本发明属于藻类养殖技术领域，特别涉及一种适用于室内养殖池的杜氏盐藻的优化培育方法。
背景技术：
盐藻又称杜氏盐藻(dunalselal.salana)，是绿藻门的一种嗜盐的单细胞藻类。类胡萝卜素是一种重要的食用色素，广泛存在于植物、藻类和真菌中，目前已有研究发现其中的β-胡萝卜素具有很强的清除自由基的功能，且对于防治肿瘤、心脑血管疾病、阿尔茨海默症以及白内障等与年龄有关的退行性疾病具有一定的作用，因而成为一种炙手可热的保健品，目前也常应用于保护视力、缓解眼部疲劳等。而工业合成的β-胡萝卜素多为反式结构，其效力和安全程度均不及天然β-胡萝卜素。由于盐藻具有在特定环境中大量产生类胡萝卜素特别是β胡萝卜素的能力，因此具备高度的商业价值，也成为热门的养殖对象。
目前已有研究表明，杜氏盐藻生长繁殖的最适条件与积累类胡萝卜素的最适条件并不相同、甚至存在较大差别；现有的盐藻养殖方法大多是为了平衡这两方面，并且多是侧重于生长，因此并不能为杜氏盐藻提供最佳的培养环境，从而大大影响了类胡萝卜素的产量(目前盐藻类胡萝卜素产量普遍在8～10％)。因此，迫切需要一种既能保证杜氏盐藻正常生长繁殖、又能促进类胡萝卜素大量积累的培养方法。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种杜氏盐藻的优化培育方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：配置一期培养基，盐度为13～18％；
s2：向所述一期培养基中接种藻种进行一期培养，光照周期为5000～8000lx光强照射t1、停止光照t2，其中t1:t2＝3～5:1；温度周期为25～35℃14～18h、15～25℃6～10h；重复上述光照周期和温度周期，定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养10～14天；
s3：配置二期培养基，盐度为26～32％；
s4：所述一期培养结束后，将藻种接种到所述二期培养基中进行二期培养，光照周期为10000～15000lx光强照射t3、停止光照t4，其中t3:t4＞2(t1:t2)；温度周期为25～30℃6～10h、5～10℃14～18h；重复上述光照周期和温度周期，定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养5～7天。
上述方法中，一期培养首先对盐藻进行扩大培养、使盐藻细胞正常生长繁殖、积累结构物质；经过一起培养、积累了足够数量和活力的盐藻细胞后，再通过二期培养提供相对逆境的环境、以促进类胡萝卜素的大量积累。
进一步地，步骤s2中，光照周期为5000～8000lx光强照射18～21h、停止光照3～6h。
通过在长时间光照之间间隔设置短时间的无光照时期，使光周期在18:6～21:3之间，一方面通过长时间的光照促进盐藻细胞的生长代谢，另一方面也通过适度的黑暗促进盐藻细胞分裂增殖。
进一步地，步骤s2中，光照周期为7000lx光强照射20h、停止光照4h；温度周期为28℃16h、18℃8h。
上述光周期(20:4)和温度周期为一期培养阶段的最佳光周期和温度周期，可以为盐藻细胞提供最佳生长增值条件。
进一步地，步骤s4中，光照周期为10000～15000lx光强照射22～23.5h、停止光照0.5～2h。
二期培养中，进一步提高光照强度、延长光照时间，增大光周期，有效促进类胡萝卜素的生成和积累；在长时间光照中仍然保留短时间的无光照时期，可以使盐藻细胞定期恢复增殖能力，从而确保盐藻细胞始终处于活跃状态、使细胞数量保持稳定。
进一步地，步骤s4中，光照周期为12000lx光强照射23h、停止光照1h；温度周期为28℃8h、8℃16h。
上述光周期(23:1)为二期培养阶段的最佳光周期，可以为盐藻细胞提供积累类胡萝卜素的最佳条件；低温和较大温差的逆境条件可以进一步促进盐藻细胞大量合成和积累类胡萝卜素。
进一步地，所述一期培养基由摩尔数比为7～10:4～6:3～4:1～2:1～2的碳酸氢钠、磷酸氢二钾、硝酸钙、氯化镁以及柠檬酸螯合铁溶于水中制成；所述一期培养基的盐度为16％。
上述成分可以为生长繁殖阶段的盐藻细胞提供充足的养分
进一步地，步骤s2中，向所述一期培养基中接种所述藻种的接种密度为1.6×105个/l。
进一步地，所述二期培养基由摩尔数比为7～10:6～9:2～3:2～3:1.5～2:1～2:0.5～1的氯化钠、氯化钾、尿素、葡萄糖、硅酸钠、硫酸锰以及维生素c磷酸酯溶于水中制成；所述二期培养基的盐度为30％。
上述成分一方面可以为二期培养阶段创造高盐度、低营养盐的环境，另一方面也能为盐藻细胞提供类胡萝卜素积累阶段所需的营养物质。
进一步地，步骤s2中，向所述二期培养基中接种所述藻种的接种密度为2.1×106个/l。
进一步地，步骤s2和s4中，采用摩尔比为4～6:3～4:1～2的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值。
