一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒。
背景技术：
：hexb基因，长45kb，包含14个外显子。基因的5'侧翼区含有功能性hexb基因启动子，且该序列富含gc，具有多个gc盒和一个caat盒，存在几种启动子元件，包括sp1，ap2，caat和tata基序。而当hexb基因突变时，会导致酶的功能丧失并导致严重溶酶体贮积病，即是sandhoff病。hexb基因编码氨基己糖苷酶b，参与神经退行性疾病，枫糖尿病或桑德霍夫病，被证明为桑德霍夫病的疾病标志物而被广泛研究。氨基己糖苷酶通过末端β-葡糖苷键连接的n-乙酰葡糖胺和n-乙酰半乳糖胺的释放参与糖脂、糖蛋白和蛋白多糖的溶酶体降解。牙齿上存在多种组织。牙囊是附着牙齿外胚的间充质结缔组织，围绕在牙釉质和牙乳头周围，能够起到调节破骨细胞和成骨细胞的萌生的作用。2004年，德国生物学家morsczeck首次从牙囊组织中分离出具有高度增殖活性和分化潜能的前体细胞，并通过标志物鉴定了牙囊干细胞。研究发现牙囊干细胞来源于神经嵴，能够形成牙周韧带、牙本质和牙槽骨。通过诱导实验证明牙囊干细胞能够分化形成成骨细胞，脂肪细胞，心肌细胞，软骨细胞，神经元，肝细胞，唾液腺细胞核导管细胞。其中，牙囊干细胞形成骨和牙本质相关细胞和组织的能力得到广泛研究和认可，因此成为牙科组织再生工程中重要的材料。生物学特性研究还发现牙囊干细胞在免疫调节中起作用。相比于其他牙齿来源干细胞，牙囊干细胞的组织材料更加容易得到，因为在再生医学领域是潜在的临床治疗手段。但是因为口腔环境复杂，牙齿上存在多种组织，分离得到的成纤维状细胞不一定是牙囊干细胞，而要鉴定牙囊干细胞，需要从数个表面标志物同时鉴定，需要比较全面的抗体组合，数量庞大，成本高昂。而如今市场上还没有相关鉴定牙囊干细胞的产品，缺少一种高效，稳定且方便快捷的方法进行牙囊干细胞的鉴定。技术实现要素：针对本领域存在的问题，经过蛋白质组学以及荧光定量pcr实验，发现hexb在牙囊干细胞中的蛋白水平和mrna水平都存在显著性的表达升高。因此，以hexb为检测靶标，本发明提供一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒，通过该方法可实现高效、稳定、快速方便的鉴定牙囊干细胞。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种牙囊干细胞的鉴定方法，包括来源于口腔组织的干细胞总rna的提取、反转录获取cdna模板，再利用测定hexb基因表达水平的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，根据扩增结果进行统计学检验，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为参考基因组(δct)将ct值标准化，并使用建立的基于效率的δδct方法将每个样品与进行比较，为了评估表达强度，将归一化的ct值(δct)转换为归一化的表达值，根据下式：en＝2^(-δct)，计算2^(-δδct)，作图分析，hexb基因mrna相对高表达的来源于牙囊组织的成纤维状细胞，即是牙囊干细胞。进一步的，所述细胞总rna的提取具体步骤为：细胞倒去培养基，用已过滤的pbs洗2-3次，加入trizol溶液用枪吹散贴附在培养皿/瓶上的细胞，待观察到细胞明显分散，转移到离心管中，震荡后室温静置，加入氯仿，震荡混匀后室温静置分层，离心，此时样品会明显分成3层；吸取上层水相，加入异丙醇混匀，室温静置，离心，弃上得到rna沉淀，加入无水乙醇，洗1-3次，晾干或者吹干，将干燥后的rna沉淀溶解于depc处理水或无菌水中，吹匀，即得到细胞总rna。进一步的，所述反转录获取cdna模板的具体步骤为：吸取提取得到的细胞总rna，定量为50ng/μl，并在含有碱基，随机引物和反转录酶的混合液中进行cdna的衍生，37℃反应后高温终止反应。进一步的，所述荧光定量pcr扩增的具体步骤为：配制pcr反应体系：特异性引物混合液1μl，mastermix混合物18μl，模板cdna1μg，加盖密封，将上述反应放荧光定量pcr仪中，第一步预变性95℃反应10min；第二步变性95℃反应10s；第三步退火60℃反应30s；第四步延伸72℃反32s；第二步到第四步循环40次；进入溶解程序，依次进行95℃反应15s；60℃反应1min；95℃反应15s；60℃反应15s。进一步的，所述特异性引物混合液中引物的浓度为2pmol/μl。