用于检测动植物DNA病毒的环介导等温扩增微流控芯片及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测动植物dna病毒的环介导等温扩增微流控芯片及其应用。

背景技术：

动植物病毒是一类具有侵染活性的细胞内寄生病原物。每年给全球的农牧业经济发展带来数百亿美元的损失，给农牧业健康快速和可持续发展带来严重阻碍。在目前的生产上，对动植物相关材料所患的病毒病的快速准确检测与诊断具有非常重大的意义。然而，目前用于动植物病毒检测的常用方法主要有生物学方法、免疫学方法、电镜方法和分子生物学方法等。其中，生物学方法较方便，但耗时长，准确率有限，需要专业技术人员；在免疫学方法中，elisa是使用最广泛的方法，它反应灵敏、特异性强，但检测过程复杂，且检测灵敏度低，不适合病毒病的早期诊断；电镜技术需要依赖大型精密仪器，不宜大范围推广；核酸杂交方法的特异性强、灵敏度高、适用范围广，但需要设计探针，检测过程复杂，耗时长，不适于大量样品的筛查工作；聚合酶链式反应是检测病毒病最为有效的分子生物学方法之一，可对来自任何植物病毒基因组的少量dna或cdna进行大量扩增，可检测到pg甚至fg级的病毒含量，不仅适用于大量样品的检测，还可用粗提液直接进行检测。通常，pcr产物需要进行琼脂糖凝胶电泳才能看到结果，该方法操作简单，可同时对大量样品的pcr产物进行同时电泳，且对产物还可再回收利用，但是该方法消耗pcr产物较多，不能与其他分析过程进行集成，且使用的染料大多具有毒性，对实验人员安全也带来一定危害。最重要的是，传统的pcr和琼脂糖凝胶电泳不能集成，中间还需要人工对产物进行转移等一系列操作。

技术实现要素：

本发明要解决目前对动植物dna病毒检测步骤繁琐且毒性试剂较多的技术问题，提供一种环介导等温扩增微流控芯片，利用该芯片检测dna病毒，能省去常规dna病毒检测的诸多步骤(包括dna提取、聚合酶链式反应、产物电泳、结果显示等)，使加样、扩增、结果表征均置于一微流控芯片上进行，具有微型化、集成化、检测速度快的优点。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明的检测原理是基于环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)，该方法是一种新型的核酸扩增方法，利用针对靶基因的6个区域设计的4种特异引物和链置换dna聚合酶，使反应物在60-65℃的恒温条件下扩增，15-60分钟内可扩增出10⁹～10¹⁰倍靶序列拷贝。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低等特点。在反应体系中加入可见光核酸染料ultrapowertm用于扩增结果的显示，不需要经过模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等步骤，不依赖任何专门的仪器设备，肉眼观察反应液显色长度即可知道样本的阳性有无及相对程度。加样、扩增、结果表征均置于一微流控芯片装置上进行，具有微型化、集成化、检测速度快等优点。

本发明提供了一种环介导等温扩增微流控芯片，所述微流控芯片包括：上下双层聚二甲基硅氧烷pdms板，该pdms板上下双层粘合使其重叠外边形成密封状态；上层pdms板设有三个贯穿孔，依次为加样孔、阻隔孔和通气孔，加样孔和通气孔的孔口以密封物密封，阻隔孔中以阻挡物阻隔；下层pdms板刻有与上层pdms板三个贯穿孔相对应的用于反应液流经的渠道、用于等温扩增的反应腔和用于结果显示的通道，所述反应腔一侧与反应液渠道相连，另一侧与结果显示通道相连，所述阻隔孔位于反应腔与结果显示通道的相连接处。