上述酸类物质在水体中稀释后也可以为盐藻的生长繁殖或类胡萝卜素的生成积累提供养分。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括正常培养条件的一期培养，以及长时间强光照、低温低、温差大、高盐度、低营养盐的二期培养，一期培养为盐藻细胞提供了适宜的生长环境、可有效促进盐藻细胞生长繁殖、积累结构物质；二期培养为盐藻细胞提供相对逆境的环境，以促进类胡萝卜素的大量积累，同时不会对盐藻细胞造成严重损害。该方法既能促进杜氏盐藻的正常生长繁殖、又能促进杜氏盐藻大量合成和积累类胡萝卜素，适宜在实验室环境或室内大型养殖池中进行广泛应用。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：采用摩尔数比为7:4:3:1:1的碳酸氢钠、磷酸氢二钾、硝酸钙、氯化镁以及柠檬酸螯合铁溶于水中制成一期培养基，盐度为13％；
s2：向一期培养基中接种藻种进行一期培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为8000lx光强照射18h、停止光照6h；温度周期为25℃18h、15℃6h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为4:3:1的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养10～14天；
s3：采用摩尔数比为10:9:3:3:2:2:1的氯化钠、氯化钾、尿素、葡萄糖、硅酸钠、硫酸锰以及维生素c磷酸酯溶于水中制成二期培养基，盐度为32％；
s4：一期培养结束后，将藻种接种到二期培养基中进行二期培养，接种密度为2.1×106个/l；光照周期为10000lx光强照射23.5h、停止光照0.5h；温度周期为30℃6h、10℃18h；重复上述光照周期和温度周期，采用步骤s2的水溶液定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养5～7天。
实施例2
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：采用摩尔数比为10:6:4:2:2的碳酸氢钠、磷酸氢二钾、硝酸钙、氯化镁以及柠檬酸螯合铁溶于水中制成一期培养基，盐度为18％；
s2：向一期培养基中接种藻种进行一期培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为5000lx光强照射21h、停止光照3h；温度周期为35℃14h、25℃10h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为3:2:1的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养10～14天；
s3：采用摩尔数比为7:6:2:2:1.5:1:0.5的氯化钠、氯化钾、尿素、葡萄糖、硅酸钠、硫酸锰以及维生素c磷酸酯溶于水中制成二期培养基，盐度为26％；
s4：一期培养结束后，将藻种接种到二期培养基中进行二期培养，接种密度为2.1×106个/l；光照周期为15000lx光强照射22h、停止光照2h；温度周期为25℃10h、5℃14h；重复上述光照周期和温度周期，采用步骤s2的水溶液定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养5～7天。
实施例3
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：采用摩尔数比为8:5:4:2:1的碳酸氢钠、磷酸氢二钾、硝酸钙、氯化镁以及柠檬酸螯合铁溶于水中制成一期培养基，盐度为16％；
s2：向一期培养基中接种藻种进行一期培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为7000lx光强照射20h、停止光照4h；温度周期为28℃16h、18℃8h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为5:3:2的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养10～14天；
s3：采用摩尔数比为9:7:3:2:1.5:1:1的氯化钠、氯化钾、尿素、葡萄糖、硅酸钠、硫酸锰以及维生素c磷酸酯溶于水中制成二期培养基，盐度为30％；
s4：一期培养结束后，将藻种接种到二期培养基中进行二期培养，接种密度为2.1×106个/l；光照周期为12000lx光强照射23h、停止光照1h；温度周期为28℃8h、8℃16h；重复上述光照周期和温度周期，采用步骤s2的水溶液定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养5～7天。
对照例1
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：采用摩尔数比为8:5:4:2:1的碳酸氢钠、磷酸氢二钾、硝酸钙、氯化镁以及柠檬酸螯合铁溶于水中制成培养基，盐度为16％；