本发明的另一方面：一种用于鉴定牙囊干细胞的特异性引物组，所述特异性引物组包括：上游引物下游引物序列表中seqidno.1所示的上游引物序列表中seqidno.2所示的下游引物序列表中seqidno.3所示的上游引物序列表中seqidno.4所示的下游引物序列表中seqidno.5所示的上游引物序列表中seqidno.6所示的下游引物序列表中seqidno.7所示的上游引物序列表中seqidno.8所示的下游引物序列表中seqidno.9所示的上游引物序列表中seqidno.10所示的下游引物序列表中seqidno.11所示的上游引物序列表中seqidno.12所示的下游引物序列表中seqidno.13所示的上游引物序列表中seqidno.14所示的下游引物序列表中seqidno.15所示的上游引物序列表中seqidno.16所示的下游引物序列表中seqidno.17所示的上游引物序列表中seqidno.18所示的下游引物序列表中seqidno.19所示的上游引物序列表中seqidno.20所示的下游引物序列表中seqidno.21所示的上游引物序列表中seqidno.22所示的下游引物一种鉴定牙囊干细胞的检测试剂盒，所述试剂盒包括测定hexb基因表达水平的特异性引物。进一步的，所述特异性引物包括：上游引物下游引物序列表中seqidno.1所示的上游引物序列表中seqidno.2所示的下游引物序列表中seqidno.3所示的上游引物序列表中seqidno.4所示的下游引物序列表中seqidno.5所示的上游引物序列表中seqidno.6所示的下游引物序列表中seqidno.7所示的上游引物序列表中seqidno.8所示的下游引物序列表中seqidno.9所示的上游引物序列表中seqidno.10所示的下游引物序列表中seqidno.11所示的上游引物序列表中seqidno.12所示的下游引物序列表中seqidno.13所示的上游引物序列表中seqidno.14所示的下游引物序列表中seqidno.15所示的上游引物序列表中seqidno.16所示的下游引物序列表中seqidno.17所示的上游引物序列表中seqidno.18所示的下游引物序列表中seqidno.19所示的上游引物序列表中seqidno.20所示的下游引物序列表中seqidno.21所示的上游引物序列表中seqidno.22所示的下游引物进一步的，所述试剂盒还包括rna提取试剂、反转录试剂和qpcr试剂。本发明相比现有技术的有益效果为：1、本发明所述的牙囊干细胞的鉴定方法是基于蛋白质组学和实时荧光定量实验结果，选择的hexb在mrna水平和蛋白水平均稳定呈现高表达，结果稳定可靠；2、现有的牙囊肝细胞鉴定方法，从成骨成脂(28天)、流式细胞术(1天)，再到增殖实验(7天)，一共需要大约1个月的时间；而本发明基于实时荧光定量的鉴定方法，不需要进行基于荧光抗体的表面标志物鉴定，提取rna(1小时)到反转录(0.5小时)、qpcr(2小时)，大约只需要4个小时，节省了大量的时间和仪器、试剂成本；3、本发明涉及的hexb引物，特异性高，不受样本的异质性的干扰；4、本发明所述的鉴定方法是基于sybr发光进行的荧光定量，灵敏度好，只需要待鉴定样本1μg的cdna模板即可得到稳定的结果，因此，本发明对于牙囊干细胞与其他干细胞的区分和牙科组织工程具有较高参考价值，适于推广应用。附图说明图1为实施例1中牙囊组织原代分离的细胞光学显微镜观察结果；图2为实施例1中根尖牙乳头组织原代分离的细胞光学显微镜观察结果；图3为实施例1中蛋白水平进行组学测定的结果示意图；图4为实施例1中hexb基因mrna相对表达量示意图；图5为实施例2中hexb基因mrna相对表达量示意图；图6为实施例3中hexb基因mrna相对表达量示意图；图7为对比例中表面标志物检测示意图；图8为对比例中成骨分化诱导的结果示意图。具体实施方式实施例1本实施例提供了一种牙囊干细胞的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：1、细胞原代分离和培养用镊子和眼科手术剪将牙囊组织从牙齿表面分离下来。根尖牙乳头直接剪下。用含双抗的pbs冲洗组织5遍以上。将组织剪碎后再次用含有双抗的pbs洗1遍。2000rpm离心30s，使组织全部浸在含0.3％胶原酶ⅰ和0.4％中性蛋白酶的组织消化液中。37℃消化组织2h，每过5min轻轻震荡消化液，使组织被充分消化，直到肉眼看不到明显组织块为止。将组织消化液1200rpm离心10min收集单个细胞和少量消化不完全的组织。小心弃去上清，将沉淀重悬，再次离心，彻底除去胶原酶，接种到12孔板。放于含有20％fbs、1％双抗和100μmoll-抗坏血酸的dmem完全培养液中培养。置于含5％co2、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。对孔板内的培养基半换液，48h后对其进行首次换液，此后每3～4天换液。显微镜下观察，贴壁后用全换液的方式进行换液。图1、图2分别示出了牙囊组织原代分离的细胞和根尖牙乳头组织原代分离的细胞光学显微镜观察结果。原代口腔干细胞融合率达80％～90％时，1:4的比例进行细胞传代。待细胞融合率达80％～90％即可进行下一步实验。2、总rna的提取：实验前，用rna抑制剂处理操作环境。