优选地，三个贯穿孔的排列次序依次为加样孔、阻隔孔和通气孔，优选从左至右依次排列。

优选地，三个贯穿孔直径与200微升移液枪头中部直径相匹配；更优选地，三个贯穿孔直径为0.3毫米。

所述密封物可选用胶带、透明胶等。所述阻挡物优选蜡块。

优选地，用于反应液流经的渠道采取软蚀刻技术刻画在下层pdms板表面，连接加样孔与反应腔；更优选地，所述渠道为一条长1～2厘米，宽和高均为0.5～1.5微米由加样孔下方位置(即反应液渠道起点)通向反应腔的微流孔道。在本发明的一优选实施方式中，所述渠道为一条长2厘米，宽和高均为1微米由左向右从反应液渠道起点通向反应腔的长方体微流孔道。

优选地，所述反应腔为陷入下层pdms板内部的凹槽，反应腔底部装有半导体加热组件；更优先地，所述反应腔为一长1～3厘米，宽和高均为30～70微米的长方体槽，该反应腔内装有粉末状lamp试剂。在本发明的一优选实施方式中，所述反应腔为一长1厘米，宽和高均为50微米的长方体槽。

优选地，所述用于结果显示的通道为一长3～5厘米，宽和高均为30～70微米的长方体槽。在本发明的一优选实施方式中，所述结果显示通道为一长3.5厘米，宽和高均为50微米的长方体槽。

优选地，所述上下层pdms板为等面积长方体，重叠的四边以环氧树脂粘合形成密封状态。

本发明还提供了上述环介导等温扩增微流控芯片在制备检测动植物dna病毒产品中的应用。

所述微流控芯片在制备检测动植物dna病毒产品中的应用，包括以下步骤：

s1、加样，将样本混合pbs缓冲液中形成反应液，用移液枪吸取反应液刺入加样孔，滴加到反应液渠道起点；

s2、扩增，待反应液流入反应腔与粉末状lamp试剂混合后，打开半导体加热组件电源恒温加热15-20分钟，使反应物扩增；

s3、结果检测，用枪头将阻隔孔中的阻挡物刺穿，并将通气孔的密封物撕开，使反应液流入结果显示通道，观察反应液显色长度，若无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，绿色液柱的长度越长表示样本的阳性程度越高。

本发明还提供了一种检测动植物dna病毒的产品，包含上述环介导等温扩增微流控芯片、以及针对动植物dna病毒的特异性基因设计的外引物f3、b3和内引物fip、bip。

本发明的有益效果：本发明的环介导等温扩增微流控芯片，用于检测动植物dna病毒，不需提取dna，不依赖其他的仪器设备，检测速度快，特异性强，操作简便，结果直接用肉眼观察。本发明的微流控芯片，不仅检测时间缩短，试剂消耗大大降低，灵敏度提高，更重要的是该微流控芯片可以将lamp过程与结果判定过程集成，避免样品转移带来的工作量与样品污染，保证实验人员的安全，进一步提高动植物dna病毒检测效率，推动动植物病害的预报预测工作。

附图说明

图1本发明的等温扩增原理示意图；

图2本发明的微流控芯片的结构示意图；

其中，在图2中：

1-上层pdms板，2-下层pdms板，3-加样孔，4-阻隔孔，5-通气孔，6-反应液渠道，7-反应腔，8-结果显示通道，9-阻挡物，10-半导体加热组件。

具体实施方式

本发明提供了用于检测dna病毒的环介导等温扩增微流控芯片，该芯片主要依据不同dna病毒的引物环介导等温扩增样本，在短时间内得到大量拷贝数的靶基因序列，从而检测样本的阴阳性。待测样品液在反应腔内与lamp试剂混合后，用半导体组件恒温加热反应腔底部，一段时间后，再刺破密封用的蜡块，撕开通气孔的密封胶布，使整个反应通道有气流流通，反应液流到显示通道，用肉眼观察液柱变色的长度即是样本的阳性程度，若不变色说明结果阴性。本发明检测不需提取dna，不依赖其他的仪器设备，检测速度快，特异性强，操作简便，检测结果直接用肉眼观察。

