调控植物种子大小的基因及其应用的制作方法

文档序号：18972263发布日期：2019-10-29 02:59阅读：459来源：国知局

本发明涉及植物分子生物学、生物化学、遗传学和植物育种领域，特别涉及一个调控种子大小的基因，更具体地涉及一个调控种子大小的dlz基因的核酸分子及其突变体及其在育种中的应用。

技术背景

植物种子是人类赖以生存的最重要食物来源，稻米、玉米和小麦是我国的三大主粮，粮食产量和价格影响着国计民生。人口持续增长与耕地面积不断减少的现状，对我国粮食生产提出了严峻的挑战。以水稻为例，水稻产量主要决定于三个要素——有效穗数、每穗实粒数和粒重，单位面积产量还受到水稻株型的影响，这些因素都是受多基因与环境互作控制的复杂性状，并且各个子性状之间还存在相关性，要改良产量性状还需协调好各构成要素之间的关系。根据现有的经验，高产品种可以分成四个类型，即大穗偏重型、大粒偏重型、多穗偏重型和综合兼顾型。单株有效穗数的遗传力最小，很容易受环境影响，对单株有效穗数的改良不如通过合理密植来调整单位面积的有效穗数。每穗粒数的遗传力适中，改良起来仍有不小的难度。相比之下，粒重是产量构成要素中遗传力最高的，对其进行改良相对容易(张启发，绿色超级稻的构想与实践，科学出版社，2009)。

水稻粒重由种子大小即颖壳的体积和胚乳发育状况两个因素决定。颖壳通常在水稻开花之前就已经定型，受精之后灌浆形成的米粒大小和形状受制于颖壳的容积，因此，颖壳的体积是粒重大小的先决条件。对颖壳形状与大小的描述一般称为粒形，通常用粒长、粒宽、粒厚和长宽比表示。值得一提的是，粒形不仅是重要的产量性状之一，也是主要的外观品质性状，粒形与稻米的其它品质性状如垩白率、糙米率、精米率之间也存在一定的相关性。因此，在育种中通过对种子大小与形状的选择，不仅可以提高产量潜力，还可以间接调控稻米品质。

植物种子大小是多基因控制的数量性状，在前期大量的qtl扫描和定位的研究基础上，近十年来相关基因的克隆呈现一种爆发的趋势。对水稻等重要作物种子大小调控基因的挖掘和功能研究已经成为功能基因组学研究的一大热点。这些基因的发现和功能分析促进了植物种子大小基因调控网络研究的逐步深入，研究人员开始探索关键基因聚合的最佳设计，通过评价优异基因型聚合的增产效应，为创制设计型产量突破性的新品种提供理论指导和材料支撑。

simm(simultaneousidentificationofmultiplemutations)(yanetal.,simultaneousidentificationofmultiplecausalmutationsinrice.frontiersinplantscience,2016)是一种基于二代测序技术的快速高效的定位突变基因的方法。与其他方法相比，simm可在不需要野生型基因组数据的前体下，以其他同样或相近来源的突变体为背景，同时鉴定多个突变性状相关的突变位点，具有更高的灵敏度和特异性，有助于快速定位候选功能基因，辅助水稻功能基因研究及水稻设计育种。此外，simm还可用于极端表型池qtl(数量性状基因座，quantitativetraitlocus)定位，有效缩小候选区间，辅助定位主效qtl基因。此方法也可有效应用于定位其他物种ems突变体候选功能基因。

高分辨率熔解曲线分析(high-resolutionmeltingcurveanalysis,hrm)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限。该方法无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对pcr反应产物进行分析。其原理是：双链dna的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中双链dna解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到双链dna上，因此利用实时pcr技术，通过实时检测双链dna熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将pcr产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。

本发明通过ems诱变水稻籼稻品种“黄华占”，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的大粒突变体，进而对该突变体进行表型鉴定、遗传分析和遗传背景鉴定，并利用simm方法、hrm技术和基因信息分析，成功定位并克隆了一个种子大小调控基因dlz，该基因位于12号染色体上，基因座位号为loc_os12g41820(msu登陆号)，该基因的突变可导致水稻产生大粒性状表型，从而可应用于控制作物籽粒的大小。本发明有助于提高作物产量和改善品质，为培育具有大粒重的水稻新品种提供基因资源和技术支持，对作物农艺性状的提高和高产分子育种工作具有重要的意义和应用价值。