以下操作中，带口罩，对盛有枪头、离心管等的锥形瓶，将瓶口水平取物，之后立即盖好瓶口，以免环境污染；1)倒去培养皿/瓶中的培养基，pbs洗2-3次，加入0.7mltrizol溶液(红色)，用枪吹散贴附在培养皿/瓶上的细胞，直接转移到1.5ml离心管中，再在培养皿加入0.5ml的trizol冲洗培养皿收获剩下未完全吹散下来的细胞，转移到同一离心管中震荡后，室温静置5min；2)直接加入200μl氯仿，漩涡震荡15s混匀后室温放置2-3min(或加入氯仿可以使蛋白、dna、脂类充分分离)；3)4℃，12000rpm离心20min；4)离心后，混合物分成三相，吸取上层水相(水相层的容量约为加入trizol量的60％)约400μl(黄枪头吸取，其中溶有mrna)至另一离心管(1.5ml)中，注意不要接触到中间相；5)加入500μl(理论上与上步骤中吸取的上层水相等体积)异丙醇混匀(用枪吹匀即可)，室温放置10min；6)4℃，12000rpm离心20min，rna形成白色小团沉于管底，弃上清；7)加入0.5-1.0ml无水乙醇，漂洗，倒掉，2次；8)在室温环境，无菌操作台中，吹干5-10min；9)用20μldepc处理水(无菌水)，吹匀；10)测od值定量rna浓度和纯度，od260/od280要在1.8-2.0之间。3、反转录获取cdna模板：吸取提取得到的细胞总rna，定量为50ng/μl，并在含有碱基，随机引物和反转录酶的混合液中进行cdna的衍生，37℃反应后高温终止反应。4、荧光定量pcr：在200μlpcr管配制反应体系：特异性引物混合液1μl，mastermix混合物18μl，模板cdna1μl，加盖密封，将上述反应放荧光定量pcr仪中，第一步预变性95℃反应10min；第二步变性95℃反应10s；第三步退火60℃反应30s；第四步延伸72℃反32s；第二步到第四步循环40次；进入溶解程序，依次进行95℃反应15s；60℃反应1min；95℃反应15s；60℃反应15s；所述特异性引物混合液含有hexb引物，所述特异性引物的碱基序列分别为：seqidno.1：5’-tctgctccttggtact-3'；seqidno.2：5’-ctgtcataggcgtcatc-3’；其中，所有引物的浓度为2pmol/μl。所述反应液主要是含有2×ultrasybrmixture混合液，用gapdh作为参考基因组(δct)将ct值标准化，并使用建立的基于效率的δδct方法将每个样品与进行比较。为了评估表达强度，将归一化的ct值(δct)转换为归一化的表达值，根据下式：en＝2^(-δct)，计算2^(-δδct)，作图分析。经过t-test后，计算p<0.05即为有差异。本实施例中，蛋白水平进行组学测定的结果如图3所示，图4是经过mrna相对表达结果较高的为牙囊干细胞，较低的为根尖牙乳头干细胞。实施例2本实施例提供了一种牙囊干细胞的鉴定方法，所述方法与实施例1相同，区别在于，进行荧光定量pcr时，所使用的特异性引物的碱基序列为：seqidno.3：5’-cgctctcggtgaagatgac-3'，seqidno.4：5’-aagccatggcatccagagt-3'。经分析，如图5所示，mrna相对表达结果较高的为牙囊干细胞，较低的为根尖牙乳头干细胞。实施例3本实施例提供了一种牙囊干细胞的鉴定方法，所述方法与实施例1相同，区别在于，进行荧光定量pcr时，所使用的特异性引物的碱基序列为：seqidno.7：5’-ggttttggatattattgcaaccataaa-3'，seqidno.8：5’-agtacagattgctgtggcct-3'。经分析，如图6所示，mrna相对表达结果较高的为牙囊干细胞，较低的为根尖牙乳头干细胞。对比例本对比例提供了一种现有牙囊干细胞的鉴定方法，具体包括以下步骤：1，细胞培养和分离用镊子和眼科手术剪将牙囊组织从牙齿表面分离下来，用含双抗的pbs冲洗组织5遍以上。将组织剪碎后再次用含有双抗的pbs洗1遍。2000rpm离心30s，使组织全部浸在含0.3％胶原酶ⅰ和0.4％中性蛋白酶的组织消化液中。37℃消化组织2h，每过5min轻轻震荡消化液，使组织被充分消化，直到肉眼看不到明显组织块为止。将组织消化液1200rpm离心10min收集单个细胞和少量消化不完全的组织。小心弃去上清，将沉淀重悬，再次离心，彻底除去胶原酶，接种到12孔板。放于含有20％fbs、1％双抗和100μmoll-抗坏血酸的dmem完全培养液中培养。置于含5％co2、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。对孔板内的培养基半换液，48h后对其进行首次换液，此后每3～4天换液。显微镜下观察，贴壁后用全换液的方式进行换液。原代口腔干细胞融合率达80％～90％时，1:3的比例进行细胞传代。2、流式细胞术分析胰酶将细胞消化下来。1200rpm离心5min，弃去上清，加入pbs重悬，再次离心收集细胞。1×106个细胞，加入1μg荧光抗体，冰上孵育30min。1200rpm离心5min，弃上清，加入pbs洗涤2次未结合的荧光抗体。1200rpm离心5min收集细胞，用于流式细胞仪上机检测。3、成骨分化实验0.1％明胶到培养器皿中，摇匀并覆盖整个培养器皿。静置30min。弃去多余明胶，晾干后，即可用于接种细胞。0.25％胰酶消化，按照2×104cells/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1％明胶的孔板中，每孔加入2ml培养基。37℃，5％co2的培养箱中进行培养。