如图1所示，本发明的原理如下：

第一阶段循环扩增：双链dna处于解链和退火的动态平衡温度时，引物组中的bip引物互补结合到目标双链上，在链置换dna聚合酶作用下，启动dna合成，bip从b2区的3’端开始合成互补链至f3c。b3引物退火结合到模板dna的互补区域b3c，启动链取代的合成，同时释放由bip引物引导合成的互补链。释放的dna的b1c区域与b1区域结合，形成茎环结构；释放的互补链作为fip引物以及f3引物的模板，按bip端相同的模式启动dna的合成及链取代，释放的dna链在fip端同样形成茎环结构，进而形成哑铃形结构扩增始发物。第二阶段循环延伸：哑铃结构通过自引导dna合成，迅速转换成茎环结构dna。bip引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的dna合成，由于fl及f1c的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的dna链得以释放。fip引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于b1及b1c的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的dna链得以释放。如此周而复始地扩增，最终形成不同长度花椰菜状的反向重复序列。

如图2所示，本发明的环介导等温扩增微流控芯片，包括：上下双层聚二甲基硅氧烷pdms板，该pdms板上下双层粘合使其重叠外边形成密封状态；上层pdms板1设有三个贯穿孔，依次为加样孔3、阻隔孔4和通气孔5，加样孔3和通气孔5的孔口以密封物密封，阻隔孔4中以阻挡物9阻隔；下层pdms板2刻有与上层pdms板1三个贯穿孔相对应的用于反应液流经的渠道6、用于等温扩增的反应腔7和用于结果显示的通道8，所述反应腔7一侧与反应液渠道6相连，另一侧与结果显示通道8相连，所述阻隔孔4位于反应腔7与结果显示通道8的相连接处。

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。

实施例1

检测非洲猪瘟病毒

1)加样：抽取患有繁殖障碍母猪或具有呼吸障碍症状的仔猪和流产胎儿的临床样本,分离血清，取50微升样本血清，置于1.5毫升离心管中，加入200微升灭菌的超纯水，用玻璃棒捣碎混合均匀。用移液枪吸取50微升样本混合液，枪头刺入加样孔的密封胶带，将混合液注入反应渠道作为反应液。

2)扩增：待反应液流入反应腔与lamp试剂盒粉末混合均匀后，在反应腔下方用半导体加热组件恒温加热65℃，20分钟使反应物扩增。反应体系参照通用型lamp试剂盒使用方法，所述lamp试剂盒包含2×lampmix25微升、fip引物(终浓度2微摩尔每升)、bip引物(终浓度2微摩尔每升)、f3引物(终浓度0.5微摩尔每升)、b3引物(终浓度0.5微摩尔每升)、mgcl2(25毫摩尔每升)7.5微升、bstdna聚合酶(8单位每微升)3.75微升，ultrapowertm1微升。

上述lamp引物的序列具体如下：

外引物f3：5′-tgctgtctcaggatgacgatg-3′(seqidno.1)；

外引物b3：5′-aaagtcgcctttcctccaga-3′(seqidno.2)；

内引物fip：5′-aaaactgcggaagacgcttt-3′(seqidno.3)；

内引物bip：5′-ttattcgctccaacacccca-3′(seqidno.4)。

3)结果检测：待反应液受热膨胀，用枪头刺入阻隔孔的阻挡物，撕去通气孔上的密封胶带，使气流通过整个反应通道，反应液开始流入结果显示通道。观察反应液的颜色，若无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，绿色液柱的长度越长表示样本的阳性程度越高。

实施例2

检测甘蔗杆状病毒

1)加样：选取疑似感病甘蔗植株，取病部叶片(约1毫米×1毫米)，置于1.5毫升离心管中，加入200微升灭菌的超纯水，用玻璃棒捣碎混合均匀。用移液枪吸取50微升样本混合液，枪头刺入加样孔的密封胶带，将混合液注入反应渠道作为反应液。

