一种原位培养装置及高通量分离和筛选微生物的方法与流程

本发明涉及一种原位培养装置及高通量分离和筛选微生物的方法，特别涉及一种高通量原位分离功能微生物的装置。

背景技术：

微生物在自然界几乎无处不在，并在我们生活的环境中占据着重要的位置。然而由于目前技术手段的限制，自然界中只有极少部分微生物能够得到分离与培养，严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种原位培养装置及高通量分离和筛选微生物的方法，能够快速、高效地分离环境中的微生物，能够用于微生物的基础研究及应用研究。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，一种原位培养装置，其特征在于，它包括原位分菌装置，所述原位分菌装置包括：

真空底盘，其上部形成有真空槽，下部设置与所述真空槽连通的圆柱环；

夹具下层，紧固连接在所述真空底盘的顶部，所述夹具下层的底板上形成有与所述真空槽连通的通孔；

芯片，放置在所述夹具下层的所述底板上，所述芯片上均匀开设有多个培养通孔；

夹具压片，压置在所述芯片上，所述夹具压片上开设有与所述芯片上的多个所述培养通孔一一对应的多个加样孔；

夹具上层，固定设置在所述夹具下层的上方，所述夹具上层上开设有加样窗口。

优选地，所述夹具下层的侧板的底部开设有槽口；在所述夹具下层和所述夹具压片之间且位于所述槽口的对侧活动插置一推片，所述推片用于将完成加样后的所述芯片推出所述槽口的外部。

优选地，还包括与加样后的所述芯片配合使用的微生物培养装置，所述微生物培养装置包括芯片上盖板和芯片上盖板；所述芯片上盖板和芯片上盖板紧贴于加样后的所述芯片的上下表面，并与所述芯片紧固连接；在所述芯片上盖板和加样后的所述芯片以及加样后的所述芯片和所述芯片下盖板之间分别设置无菌水系滤膜；所述芯片上盖板和芯片下盖板呈镜像对称结构，均包括与所述芯片表面紧贴的板体，所述板体的背面上形成有与所述芯片形状相适应的凹槽，所述凹槽的底部形成有与所述芯片上的多个培养通孔一一对应的多个通孔。

优选地，还包括微生物提取装置，所述微生物提取装置包括底座，可拆卸地安装在所述底座上的培养孔板，以及用于将原位环境培养后的所述芯片上的多个所述培养通孔内的微生物转移至培养孔板内的顶针；所述培养孔板上的培养孔数为所述芯片上的所述培养通孔个数的整数倍。

优选地，所述顶针包括顶板，均布于所述顶板的底面上的多个针体，以及固定设置在所述顶板的顶面上的手持部；多个所述针体在所述顶板上的分布和多个所述培养通孔在所述芯片上的分布相同，所述针体的外轮廓和所述培养通孔的内轮廓相适应。

优选地，在所述底板上且位于所述槽口的对侧设置导向架，所述导向架呈十字形结构，其包括固定设置在所述底板上的竖板，平行分布于所述底板上方并固定在所述竖板上的横板，所述推片设置在所述横板和所述底板之间，在所述推片上开设与所述横板以及所述底板之间的竖板配合的u型槽，使得所述推片定向滑动连接在所述导向架上。

优选地，在所述夹具下层的底板的纵向两侧间隔设置多个中空的连接柱，在所述真空底盘、夹具下层的底板以及夹具上层上开设与所述连接柱的内孔配合的通孔；所述夹具压片上开设供多个所述连接柱对应穿过的多个通孔，以使所述夹具压片上下活动地设置在所述夹具下层和夹具上层之间。

优选地，所述真空底盘上的所述真空槽的外轮廓大于所述芯片上的多个所述培养通孔的外轮廓，所述夹具下层的所述底板上开设有与所述芯片上的培养通孔一一对应的圆形通孔；所述槽口的横截面大于所述芯片的截面；在所述夹具压片的顶面形成与所述芯片的形状相适应的凹槽，多个所述加样孔均匀布设在所述凹槽的底部。

优选地，所述无菌水系滤膜上的孔径为0.22um。

本发明还提供了一种基于上述原位培养装置的高通量分离和筛选微生物的方法，其包括以下步骤：

s1：进行样品稀释处理，获得满足分菌处理的样品溶液

选取目标环境中的样品，将样品进行初步稀释，然后将初步稀释后的样品与灭菌后的琼脂溶液混合继续进行稀释，使得最终获得的样品溶液中的微生物浓度达到每微升1个细胞；

s2：将步骤s1中样品溶液加入原位分菌装置内，进行微生物的分离；

s3：将完成步骤s2的原位分菌装置内的芯片取出，并放置在微生物培养装置内，然后将微生物培养装置放在原位环境中7～14天；

s4：将完成步骤s3中的原位环境培养的芯片取出，并固定在微生物提取装置上，事先在培养孔板上的培养孔内放置有特定碳源，通过顶针将芯片上的培养通孔内的样品顶出，样品落入对应下方的培养孔板上的培养孔内，然后培养1～2天；

s5：利用酶标仪测定od600的数值或通过肉眼观察培养孔内溶液的浑浊度，od600的数值有提高或者溶液变浑浊，说明分离出可以利用特定碳源的功能微生物，完成微生物的筛选。