当细胞融合度达到60％～70％时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2ml成骨诱导分化完全培养基。每隔3天换用新鲜的成骨诱导分化完全培养基，使用前预热至37℃。诱导2～4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。弃去培养基，用1×pbs小心冲洗1～2次。每孔加入2ml4％中性甲醛溶液，固定30min。用pbs小心冲洗2次。每孔中加入1ml茜素红染液染3～5min，用pbs冲洗2次。置于显微镜下观察。4、结果如下：如图7所示，牙囊干细胞具有高度增殖能力，并阳性表达间充质标志物cd90和cd146，且阴性表达造血干细胞标志物cd34。如图8所示，经过成骨分化诱导后，经染色后被观察到能够形成钙结节。上述现有的牙囊肝细胞的鉴定方法，大约1个月的时间才能得到最终鉴定结果，同时对仪器设备要求高，耗费试剂成本较高、处理复杂，对操作人员的技术要求程度高。<110>康妍葆（北京）干细胞科技有限公司<120>一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒<160>22<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<400>1tctgctccttggtact16<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<400>2ctgtcataggcgtcatc17<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cgctctcggtgaagatgac19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4aagccatggcatccagagt19<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5gctgaattccaggctaaaaccca23<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6atctcctcccaaatgaat18<210>7<211>27<212>dna<213>人工序列<400>7ggttttggatattattgcaaccataaa27<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agtacagattgctgtggcct20<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9ctcctagtgccctatatctttg22<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<400>10tacgatgattggccttga18<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gatgttggcgctgctgactc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12gcaggactcgaattcctcgt20<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13atgttggcgctgctgact18<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14tgctccccaaactctgttgg20<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列<400>15atgttggcgctgctgactc19<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16gggtcatcttcaccgagagc20<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列<400>17gatgttggcgctgctgact19<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18gggctgtggctgatgtagaa20<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列<400>19ctgactcaggtggcgctg18<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20tcagcaggttcatgatgcca20<210>21<211>18<212>dna<213>人工序列<400>21tgttggcgacactgctgg18<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<400>22ggttcggggtcatcttcacc20当前第1页12