技术实现要素：

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明提供了一个调控种子大小的基因dlz(大粒占，dalizhan)，该基因位于12号染色体上，其在水稻中的基因位点编号是loc_os12g41820(msu登陆号，参考ricegenomeannotationproject，http://rice.plantbiology.msu.edu/)，该基因突变后可以使含有该突变的植株的种子粒型变大。

由于不同品种间的同一基因往往存在单核苷酸多态性，即同一基因的核苷酸序列往往存在个别碱基的差异，但是水稻品种数量很多，发明人不可能进行一一列举，因此本发明仅提供了在籼稻和粳稻中具有代表性的两个品种的序列。具体地，所述水稻dlz基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如调控植物种子大小的基因loc_os12g41820所示的核苷酸序列；

(b)如seqidno：1、2、20或21所示的核苷酸序列；

(c)其编码氨基酸序列如seqidno：3、55、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列；

(d)在严谨条件下能够与(a)-(c)中所述序列的dna杂交的dna序列；或(e)与(a)-(d)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有调控植物种子大小功能的dna序列；或

(f)与(a)-(e)之任一所述序列互补的dna序列。

上述调控种子大小的dlz基因可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本发明所述的种子大小调控基因还包括与dlz基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同样的种子大小调控功能的同源基因。所述同源基因包括在严谨条件下能够与本发明所公开的dlz基因的核苷酸序列杂交的dna序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mmnacl、40mmpipes(ph6.4)和1mmedta的杂交液中杂交，所述杂交的温度优选是53℃-60℃，杂交时间优选为12-16小时，然后用含0.5×ssc和0.1％sds的洗涤液洗涤，洗涤温度优选为62℃-68℃，洗涤时间为15-60分钟。

同源基因还包括与本发明所公开的dlz基因所示的序列有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有调控种子大小功能的dna序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。

本发明所述的基因序列可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(grammagrass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。

本发明提供了一种调控植物种子大小的方法，所述方法通过影响将本发明所提供的dlz基因表达水平，从而影响植物种子大小。所述影响植物种子大小是指通过降低dlz基因的表达水平，从而使所述植株的种子大小发生改变，如导致大粒的表型。具体地，取决于具体应用需求，可以通过多种方法来影响dlz基因在植物体内的表达水平，从而达到调控种子大小的效果。更具体地，调控dlz基因的表达水平可以使用许多本领域普通技术人员可获得的工具进行，例如通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，都可以用于破坏dlz基因的正常表达，从而获得种子变大的植株。

本发明还提供一种获得dlz基因的大粒突变体材料的方法，所述方法通过突变水稻内源的dlz基因，或突变与其高度同源的基因的核苷酸序列，使该植物调控种子大小的作用途径被改变。所述dlz基因的核苷酸序列如seqidno：1、2、20或21所示，所述dlz基因的氨基酸序列如seqidno：3、55、56、57、58、59、60或61所示。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法所导致的基因突变，化学方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变，也可以是通过rnai等基因沉默手段或者通过基因定点突变的方法，所述基因定点突变的方法包括但不限于zfn定点突变方法、talen定点突变方法、和/或crispr/cas9等基因编辑方法。

本发明还提供了一种dlz大粒突变体材料的应用方法，其特征在于所述突变材料是由dlz基因的核苷酸序列的突变所造成，含有突变型dlz基因的植株具有大粒种子的表型，其中所述dlz基因的核苷酸序列优选如seqidno：1、2、20或21所示。具体地，本发明所述突变后的核苷酸序列如seqidno：4所示，氨基酸序列如seqidno：5所示，在大粒突变体中，dlz基因的第四个外显子上发生两个碱基的突变，具体由aaa突变为tta，导致seqidno：3蛋白的第321位氨基酸由lys突变为leu，导致得到的转录本与蛋白产物均发生变化，从而使植物具有大粒种子表型。本领域技术人员应该知晓，可以将所述核苷酸序列seqidno：4构建到植物表达载体，进行植物转化，从而获得新的转基因的大粒突变体材料。所述突变体材料的应用，包括但不限于在杂交育种中的应用，更具体的是指包括但不限于培育植物品种或品系、培育种子尺寸增大的植物品种或品系和培育种子尺寸变小的植物品种或品系、鉴定作物大粒品种和小粒品种的分子标记等应用。