本发明采用以上技术方案，其具有如下优点：本发明包括真空底盘、夹具下层、夹具压片以及夹具上层，芯片放置在在夹具下层的底板上，夹具压片压置在芯片上，通过夹具上层、夹具压片向芯片加样，样品分布于芯片的上层，通过对真空底盘的真空槽作抽真空处理，在芯片上下层形成压差，使得样品均匀分布于芯片上的培养通孔内，实现环境中的微生物快速、高效地分离，有利于微生物的的基础研究及应用研究。

附图说明

图1是本发明的整体结构示意图；

图2是本发明的俯视结构示意图；

图3是本发明的左视结构示意图；

图4是本发明的右视结构示意图；

图5是本发明真空底盘的结构示意图；

图6是本发明真空底盘另一视角下的结构示意图；

图7是本发明夹具下层的结构示意图；

图8是本发明夹具下层另一视角下的结构示意图；

图9是本发明夹具压片的结构示意图；

图10是本发明夹具压片另一视角下的结构示意图；

图11是本发明夹具上层的结构示意图；

图12是本发明芯片的结构示意图；

图13是本发明推片的结构示意图；

图14是本发明芯片上盖板的结构示意图；

图15是本发明芯片下盖板的结构示意图；

图16是本发明底座的结构示意图；

图17是本发明顶针的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

如图1～6、图11、图12所示，本发明提供了一种原位培养装置，它包括原位分菌装置，原位分菌装置包括：

真空底盘1，其上部形成有真空槽11，下部设置与真空槽11连通的圆柱环12；

夹具下层2，紧固连接在真空底盘1的顶部，夹具下层2的底板21上形成有与真空槽11连通的通孔22；

芯片3，放置在夹具下层2的底板21上，芯片3上均匀开设有多个培养通孔31；

夹具压片4，压置在芯片3上，夹具压片4上开设有与芯片3上的多个培养通孔31一一对应的多个加样孔41；

夹具上层5，固定设置在夹具下层2的上方，夹具上层5上开设有加样窗口51；

在使用时，将稀释处理后的样品通过加样窗口51以及夹具压片4上的加样孔41加入到芯片3的上层，然后，控制真空底盘1下部的圆柱环12与抽真空装置(如注射器)连接，对真空底盘1上部的真空槽11作抽真空处理，使得位于芯片3上层的样品则进入到芯片3上的培养通孔31内，完成高通量分菌处理。

在上述实施例中，优选的，如图3、图7所示，夹具下层2的侧板23的底部开设有槽口24；在夹具下层2和夹具压片4之间且位于槽口24的对侧活动插置一推片6，用于将完成加样后的芯片3推出槽口24外部。

在上述实施例中，优选的，夹具压片4上下活动地设置在夹具下层2和夹具上层5之间，这样，可在夹具压片4和夹具下层2之间叠放多个芯片3，大大提高装置的处理通量。

在上述实施例中，优选的，如图7、图13所示，在底板21上且位于槽口24的对侧设置导向架25，导向架25呈十字形结构，其包括固定设置在底板21上的竖板251，平行分布于底板21上方并固定在竖板251上的横板252，横板252的底面到底板21顶面之间的距离略大于芯片3的厚度，推片6设置在横板252和底板21之间，在推片6上开设与横板252和底板21之间的竖板251配合的u型槽61，使得推片6定向滑动连接在导向架25上。向槽口24方向推动推片6时，由于导向架25的定向限位作用，能够保证推片6定向推动芯片3自槽口24穿出。

在上述实施例中，优选的，如图5、图8所示，真空底盘1上的真空槽11的外轮廓大于芯片3上的多个培养通孔31的外轮廓，夹具下层2的底板21上开设有与芯片3上的培养通孔31一一对应的圆形通孔，这样，能够保证芯片3下部各处的压力相等，当芯片3的上下层形成形成压差时，位于芯片3上部的样品能够同时均布地进入多个培养通孔31内。

在上述实施例中，优选的，如图7、图9、图10所示，在夹具下层2的底板21的纵向两侧间隔设置多个中空的连接柱26，在真空底盘1、夹具下层2的底板21以及夹具上层5上开设与连接柱26的内孔配合的通孔，以方便真空底盘1、夹具下层2以及夹具上层5的连接，夹具压片4上开设供多个连接柱26对应穿过的多个通孔42，进而使得夹具夹片4沿连接柱26上下滑动地设置在夹具下层2和夹具上层5之间。

