定。引物如下：

marker(b16929)-1：cagatttaatgttgccattacg(seqidno.13)

marker(b16929)-2：aagccatcaaaatagtcacag(seqidno.14)

marker(clai18994)-1：tcctacactgatcttgatag(seqidno.15)

marker(clai18994)-2：gacacaacattaagatctaagc(seqidno.16)

待拯救毒株传至p4代，取上清液提取rna用上述2对引物进行rt-pcr试验以验证是否是拯救出的病毒。rna提取方法按照axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒说明书参考前述进行，rt-pcr按照primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(dyeplus)说明书进行，得到目的片段后，将其回收送测序，比对分子标记位置。

如图8所示，拯救毒株rtgev(a)-h165确实完成了18997t-c的突变，说明确实是拯救的重组病毒。

实施例10：拯救病毒株的电镜检测

待拯救毒株传至p4代，待细胞病变达到约80％时，取上清液进行差速离心处理，即3000rpm离心10min，以去除细胞碎片；12000rpm离心30min，弃上清，以浓缩病毒。将处理后的样品进行负染染色，以观察病毒粒子形态。

如图9，经电镜检测，发现rtgev(a)-h165进行了成功组装，病毒粒子呈现冠状病毒典型的特征：病毒粒子呈现圆形或椭圆形，粒子大小较均一，约100nm，纤突大而稀疏，围绕在病毒粒子周围。

实施例11：拯救毒株不同代次病毒滴度测定

病毒拯救时，首先转染bhk-papn细胞，48h收取上清液，此时记为p0代；然后，将拯救病毒在pk15细胞上连续传代6次，依次记为p1代、p2代、p3代、p4代、p5代、p6代。分别对p1-p6代上清液进行tcid50测定，以了解病毒滴度增殖情况。

如图10，拯救出来的病毒最初2代病毒滴度较低，p3、p4代处于上升阶段，p5、p6代基本达到最高水平，与亲本毒株的病毒滴度接近。其中，中国经典疫苗毒株h165的拯救毒株rtgev(a)-h165p1代病毒滴度即可达到10⁴tcid50/ml，说明病毒对细胞的适应性非常好。

实施例12：病毒一步生长曲线的测定

对拯救毒株和亲本毒株都进行一步生长曲线测定试验，以了解它们的生长特性。首先进行毒株tcid50的测定试验，如下进行：pk15细胞铺于96孔板，待长成单层时进行tcid50的测定试验，约需要24h。将病毒进行10倍连续梯度稀释，然后每孔加入100μl不同稀释度的病毒，重复8次，感作1h后，换上维持液(dmem+2％fbs)。将其放置37℃co2培养箱培养，观察病变情况，按照reed-muench法计算其tcid50。

然后，按照moi＝5的感染比进行一步生长曲线测定试验。首先，按照moi＝5将病毒接种铺于75cm2细胞瓶的长成单层的pk15细胞，感作1h后用pbs洗3次，换上维持液，分别于感染后6h、12h、24h、36h、48h、60h取上清液300μl；然后，对上述不同时间点所取的样品分别进行tcid50测定，该试验重复3次，以绘制一步生长曲线。

如图11，拯救毒株rtgev(a)-h165与其亲本毒株h165表现出类似的生长动力学曲线，感染病毒后24h处于对数期，36-48h达到高峰，60h时略有下降。

实施例13：拯救毒株的全基因组测序

按照tgev全基因组测序的成熟方法进行，分析比对拯救毒株的全基因组序列与亲本毒株的差异。拯救毒株传至p6代，提取rna，进行了全基因组测序。结果表明，拯救的病毒株与亲本毒株序列相比除分子标记处均为一致的，与预期一致，分子标记处与最初设计是一致的，并未发生突变。

实施例14：病毒拯救重复性试验

用不同批次制备的全长质粒多次进行转染救毒试验。以评价该体系的稳定性和重复性。

通过对三个批次制备的全长质粒pbac-tgev(h165)-fl进行转染试验，只要控制质粒纯度(od260/od280)在1.8到2.0之间，质粒浓度为100-200ng/μl(表1)之间均是可以拯救出病毒的，并且重复性非常好，可以达到100％，具有良好的稳定性。

表1pbac-tgev(h165)-fl转染救毒试验的重复性

实施例15：带gfp基因的报告病毒的拯救

用构建好的质粒pbac-tgev(h165)-△3-trsn-gfp按照上述转染救毒系统救毒，观察细胞病变情况及绿色荧光产生情况，以确定是否拯救出毒。

如图12，弱毒疫苗株h165的报告病毒rtgev(h165)-gfp也拯救了出来，但p1-p2代只见细胞病变产生并不见绿色荧光产生，至p3代时，在感染后约50h可见8％左右细胞呈绿色荧光，传至p4-5代时，仅感染后16h即可见80％左右细胞呈绿色荧光。该病毒同样可以稳定存在20代以上。

如图13，经westernblotting验证，感染报告病毒rtgev(h165)-gfp的st细胞20代内可见清晰的tgevn蛋白和gfp蛋白的条带，表明报告病毒具有非常好的稳定性。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120>重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒弱毒株及其应用

<160>18

<170>patentinversion2.1

<210>1

<211>53

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>gcaatcaaggcgccgagtgtccgcggatcgaatataacttcgtataatgtatg