本发明还提供了一种表达盒在调控植物种子大小中的应用，所述表达盒含有调控植物种子大小的dlz基因的dna序列，所述调控植物种子大小的基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如调控植物种子大小的基因loc_os12g41820所示的核苷酸序列；

(b)如seqidno：1、2、20或21所示的核苷酸序列；

(c)其编码氨基酸序列如seqidno：3、55、56、57、58、59、60或61所示的核苷酸序列；

(f)与(a)-(e)之任一所述序列互补的dna序列。

具体地，上述表达盒中的种子大小调控基因还可操作性地连有一个可驱动其表达的启动子，所述构建体中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将驱动所连核苷酸序列在植株中的表达。表达盒中的启动子包括但不限于组成型表达启动子、诱导型启动子、组织特异表达启动子、时空特异表达启动子等。本发明所述的组成型启动子的基因表达不具有组织和时间特异性，外界因素对组成型启动子启动的外源基因表达几乎没有影响。所述组成型启动子包括但不限于camv35s、fmv35s、水稻肌动蛋白(actin1)启动子、玉米泛素(ubiquitin)启动子等。本发明所述的组织特异性启动子除包含应有的一般启动子元件外，还具有增强子以及沉默子的特性，该类启动子的优点在于可启动基因在植物特定组织部位的表达，避免外源基因的不必要表达，从而节约植物体的整体能量消耗。本发明所述的诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平的启动子，目前已经分离的诱导型启动子包括但不限于逆境诱导表达启动子、光诱导表达启动子、热诱导表达启动子、创伤诱导表达启动子、真菌诱导表达启动子和共生细菌诱导表达启动子等。本发明所述的组织特异性启动子包括但不限于ltp2种子特异表达启动子、end2种子特异表达启动子、糊粉层特异表达启动子等。

上述表达盒中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供dlz基因的自身终止子，也可以是来自外源的终止子，如胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域等。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于rubisco的小亚基、植物epsp合酶、玉米brittle-1、叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中，可对多种dna片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的dna序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将dna片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

本发明上述表达盒，还进一步的可以包含一个筛选基因，所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株、植物组织细胞或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因dsred、mcherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于：氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体dna中。

本发明所提供的dlz基因的核苷酸序列和启动子序列或表达盒可被插入载体、质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可插入至被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。

本发明所述的将核苷酸序列、载体或表达盒转入植株或引入植株或对植株进行转化，均指通过常规的转基因方法，将核苷酸序列、载体或表达盒转入到受体细胞或受体植株中。植物生物技术领域技术人员已知的任何转基因方法均可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的dna摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射。所述转化方法也包括农杆菌介导的植物转化方法等。

本发明提供了一种控制籽粒大小的杂交植物的生产方法，其特征在于，该方法包括：

(a)构建本发明所提供的表达盒；

(b)将步骤(a)获得的表达盒导入植物细胞；

(c)再生出转基因植物；和

(d)选择出转基因植物；并且

(e)任选地，增殖步骤(d)获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的dna摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见horschrb等(1985)science225：1229；whiteff，vectorsforgenetransferinhigherplants，transgenicplants，第1卷，engineeringandutilization，academicpress，1993，pp.15-38；jenesb等.techniquesforgenetransfer，transgenicplants，第1卷，engineeringandutilization，academicpress，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(ti或ri质粒)和t-dna元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而t-dna被整合进植物细胞的基因组中。t-dna可位于ri-质粒或ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一个水稻种子大小调控基因，该基因的突变可使作物(如水稻)的籽粒变大，从而增加作物产量，为水稻的高产育种提供了新的基因资源。

(2)本发明提供的dlz基因可以作为控制作物籽粒大小，提高产量和品质的一个基因，应用于作物品种的改良，有助于选育出优质性状的水稻新品种。同时，dlz基因还可用于分子标记技术，为水稻大粒高产育种等实际生产应用服务。