在上述实施例中，优选的，槽口24的横截面略大于芯片3的截面，这样每一仅供单个芯片3穿过。

在上述实施例中，优选的，如图9所示，在夹具压片4的顶面形成与芯片3的形状相适应的凹槽43，多个加样孔41均匀布设在凹槽43的底部。

在上述实施例中，优选的，如图14、图15所示，原位培养装置还包括与加样后的芯片3配合使用的微生物培养装置，微生物培养装置包括芯片上盖板7和芯片上盖板8；芯片上盖板7和芯片上盖板8紧贴于加样后的芯片3的上下表面，并与芯片3紧固连接，在芯片上盖板7和加样后的芯片3以及加样后的芯片3和芯片下盖板8之间分别设置无菌水系滤膜(图中未示出)；芯片上盖板7和芯片下盖板8呈镜像对称结构，均包括与芯片3表面紧贴的板体100，板体100的背面上形成有与芯片3形状相适应的凹槽110，凹槽110的底部形成有与芯片3上的多个培养通孔31一一对应的多个通孔120。自然界中的营养物质和天然生长因子能够通过芯片上盖板7、芯片下盖板8以及无菌水系滤膜进入加样后的芯片3内，为芯片3上的培养孔内的微生物提供生长所必须的物质，无菌水系滤膜将其他杂菌阻隔在芯片3的外部，实现对样品中分离出的微生物进行原位环境下的培养。

在上述实施例中，优选的，如图16、图17所示，本发明还包括与在原位环境下培养后的芯片3配合使用的微生物提取装置，微生物提取装置包括底座9，可拆卸地安装在底座9上的培养孔板(图中未示出)，以及用于将芯片3上的多个培养通孔31内的微生物转移至培养孔板内的顶针13。使用时，将在原位环境中培养后的芯片3对应放置在培养孔板上，芯片3上的多个培养通孔31和培养孔板上的培养孔一一对应，顶针13自上而下插入芯片3上的培养通孔31内，将微生物推出培养通孔31的外部，并落入对应下方的培养孔内。

在上述实施例中，优选的，如图17所示，顶针13包括顶板131，均布于顶板131的底面上的多个针体132，以及固定设置在顶板131的顶面上的手持部133；多个针体132在顶板131上的分布和多个培养通孔31在芯片3上的分布相同，针体132的外轮廓和培养通孔31的内轮廓相适应；使用时，多个针体132同步且对应地插入芯片3上的多个培养通孔31内，将多个培养通孔31内的微生物同时推出培养通孔31的外部，并同时落入对应下方培养孔板上的多个培养孔内。

在上述实施例中，优选的，培养孔板上的培养孔数为芯片3上的培养通孔31个数的整数倍(至少为1倍)。

在上述实施例中，优选的，培养孔板可采用96孔板或384孔板。

在上述实施例中，优选的，无菌水系滤膜上的孔径为0.22um。

基于上述的一种原位培养装置，本发明还提供一种高通量分离和筛选微生物的方法，其包括以下步骤：

s1：进行样品稀释处理，获得满足分菌处理的样品溶液

选取目标环境中的样品，将样品进行初步稀释，然后将初步稀释后的样品与灭菌后的琼脂溶液(温度在55度左右)混合继续进行稀释，使得最终获得的样品溶液中的微生物浓度达到每微升1个细胞。

s2：将步骤s1中样品溶液加入原位分菌装置内，进行微生物的分离

将样品溶液自夹具上层5上的加样窗口51加到夹具压片4的多个加样孔41内，由于重力作用，样品溶液穿过多个加样孔41均匀分布于芯片3的上层；将真空底盘1下部的圆柱环12与外部抽真空装置连接，抽真空装置对真空底盘1上的真空槽11进行抽真空处理，在芯片3的上层和下层之间形成压差，使得位于芯片3上层的样品溶液进入芯片3上的多个培养通孔31内，完成微生物的分离。

s3：将完成步骤s2的原位分菌装置内的芯片3取出，并放置在微生物培养装置内，然后将微生物培养装置放在原位环境中7～14天；

将芯片3与芯片上盖板7、芯片下盖板8以及无菌水系滤膜组装在一起，形成微生物培养装置，放置在原位环境中进行7～14天的培养；

s4：将完成步骤s3中的原位环境培养的芯片3取出，并固定在微生物提取装置上，事先在培养孔板上的培养孔内放置有特定碳源，通过顶针13将芯片3上的培养通孔31内的样品顶出，样品落入对应下方的培养孔板上的培养孔内，然后培养1～2天；

s5：利用酶标仪测定od600的数值或通过肉眼观察培养孔内溶液的浑浊度，od600的数值有提高或者溶液变浑浊，说明分离出可以利用特定碳源的功能微生物，完成微生物的筛选。

进一步地，可利用菌液pcr或者其他技术手段对筛选出的微生物进行后续的研究与应用。

下面以应用实例对本发明的原位培养装置以及高通量分离和筛选微生物的方法作以说明：

选取新疆油田某区块的采出液，首先通过血球计数板对采出液进行计数，然后将采出液和灭好菌的琼脂溶液进行混合稀释，使得最终溶液微生物浓度达到每微升1个细胞。然后按照上文的方法进行微生物的分离和筛选，其中分离出的微生物进行7d培养，培养1周后通过顶针13将芯片3上的培养通孔31内的微生物加入到以十六烷为唯一碳源的96孔板进行培养，然后对分离出来的微生物直接进行菌液高通量pcr鉴定，

同时，利用传统的稀释涂布平板法对采出液进行分离。

通过试验，得到下表的结果：

本发明仅以上述实施例进行说明，各部件的结构、设置位置及其连接都是可以有所变化的。在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进或等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。