<210>2

<211>73

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>cgaatcaactcgagttaccatgctagcttcacggttcgaaccttgcggccgcccgggccgtcgaccaattctc

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>ataatgatacagtgagtgactcgag

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>aaggtatagccacggcgcctccac

<210>5

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>tgttaaacttgaattcgaatttgacaatgaaattgtaactgg

<210>6

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>ccagtgaaaacatcgatggctcttgcgacaccacccatgtgt

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>tcagcctagagttgcaactagttct

<210>8

<211>33

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>taacgcgtaaagactttattcatcatccttaac

<210>9

<211>39

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>aataaagtctttacgcgttataactaaacttctaaatgg

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>aaccgcctgagaaaaggctgcattgttaattaa

<210>11

<211>27

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>cagccttttctcaggcggttctaaacg

<210>12

<211>30

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>tccacatgcgcatgcaatcacacacgctaa

<210>13

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>cagatttaatgttgccattacg

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>aagccatcaaaatagtcacag

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>tcctacactgatcttgatag

<210>16

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>gacacaacattaagatctaagc

<210>17

<211>1009

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>gtagtagaagacaatttgaaaattacgaaccaattgaaaaagtgcacgtccattaaatttaaaatgttaattctatcatctgctataatagcagttgtttctgctagagaattttgttaaggatgatgaataaagtctttacgcgttataactaaacttctaaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaattaattaacaatgcagccttttctcaggcggttctaaacgaaattgacttaaaagaagaagaagaagaccatacctatgacgtttcctagggcattgactgtcatagatgacaatggaatggtcat

<210>18

<211>2830

<212>dna

<213>artificial

<220>

<400>gcaaggggataataattgttggataaatgcttgttgctaccagcttcaggcctttgattttttcaacaatgaagcttgggagaaatttaagaaaggtgatgtcatggactttgtaaacctttgttatgcagcaacaacactagcaagaggtcattctggtgatgcagagtatcttcttgaacttatgctcaatgattatagcacagccaagatagtacttgcagctaagtgtggttgtggtgaaaaagaaattgttttggaaagagctgtttttaaactcactccacttaaggagagttttaattatggtgtttgtggcgactgcatgcaagttaacacctgtagatttttaagtgttgaaggctctggtgtttttgttcatgacatattaagcaagcaaacgccagaagctatgtttgttgtcaaacccgttatgcatgcagtttacactggcacaactcaaaatggccattacatggttgatgatattgaacacggttattgtgtagatggtatgggtattaaaccacttaagaaacggtgttatacatccacattgtttattaatgccaatgtaatgactagagctgaaaaaccaaaacaagagtttaaagttgaaaaagtagaacagcaactgatagtggaggaaaacaaatcctcggtaatgactccaacttattgatagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgagaacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgctcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattcatacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcataagacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccggagactgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccactgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttaccgactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgcgggctgttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtaccgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcagagatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaacaggagggacagctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagttggcagcatcacccaaatcctctattgaaaaagaggaaattcaaagtcctaaaaacgatgatcttatacttccattttacaaagctggtaaactttccttttatcagggtgctttggatgttttgatcaatttcttggaacctgatgttattgttaatgctgctaatggtgatcttaaacacatgggtggtgtcgcaagagccatcgacgttttcactggtggcaaattaacagaacgttctaaggattatcttaaaaagaacaaatctattgctcctggtaatgctgttttctttgaaaatgtcattgagcatcttagtgttttgaatgcagttggaccacgtaatggtgacagccgagttgaagccaaactttgtaatgtttacaaagcaattgcaaagtgtgaaggaaaaatattaacaccacttattagtgttggtatctttaatgttagacttgaaacatcattgcagtgcttacttaagactgtgaatgacaggggactgaatgtcttcgtatacactgaccaggaaaggcaaactattgagaatttcttctcttgttctatccctgtcaatgttactgaggataatgttaaccatgaacgtgtgtctgtttcttttgacaaaacatacggtgaacagcttaaaggcaccgttgtcatcaaagacaaagatgttacaaaccagttgcctagcgcctttgatgttggtcaaaaagttgttaaggctattggtatagattggcaagctcattatggtttccgtgatgctgctgcttttagcgctagtagtcatgatgcttataaatttgaagttgttacacatagcaatttcattgtgcataagcagactgacaacaactgttggattaatgcaatttgtcttgcattacagagactcaagccacagtggaaatttcctggtgttagaggtctctggaatgaatttcttgagcgtaaaacacaaggttttgtacatatgttgtatcacatttctggagtaaagaaaggtgagccaggtgatgctgaattaatgctgcataaacttggtgacttgatggacaatgattgtgaaatcattgtcacacacactacagcatgtgacaagtgcgcaaaagtagaaaagtttgttggaccagtggtagcagcacctctcgcaattcatggcactgacgaaacatgtgtgcatggcgttagtgtcaatgtcaaagttacccaaattaggggcactgttgctattacttctttgattggtcctattattggagaagtactagaagcaactggttatatttgttatagcggttctaataggaatggtcattacacctattacgataaccgtaatggattagtggttgatgcagaaaaggcttaccattttaatagagacttattacaggtcacaacagct