(3)本发明提供的dlz基因在玉米、高粱等众多植物中具有同源基因，dlz基因不仅可用于水稻，也可用于其它植物的新品种培育。

附图说明

图1是野生型黄华占(hhz)和大粒突变体(dlz)的植株形态，bar＝20cm。

图2是黄华占(hhz)和大粒突变体(dlz)的种子(a)和米粒(b)形态，bar＝1cm。

图3是大粒突变体(dlz)与黄华占(hhz)杂交f2代分离群体的千粒重。

图4是simm方法定位大粒突变体(dlz)的突变位点，其中红色三角标示突变位点所在位置，黑色字母表示野生型的碱基，红色字母表示突变体的碱基。

图5是大粒突变体(dlz)与黄华占(hhz)杂交f2代分离群体中三个候选基因间的重组单株与部分非重组单株的粒宽与千粒重，其中w表示野生型，h表示杂合突变型，m表示纯合突变型。

图6是dlz基因在野生型黄华占不同组织器官中的表达量。dap1表示受精后1天。

图7是利用crispr技术定点敲除粳稻中花11(zh11)和籼稻黄华占(hhz)的dlz基因产生的序列变异(a)和相应的转基因植株种子大小(b)，其中红色字母表示插入的碱基，红色“-”表示缺失的碱基；z系列编号表示粳稻中花11背景的转基因植株，h系列编号表示黄华占背景的转基因植株。

图8是野生型黄华占(w)、杂合突变体(h)与dlz纯合突变体(m)的各种重要农艺性状表型及单株产量比较，其中a、b、c不同字母表示数据经t测验具有显著差异，相同字母表示差异不显著。

图9是利用rnai技术将粳稻中花11的dlz进行基因沉默产生的转基因植株的dlz基因表达水平及其粒宽表型，其中灰色柱子表示转基因阴性植株。

图10是利用crispr技术编辑粳稻中花11的dlz基因启动子产生的转基因植株的dlz基因表达水平、启动子片段缺失情况以及粒宽表型，其中灰色柱子表示表达量变化与粒宽表型变化不明显的单株。

图11是不同植物的同源dlz蛋白的同源性比较，其中brachypodiumdi表示二穗短柄草，hordeumvulgare表示大麦，oryzasativa表示水稻，oryzabrachyant表示野生稻，panicumhallii表示黍，setariaitalica表示谷子，zeamays表示玉米，sorghumbicolor表示高粱。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、水稻大粒突变体(dlz)的筛选

采用含0.7％质量浓度的ems水溶液浸泡籼稻黄华占种子(m0)，诱变处理12小时，将m0代种子植株结实后混收，获得突变体库(m1)。来自m1代种子的植株在种子成熟期用于筛选，通过表型观察，获得植株发育正常、种子明显变大的植株(图1，图2a)。突变体种子变大主要是由于粒宽的增加，并且颖壳体积增大后籽粒充实度不受影响，因此米粒的宽度也显著增大(图2b)，故千粒重增加。

实施例2、水稻大粒突变体(dlz)的遗传分析

将dlz突变体与野生型黄华占杂交，获得f1代杂交种，再取f1植株的种子种植f2分离群体，种子完熟后收种、完全干燥，并进行千粒重的测量。野生型黄华占的平均千粒重为21克左右，而f2群体的考种结果表明，大粒的单株在群体中占少数(图3)。由于千粒重是数量性状，其大小在群体中呈连续分布，以23克为分界点，千粒重大于23克的定为大粒性状，小于或等于23克的定为正常性状，则f2-1和f2-2两个群体的正常性状与大粒性状的分离比符合3:1(χ²＝1.44<χ²(0.05,df＝1)＝3.84)，表明突变体的大粒性状是由一个隐性核基因突变产生的。

实施例3、水稻大粒突变体dlz基因的克隆

突变体的基因克隆采取simm方法，即利用突变体与原野生亲本杂交构建f2代群体，通过重测序进行基因定位的方法。具体地，将dlz突变体与野生型黄华占杂交，从f2群体中选取30个极端表型(千粒重25克以上)的突变体植株，分别提取叶片的基因组dna并等量混合，按照illuminahiseq2000测序平台测序建库标准流程进行建库，并通过pe101重测序。测序数据应用simm方法分析定位突变位点，最终定位到水稻第12号染色体末端的一个450kb区间，其中包括四个单碱基突变，分别位于loc_os12g41220、loc_os12g41820和loc_os12g41910基因的编码区，且loc_os12g41820基因有两个相邻碱基均发生了突变(图4)。