s2：向培养基中接种藻种进行培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为7000lx光强照射18h、停止光照6h；温度周期为28℃16h、18℃8h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为5:3:2的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养21天。
对照例2
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：根据cn105199957a提供的盐藻培养基配方配置培养基；
s2：向培养基中接种藻种进行培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为7000lx光强照射18h、停止光照6h；温度周期为28℃16h、18℃8h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为5:3:2的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养21天
对照例3
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：采用摩尔数比为8:5:4:2:1的碳酸氢钠、磷酸氢二钾、硝酸钙、氯化镁以及柠檬酸螯合铁溶于水中制成一期培养基，盐度为16％；
s2：向一期培养基中接种藻种进行一期培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为5000lx光强照射12h、停止光照12h；温度周期为28℃16h、18℃8h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为5:3:2的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养10～14天；
s3：采用摩尔数比为9:7:3:2:1.5:1:1的氯化钠、氯化钾、尿素、葡萄糖、硅酸钠、硫酸锰以及维生素c磷酸酯溶于水中制成二期培养基，盐度为30％；
s4：一期培养结束后，将藻种接种到二期培养基中进行二期培养，接种密度为2.1×106个/l；光照周期为7000lx光强照射20h、停止光照4h；温度周期为28℃16h、18℃8h；重复上述光照周期和温度周期，定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养5～7天。
对照例4
一种杜氏盐藻的优化培育方法，包括如下步骤：
s1：根据cn104560722a提供的盐藻培养基配方配置培养基；
s2：向培养基中接种藻种进行一期培养，接种密度为1.6×105个/l；光照周期为7000lx光强照射20h、停止光照4h；温度周期为28℃16h、18℃8h；重复上述光照周期和温度周期，采用摩尔比为5:3:2的柠檬酸、延胡索酸以及酒石酸溶于水中得到的ph为4～5的水溶液调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养10～14天；
s3：一期培养结束后，将藻种接种到新的培养基中进行二期培养，接种密度为2.1×106个/l；光照周期为12000lx光强照射23h、停止光照1h；温度周期为28℃8h、8℃16h；重复上述光照周期和温度周期，采用步骤s2的水溶液定期调节ph值、使ph保持在7～8，连续培养5～7天。
实验室小型培养试验
选取相同来源、同一批次的盐藻藻种，取8个相同的玻璃钢水槽，采用上述混合藻种进行培养试验，其中1～7组分别采用实施例和对照例提供的方法，第8组为空白对照。培养结束后取样进行计数，并测定培养液中β-胡萝卜素的含量，具体测定方法为：参考文献中的方法提取β-胡萝卜素，用分光光度计测定450nm处的吸光度值，按下式计算β-胡萝卜素的含量，结果见表1：
β胡萝卜素＝od450×d×10000/2500
(式中d：稀释倍数；2500为1％β-胡萝卜素纯品的百分吸收系数)
表1不同方法培养结果比较
与ck比较，p*＞0.05，p&＜0.01，p#＜0.05。
由表1可知，t1～t3组的盐藻细胞增加量和藻液β-胡萝卜素含量显著高于其余各组，其中以t3组的各项指标最为突出；在t7组中，上述指标均较t4～t6组高，但仍低于t1～t3组。表明本申请提供方法在实验室的小型培养环境中既能有效促进盐藻细胞生长增殖、又能显著提高β-胡萝卜素的积累。
室内养殖池大型培养试验
选择甘肃河西地区的盐藻室内大型养殖池、采用实施例3提供的方法进行养殖试验，培养结束后取样进行计数，并用分光光度计测定培养液中β-胡萝卜素的含量，结果见下表。
表2养殖池内杂藻控制效果
由表2可知，虽然大型养殖池的养殖环境的控制相对于实验室存在一定难度，但该方法在室内的大型养殖池仍然取得了较好的盐藻养殖和β-胡萝卜素积累效果。因此，在盐藻大规模养殖日趋规范化的情况下，本申请提供的方法必将能取得广泛的应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。