2)扩增：待反应液流入反应腔与lamp试剂盒粉末混合均匀后，在反应腔下方用半导体加热组件恒温加热65℃，20分钟使反应物扩增。反应体系参照通用型lamp试剂盒使用方法，所述lamp试剂盒包含2×lampmix25微升、fip引物(终浓度2微摩尔每升)、bip引物(终浓度2微摩尔每升)、f3引物(终浓度0.5微摩尔每升)、b3引物(终浓度0.5微摩尔每升)、mgcl2(25毫摩尔每升)7.5微升、bstdna聚合酶(8单位每微升)3.75微升，ultrapowertm1微升。

上述lamp引物的序列具体如下：

外引物f3：5′-aaattcatagcagtctacattga-3′(seqidno.5)；

外引物b3：5′-ctgctaactgattatctccaat-3′(seqidno.6)；

内引物fip：5′-cttgcagatctgtaacatcttccataatatactggtattctcaaacagtg-3′(seqidno.7)；

内引物bip：5′-gaatgggttaatcttaagcccctagtacttccaaggaaatcaactc-3′(seqidno.8)。

3)结果检测：待反应液受热膨胀，用枪头刺入阻隔孔的阻挡物，撕去通气孔上的密封胶带，使气流通过整个反应通道，反应液开始流入结果显示通道。观察反应液的颜色，若无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，绿色液柱的长度越长表示样本的阳性程度越高。

实施例3

检测金黄色葡萄球菌

1)加样：选取鹅肝和肠，混合后充分研磨，加入10倍pbs稀释液,充分混匀后，用移液枪吸取50微升混合液，枪头刺入加样孔的密封胶带，将混合液注入反应渠道作为反应液。所有试剂与仪器使用之前灭菌，防止杂菌污染。

2)扩增：待反应液流入反应腔与lamp试剂盒粉末混合均匀后，在反应腔下方用半导体加热组件恒温加热62℃45分钟使反应物扩增。所述lamp试剂盒包含10×bstbuffer5微升、mgso4(25毫摩尔每升)8微升、dntp(10毫摩尔每升)8微升、betaine(5摩尔每升)8微升、内引物(20微摩尔每升)各3微升、外引物(10微摩尔每升)各1微升、bstdna聚合酶大片段(8单位每微升)2微升、ultrapowertm2微升。

上述lamp引物的序列具体如下：

外引物f3：5′-caatcacgctgaccaggact-3′(seqidno.9)；

外引物b3：5′-atgagcgaacatgctgtgga-3′(seqidno.10)；

内引物fip：5′-tcaatcacgctgaccaggac-3′(seqidno.11)；

内引物bip：5′-gcagtagaatgcactccggt-3′(seqidno.12)。

3)结果检测：待反应液受热膨胀，用枪头刺入阻隔孔的阻挡物，撕去通气孔上的密封胶带，使气流通过整个反应通道，反应液开始流入结果显示通道。观察反应液的颜色，若无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，绿色液柱的长度越长表示样本的阳性程度越高。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120>用于检测动植物dna病毒的环介导等温扩增微流控芯片及其应用

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>1

tgctgtctcaggatgacgatg21

<210>2

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<213>人工序列（artificial）

<400>2

aaagtcgcctttcctccaga20

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列（artificial）

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aaaactgcggaagacgcttt20

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>4

ttattcgctccaacacccca20

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列（artificial）

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aaattcatagcagtctacattga23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

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ctgctaactgattatctccaat22

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<211>50

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

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cttgcagatctgtaacatcttccataatatactggtattctcaaacagtg50

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<212>dna

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gaatgggttaatcttaagcccctagtacttccaaggaaatcaactc46

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<212>dna

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caatcacgctgaccaggact20

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<212>dna

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atgagcgaacatgctgtgga20

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<212>dna

<213>人工序列（artificial）

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tcaatcacgctgaccaggac20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>12

gcagtagaatgcactccggt20