另取三个f1单株的种子种植f2群体，每个群体种植约600至800个单株，共计种植2100株。利用hrm法鉴定上述每个单株的三个突变位点的基因型，并从中筛选出80个重组单株，考查了重组单株与非重组单株的粒宽和千粒重。结果发现，在非重组单株中，杂合型的千粒重介于野生型和突变型之间，表明dlz基因具有半显性效应：当loc_os12g41820和loc_os12g41910两个位点都是杂合型时，loc_os12g41220位点的野生型与突变型之间的千粒重并无差异；当loc_os12g41220和loc_os12g41820两个位点都是杂合型时，loc_os12g41910位点的野生型与突变型之间的千粒重也无差异；只有loc_os12g41820位点的野生型与杂合型、突变型之间的千粒重差异显著，并且该差异趋势与非重组单株相同(图5)。实验结果表明loc_os12g41820即为dlz基因。

在野生型黄华占(籼稻)中，dlz基因的基因组dna全长6146bp，序列如seqidno：1所示。该基因有9个外显子，分别在seqidno：1的第831至1151位、第1502至1541位、第2298至2427位、第2569至3056位、第3148至3228位、第3364至3462位、第3643至3756位、第3840至3911位、第4498至4566位核苷酸。该基因编码区(cds)全长1635bp，序列如seqidno：2所示，其cds编码1个含有544个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：3所示。在本发明所提供的水稻大粒突变体(dlz)中，dlz基因的第4个外显子上发生两个碱基的突变，具体为seqidno：2的第961、962、963位碱基从aaa突变为tta(见seqidno：4)，从而导致seqidno：3的第321位氨基酸由赖氨酸(lys)突变为亮氨酸(leu)(见seqidno：5)。将粳稻品种日本晴(典型粳稻基因组供体)与籼稻品种黄华占相比发现，dlz基因的核苷酸序列(见seqidno：20)差异主要存在于非编码区，编码区仅在第6个外显子上存在一个snp位点，具体为在seqidno：2的第1170位碱基位置上，黄华占是g，日本晴是a，该snp位点位于seqidno：3的第390位lys的密码子第三位(见seqidno：21)，但并不改变所编码的氨基酸(见seqidno：3)，说明dlz基因在粳稻和籼稻之间差异较小。

实施例4、dlz基因在水稻各组织器官中的表达模式分析

根据dlz基因的cdna序列设计引物，上游引物为820qf：5’-agtccaggcgtatacagtgc-3’(seqidno：6)，下游引物为820qr：5’-tcagagcaatcctgacacca-3’(seqidno：7)。同时以水稻ubiquitin基因为内参设计引物，上游引物为ubqf：5’-caaccagctgaggcccaagaa-3’(seqidno：8)，下游引物为ubqr：5’-ccagggagataacaacggaagc-3’(seqidno：9)。分别提取野生型黄华占的根、茎、叶、分蘖芽、外稃、内稃、雌蕊、花药、不同长度的幼穗、受精后1至7天的种子等组织的总rna并合成cdna模板，采取实时荧光定量pcr的方法分析dlz基因的表达水平。结果如图6所示，该基因在所检测的各个组织器官中都有较高表达，表达量差异不大。

