副血链球菌F278及其用途的制作方法

副血链球菌f278及其用途
技术领域
[0001]
本发明涉及一种生物工程菌，特别是涉及一种副血链球菌f278及其用途。


背景技术：

[0002]
人母乳不仅为新生儿提供营养，还提供人体共生细菌，已有研究表明健康母亲的乳汁中含有 102–
105cfu/毫升的细菌。按照每个纯母乳喂养的婴儿平均每天进食800毫升母乳计算，母乳每天 给他们提供104–
108个细菌细胞。母乳中的细菌在出生后立刻定植在新生儿肠道中，是新生儿肠道 的“先锋菌群”，在新生儿的免疫系统发育中起到关键作用。
[0003]
已有的研究主要集中在从母乳中分离双歧杆菌(bifidobacterium)和乳杆菌(lactobacillus)，并 研究这些传统益生菌的免疫调节作用。但是，并不是所有母乳中都含有活的、可以分离到培养物的 双歧杆菌和乳酸杆菌，对更、大规模人群的母乳菌群结构的研究表明，母乳中丰度最高、而且在不 同人的母乳中都能检测到的细菌是链球菌(streptococcus)。jost等人采集了7个母亲的新鲜乳汁， 只从其中2个母亲的乳汁中分离得到了双歧杆菌，只从1个母亲的乳汁中分离得到了乳酸杆菌，但从 7个母亲的乳汁中都分离得到了链球菌；而且，文献表明在从人母乳中分离得到的细菌中，双歧杆 菌只占到1.7％，而链球菌占到17.9％。此外，链球菌也是出生后2周内新生儿肠道中的优势细菌。这 些结果说明，母乳链球菌是多数母亲通过乳汁传递给后代的人体共生细菌，具有重要的益生作用。 因此，提供人母乳中链球菌的益生菌制剂十分有必要。


技术实现要素：

[0004]
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种副血链球菌f278及其用途， 用于解决现有技术中部分母乳、母乳替代物、婴儿配方奶、乳制品或者相关产品中缺乏链球 菌的问题。
[0005]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种副血链球菌f278，其保藏号为cgmcc no.17578。
[0006]
本发明中副血链球菌f278为发明人采集的人母乳灌胃给在无菌包中生长的8周龄无菌小 鼠，隔天用同样的母乳给每只小鼠进行二次灌胃。灌胃结束后继续在无菌包中饲养小鼠8周。 用第8周的小鼠粪便进行细菌分离获得。
[0007]
经16s rrna基因扩增序列发育树分析，确定该菌株为副血链球菌，按照国际命名规则： 属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为链球菌属、副血链球菌种和f278， 命名为副血链球菌f278，该菌株于2019年4月28送至中国微生物保藏管理委员会普通微生 物中心保藏，保藏号为：cgmcc no.17578。
[0008]
进一步地，所述副血链球菌f278的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0009]
本发明的另一方面提供了上述副血链球菌f278在制备食品、保健品或药品中的用途。
[0010]
进一步地，所述食品或保健品可以专门针对婴幼儿，例如可以是益生菌制剂、婴幼
儿配 方奶粉、或液体饮料，如乳制品等。
[0011]
进一步地，上述副血链球菌f278可以是活的，也可以杀死后的。
[0012]
本发明的另一方面提供了一种食品、保健品或者药品，所述食品、保健品或者药品中含 有副血链球菌f278或副血链球菌f278裂解物。
[0013]
进一步地，所述食品、保健品可以专门针对婴幼儿，所述食品、保健品可以是益生菌制 剂、婴幼儿配方奶粉、或者液体饮料，如乳制品等婴幼儿食品，例如可以是液体饮料，如乳 制品等。
[0014]
进一步地，上述副血链球菌f278可以是活的，也可以杀死后的。
[0015]
进一步地，所述食品中副血链球菌f278的含量为102cfu/ml-10
10
cfu/ml
[0016]
进一步地，所述食品、保健品或者药品具有促进哺乳动物发育、激活哺乳动物免疫功能 和/或提高哺乳动物免疫力的作用。
[0017]
进一步地，所述食品、保健品或者药品具有促进哺乳动物外周血单核细胞分泌白细胞介 素(il)-12和白细胞介素(il)-10的作用。
[0018]
如上所述，本发明的副血链球菌f278及其用途，具有以下有益效果：
[0019]
采用本申请中的副血链球菌f278，可以作为益生菌制剂，食品添加剂，或者药物的有效 成份，尤其是针对婴幼儿母乳、母乳替代物、婴儿配方奶、乳制品或者相关产品中缺乏链球 菌的情况。副血链球菌f278安全有效。实验已经证实其能够有效的促进人外周血单核细胞分 泌白细胞介素(il)-12和白细胞介素(il)-10，也可以促进线虫的免疫基因的表达并延长 线虫寿命。
[0020]
本发明菌株保藏信息如下：
[0021]
菌株名称：副血链球菌streptococcus parasanguinis
[0022]
保藏号为：cgmcc no.17578；
[0023]
保藏日期：2019年4月28日；
[0024]
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0025]
保藏单位简称：cgmcc；
[0026]
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
[0027]
图1显示为副血链球菌f278eric图谱。
[0028]
图2显示为基于16s rrna基因全长序列建立的副血链球菌f278的进化树。
[0029]
图3显示副血链球菌f278菌体细胞刺激人外周血单核细胞(pbmc)分泌白细胞介素(il)
ꢀ-
12和白细胞介素(il)-10的量，且副血链球菌f278菌体细胞的刺激作用强于已有的市售 益生菌鼠李糖乳杆菌gg(lgg)。
[0030]
图4显示为副血链球菌f278菌体细胞显著延长秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans) 寿命。
[0031]
图5显示副血链球菌f278菌体细胞显著提高了秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans) 免疫基因的表达水平。
具体实施方式
[0032]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
[0033]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指 出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0034]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0035]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关 领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等
[0036]
molecular cloning：a laboratory manual，second edition，cold spring harbor laboratory press，1989and third edition，2001；ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley&sons，new york，1987and periodic updates；the series methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatin structure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods in enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academic press，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatin protocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
[0037]
材料及其来源：
[0038]
无菌小鼠：上海斯莱克实验动物中心，c57bl/6j小鼠
[0039]
wilkins-chalgren(wch)培养基：青岛，海博货号：hb0261
[0040]
m17培养基：青岛，海博货号：hb0391
[0041]
ngm培养基需要用以下试剂配制而成：
[0042]
nacl,sigma s7653-1kg
[0043]
peptone，sigma p6713-500g
[0044]
agar，sigma 05038-500g
[0045]
cacl2.2h2o,sigma c3881-500g
[0046]
mgso4.7h2o，sigma m1880-500g
[0047]
kh2po4,sigma p0662-500g
[0048]
k2hpo4.3h2o，sigma,p9666-500g
[0049]
cholesterol，sigma c8667-1g
[0050]