实施例5、定点敲除籼稻和粳稻的dlz基因

在dlz基因的第1个外显子上选择第1个crispr定点诱变的靶位点序列target1：5’-ccttcctggtcgaccggcattgg-3’(seqidno：10)，在第3个外显子上选择第2个crispr定点诱变的靶位点序列target2：5’-gctgttcgtgttggatcgcttgg-3’(seqidno：11)。合成带有粘性末端的接头引物u3-target1-linkerf：5’-ggcaccttcctggtcgaccggcat-3’(seqidno：12)，u3-target1-linkerr：5’-aaacatgccggtcgaccaggaagg-3’(seqidno：13)，u6a-target2-linkerf：5’-gccgctgttcgtgttggatcgct-3’(seqidno：14)，u6a-target2-linkerr：5’-aaacagcgatccaacacgaacag-3’(seqidno：15)。将两对接头引物分别用ddh2o溶解成10μm工作液，f引物和r引物各取10μl加入到80μlddh2o中混合稀释到1μm，于90℃处理30s，移至室温冷却完成退火。再用t4dnaligase分别连入经bsai酶切线性化的pylsgrna-u3或pylsgrna-u6a质粒，得到微量的u3::target1-grna和u6a::target2-grna表达盒。将上述表达盒作为模板，经过两轮pcr扩增并加上bsai酶切位点，连入经bsai酶切线性化的pylcrispr/cas9-mh(b)终载体，最终得到pubi::cas9-u3::target1-grna-u6a::target2-grna表达盒。pcr模板与引物组合如表1所示，通用引物序列如表2所示，阳性克隆的鉴定分别用sp-l和u3-target1-linkerr、u3-target1-linkerf和u6a-target2-linkerr、u6a-target2-linkerf和sp-r等三对引物进行菌液pcr检测，sp-l引物用于u3-target1的测序，sp-r用于u6a-target2的测序。

将pubi::cas9-u3::target1-grna-u6a::target2-grna表达盒通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法分别转入粳稻品种中花11和黄华占种子诱导产生的愈伤组织中，经过潮霉素筛选和抗性愈伤组织的分化再生得到转基因植株。利用ctab法抽提上述植株叶片的基因组dna，并用引物对u3-target1-linkerf和u6a-target2-linkerr做转基因植株t-dna插入阳性检测分析，阳性植株可扩增出600bp左右的条带。将阳性植株的基因组dna再用引物对820-target1-f：5’-ctgacatgggcgcacatg-3’(seqidno：16)和820-target2-r：5’-cctcgtatccttgcagcaactt-3’(seqidno：17)扩增出包含两个靶位点的约1.84kb的dna区段，再利用引物对820-t1-seq：5’-ggtgatgcacacgaagaagc-3’(seqidno：18)和820-t2-seq：5’-tccctagttgcatccgtttg-3’(seqidno：19)分别对target1和target2进行测序。测序结果如图7a所示，在两个靶位点上都发生了不同的碱基插入或缺失，进而改变了dlz基因的读码框，并且两条染色体都发生了突变，因此表明产生的阳性植株是dlz基因功能丧失的突变体，其粒宽也比野生型中花11或黄华占大大增加(图7b)，证明定点敲除粳稻和籼稻的dlz基因均导致种子大小的显著增加。

实施例6、dlz突变基因在杂合状态下具有显著增产效应

如图8所示，大粒突变体(dlz)的粒宽变大和千粒重增加，株高与野生型黄华占相比有所下降，但茎秆更粗壮，穗数减少，穗长变短，每穗颖花数也显著减少，综合以上特点，纯合突变体产量下降。大粒突变基因在杂合状态下株高、穗数、穗长和每穗颖花数都与野生型黄华占相似，没有显著差异，而杂合株的粒宽与千粒重均高于野生型黄华占而低于纯合突变体，茎秆也比野生型材料粗壮，单株产量比野生型黄华占显著增加，表明大粒突变基因在杂合状态下具有增加水稻产量的潜力，可应用于杂交稻生产。

实施例7、抑制dlz基因的表达水平可增加水稻粒宽

以dlz基因为基础，分别设计引物

rnai-spei-1f：

5’-cacgtggaccactagtatgtggatgtatggctatttctgga-3’(seqidno：22)，

rnai-spei-1r：

5’-gtccgtaccaactagttcgtatccttgcagcaacttattca-3’(seqidno：23)，

rnai-bamhi-2f：

5’-tgaattcgctggatcctcgtatccttgcagcaacttattca-3’(seqidno：24)，

rnai-bamhi-2r：

5’-gtcgactggaggatccatgtggatgtatggctatttctgga-3’(seqidno：25)。

以dlz基因的cdna为模板，分别扩增出214bp的片段，通过in-fusion方法正反向分别连接于表达载体ubi-intron的酶切位点spei和bamhi上，构建成rnai载体。将该载体通过农杆菌介导的水稻遗传转化法转入粳稻中花11中，对所得的t0代转基因植株进行表达量分析。结果如图9所示，转基因阳性植株的内源dlz基因表达水平受到了显著的抑制，并且粒宽也显著增大，表明抑制dlz基因的表达水平可增加水稻粒宽，且粒宽的大小与dlz基因的表达水平呈正相关。

实施例8、通过启动子编辑实现对dlz基因表达水平的精细调控

在dlz基因翻译起始位点atg上游2087bp的启动子区(seqidno：26)设置8个crispr靶位点，分别为tp1：5’-tttgacagcttcctgatctt-3’(seqidno：27)，tp2：5’-caagtaagatgccaagaatg-3’(seqidno：28)，tp3：5’-ttgtcaacgggagaacaac-3’(seqidno：29)，tp4：5’-taggatatttgagctacgg-3’(seqidno：30)，tp5：5’-tagaaagaagtctggagca-3’(seqidno：31)，tp6：5’-aacgccagcttgagggcag-3’(seqidno：32)，tp7：5’-ttctcgtcgtttcttgcgtg-3’(seqidno：33)，tp8：5’-gtgtgtgggttgaccgaat-3’(seqidno：34)。分别合成带有粘性末端的接头引物，如表3所示，按照实施例5的方法构建pubi::cas9-u3::tp3-grna-u3::tp6-grna-u6a::tp1-grna-u6a::tp2-grna-u6b::tp4-grna-u6b::tp5-grna-u6c::tp7-grna-u6c::tp8-grna表达盒，pcr模板与引物组合如表1所示，通用引物序列如表2所示，最后通过农杆菌介导的水稻遗传转化法转入粳稻中花11中。用引物820pro-2087bp-f：5’-ggaaaggaagaaaaggctaatatgctcatc-3’(seqidno：51)和820pro-2087bp-r：5’-atgtcaggatgtgcttctgggacac-3’(seqidno：52)扩增t0代转基因植株的dlz基因2087bp启动子区，电泳结果如图10所示，很多转基因植株的扩增产物明显小于2087bp，表明这些植株中的dlz基因启动子区发生了不同程度的片段缺失。将扩增产物连入peasy-blunt载体，用m13f和m13r通用引物测序，部分植株的启动子测序结果如seqidno：53(8-5号单株)，seqidno：54(8-9号单株)所示。其中8-5号单株在tp2和tp5之间发生了750bp左右的缺失；8-9号单株在tp2和tp8之间发生了大片段的缺失，并倒置插入了tp5和tp6之间350bp左右的片段。这些结果表明启动子编辑可以产生丰富的序列变异。

进一步检测转基因植株的dlz基因表达水平变化，结果如图10所示，少数植株的dlz基因表达水平被抑制到与rnai基因沉默的效果相当(如8-22号单株)，大部分植株的dlz基因表达水平下降了一半左右。考察转基因植株的粒宽表型，发现dlz基因表达水平受抑制程度越高，粒宽越大，表达水平下降一半左右的植株，其粒宽的大小介于野生型与基因敲除植株之间，即与dlz杂合突变体的表型相当，表明通过启动子编辑技术可以实现对dlz基因表达水平的精细调控，实现增产的效果。

实施例9、不同作物中的同源基因分析

将dlz基因编码的蛋白质序列输入ncbi数据库中进行blastp搜索，获得了二穗短柄草(brachypodiumdistachyon)(seqidno：55)、大麦(hordeumvulgare)(seqidno：56)、野生稻(oryzabrachyantha)(seqidno：57)、黍(panicumhallii)(seqidno：58)、谷子(setariaitalica)(seqidno：59)、玉米(zeamays)(seqidno：60)、高粱(sorghumbicolor)(seqidno：61)等作物基因组中预测的同源蛋白。将水稻dlz蛋白与这些同源蛋白的氨基酸序列输入clustalw2网站(https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)进行序列比对，结果显示来自不同植物的同源蛋白都具有非常相似的保守序列，彼此之间同源性很高(图11)，表明dlz蛋白在不同植物的种子发育中功能保守，起着非常重要的作用。

利用crispr/cas9技术分别对上述7个作物的dlz基因进行突变，对获得的转基因阳性植株进行种子颗粒大小的性状观察，结果显示转基因阳性植株是dlz基因功能丧失的突变体，dlz基因无法正常表达，其种子粒宽也较相应作物的野生型大大增加，并呈现粒大穗多性状，证明定点突变不同物种dlz的同源基因均导致种子大小的显著增加。

表1crispr载体构建中扩增grna表达盒的模板引物组合

表2crispr载体构建中扩增grna表达盒的通用引物序列

表3启动子编辑crispr载体构建中扩增grna表达盒的靶点特异引物序列

序列表

<110>深圳市作物分子设计育种研究院

未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司

<120>调控植物种子大小的基因及其应用

<150>201910051525.0

<151>2019-01-21

<160>61

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6146

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>1

cactgcccaattgcccatgctccagacttctttctactcctacattccacatatctccat60

ggacagtaactcctcccaagctaccacttcaaccctaatcccctctctctctcttccgca120

gaggtagagtgagagagatggtcagatagctagattgatatccctctctctctctcacag180

acatctctttttgcaagatctcttcttgttcatcatcttcttctttttttctcccccttt240

tgcttcaccaatccatcttttgtcacgagatgtgaccgagctgaagctagtagtagtgga300

gcagcgaaagcaagtacgccaagaaaaaaaaaaggaagaagaaagaagaaagaaagaaag360

aaaaaaacgccagcttgagggcagagggcaaaagcggcgacgaggagcagtggccaaagc420

tcagattcttcccgtgggctatttttaccacccgcatcccctctctttgagccccttggc480

cgattcattcaccgacgcaaagatccaacccctcttcaggtgtcggcagatgccgccttt540

gtgaggtttccagtggggggatttctcgtcgtttcttgcgtgcggttgcgttcttgatcc600

agtgagcgcacggatatatccgccctggtttagtagagagagagagagagagagagagag660

agagagagagagagagagagagagggggttcttgattgagttccaagtgttggattgggt720

tcttggagctgttggattgggtttttttgggagagagatgggggtttggaggtgtgtggg780

ttgaccgaattggatcaagattattgcgggaggggggggggggggttgcaatggcggatt840

tggggctgtggaagcaagggtggaggtgggtggtgtcccagaagcacatcctgacatggg900

cgcacatggcggcgagcggcggcaccgagaggctggccttcctggtcgaccggcattggc960

ccgccgtgtcccgggcctgcgtgagctccggccgcctcgcgctcgccgcgctgcggcaat1020

ggcgcggctgcgcggcgcgcgggatcctggagatggctagcctgggccctgcgtccgtgt1080

tcgtcatcctctggagcttcttcgtgtgcatcacctcgccggcgtgcgccctctacgcgc1140

tcctgggcatggtacggcatgcaagtcttgcttgctttgcgctttcgccttgatgatgta1200

gtggattatggataacgatttgtgcgcgttctaaatcttgtcatgtgctcgtctttcttt1260

ttttcttctttttatcaagggtggattgcatgttaggttacctttcttttcgaaaagtat1320

agttaaagtggtaattggtggtacaaaagtagtatgtcattacactttcatgagattgat1380

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gctaatgtgtttcttgctgagtggttcagtttcaggttcattagcagattatcttattgg1680

ttgatttatgtcaaaatacttaaggtcaattcgtagtttgcacagtgtacttcaataaca1740

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gtatgagtttctccctttgggataccacctgtgttcagtggaatgtcaggtagtatctga2040

ccttttcagctagattgcactggataaattatactgaaataagcaataggaatgaattcc2100

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cacttgtttttactgtcatctggcatacttgttcagttagtaacttctacttgcgagtaa2220

ggatgcaagatttcccatgtaagatggatactataaatatcattttgtctaattgcttaa2280

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gtcttttcattgtaggattatttggaatattgattatgtggatgtatggctatttctgga2400

ttacaggaatgcttctgattgctggaggtttgttttatcttaatatttaagtctgttcat2460

aatgataattttgtgtttttgtttgtcaaatccataaatttttcttcctccctagttgca2520

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atcttctgaataagttgctgcaaggatacgagggaagcacagaagaaagacagtttgaag2760

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ttcctcggaatagaagtattgatcaaaagattctgaaaaaggagtaccacagaatggtaa3060

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<210>2

<211>1635

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>2

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210215220

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245250255

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260265270

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290295300

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