ngm培养基配置方法：称取3g nacl、2.5g peptone、20g agar，加单蒸水975ml溶 解，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至65℃左右。在无菌条件下，加入以下无菌溶液： 1ml 1m cacl2，1ml 1m mgso4，25ml 1m磷酸钾缓冲液(ph 6.0)，1ml 5mg/ml cholesterol。充分混匀后，使用无菌吸管分装至6厘米培养皿中，每块平皿15ml，室温 静置凝固即制成ngm琼脂平板。
[0051]
线虫：美国线虫保藏中心cgc(caenorhabditis genetics centre,university of minnesota， minneapolis)
[0052]
大肠杆菌op50：美国线虫保藏中心cgc(caenorhabditis genetics centre,university of minnesota,minneapolis)
[0053]
实施例1副血链球菌f278的分离
[0054]
将100微升的新鲜采集的人母乳灌胃给在无菌包中生长的8周龄无菌小鼠，隔天用同样 的母乳给每只小鼠进行二次灌胃。灌胃结束后继续在无菌包中饲养小鼠8周。用第8周的小 鼠粪便进行细菌分离。
[0055]
向小鼠粪便立即加入1ml的无菌的0.01mol/l磷酸盐缓冲液(pbs，添加0.1％l-cystei ne)，充分振荡使粪便样品成均匀浑浊。将粪悬液做10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
稀释梯度，将每个梯度的稀释液各100μl分别涂布于wilkins-chalgren(wch)和m1 7固体培养基平板(1.2％琼脂)上，每个稀释梯度重复三块平板。将所有平板倒置于厌氧培 养箱中，37℃培养。培养48小时后，选出菌落数量较为适中、出现较多可分开的单菌落的 平板。根据不同的菌落形态和大小，在每种培养基的每个平板上随机挑取菌落，分别转接到 相应新的wch和m17固体培养基平板上，并编号。将每个单菌落进行三次划线纯化。把纯 化的单菌落挑入液体m17培养基中，进行富集培养24小时，将获得的培养物进行保存和后 续的鉴定。
[0056]
实施例2副血链球菌f278的鉴定
[0057]
(1)基因组dna提取：厌氧液体培养24小时后，取3ml菌液，9000g离心5分钟 收集菌体，加入475μl te缓冲液(10mm tris-hcl,1mm edta,ph 8.0)和25μl溶菌酶 (lysozyme，50mg/ml)，37℃摇床震荡孵育1h之后，加入5μl(20μg/ml)蛋白酶k 和50μl(20％)sds，震荡混匀后55℃静置孵育30min。加入等体积约550μl酚氯仿异 戊醇(体积比25：24：1)，震荡混匀，4℃静置，14000rpm离心15min，取上清，再用 氯仿异戊醇(体积比24：1)重复抽提1-2次。上清中加入两倍体积(约800μl)的预先放 在-20℃的无水乙醇和80μl(3m)醋酸钠，放入-20℃冰箱静置2小时沉淀dna，14000rpm 离心15min收集dna。低温真空干燥后用50μlte buffer(tris-hcl，ph 8，10mm)溶 解。加入20μlrnase(20mg/ml)，轻轻混匀，37℃温浴30min进行rna消化。结合 picogreen荧光染料(thermo fisher scientific,sunnyvale,usa)，利用酶标仪spectramax m5 (molecular devices,san francisco,usa)定量dna浓度。
[0058]
(2)eric-pcr(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-pcr)指纹图谱 分析：eric-pcr的扩增引物上游eric1(seq id no.1：5
′-
atgtaagctcctggggattcac-3
′
)， 下游为eric2(seq id no.2：5
′-
aagtaagtgactggggtgagcg-3
′
)。25μlpcr扩增体系中含 有20ng细菌基因组dna，四种脱氧核苷酸(dntp)的浓度各200mm，2.5u of takara rtaq dna聚合酶(takara,dalian,china),1
×
pcr buffer(mg2+free),2mm mgcl2,引物各10 pm。pcr程序为：95℃预变性7min；95℃变
性30s，52℃退火1min,65℃延伸8min， 循环30次；最后65℃延伸16min。取400ng eric-pcr产物进行1.5％(w/v)的琼脂糖电 泳，使用uvi凝胶呈像系统(tanon 3500,tanonscience&technology co.,ltd.,china)拍照， 得到指纹图谱(图1)。
[0059]
该eric图谱是该菌株特定基因组的体现，可作为副血链球菌f278菌株的特征图谱。
[0060]
(3)副血链球菌f278菌株16s rrna基因全长序列的pcr扩增、克隆、测序和进化 地位分析：
[0061]
菌株16s rrna基因全长序列的pcr扩增使用的引物为27f(seq id no.3： 5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(seq id no.4：5'-cggcttaccttgttacgactt-3')。25μl体系中 包括0.75u rtaq dna聚合酶(takara,dalian,china)，1
×
pcr buffer(mg
2+
free)，2mm mgcl2，每条引物各10pmol，四种脱氧核苷酸各200μm，细菌基因组dna 10ng作为模 板。扩增程序如下：95℃预变性7min；94℃变性30s，52℃退火1min，65℃延伸8min， 如此循环25次，最后在65℃延伸16min。
[0062]
根据gel extraction kit 200(omega，usa)的使用说明书对pcr产物进行纯化。根据连接 试剂盒说明书，将纯化后的pcr产物与载体pgem-t easy vector(promega，madison，usa) 进行连接，连接产物用转化法转入到宿主菌e.coli dh5α感受态细胞(transgen，beijing， china)中。然后均匀涂布于预先添加了一定浓度的iptg和x-gal的lb-氨苄青霉素(100 μg/ml)平板上，37℃培养12小时，随机挑选白斑阳性克隆，进行测序(life technologies， shanghai，china)。副血链球菌f278cgmcc no.17578菌株的16s rrna基因的全长序列如 seq id no.5所示：
[0063][0064][0065]
将获得16s rrna基因序列在genbank数据库中进行blast(http://
www.ncbi.nlm.ni h.gov/blast)比对，与数据库的已知细菌最相似的序列的细菌为：streptococcus parasanguini s atcc 15912，相似性为98.98％。使用mega 5软件(molecular evolutionary genetics analysis package)构建系统进化树(neighbor-joining phylogenetic tree)，显示f278菌株为 副血链球菌(图2)。
[0066]
实施例3热杀死的副血链球菌f278菌体细胞促进人外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclear cells，pbmcs)分泌白细胞介素12(il-12)和白介素10(il-10)
[0067]
将副血链球菌f278和鼠李糖乳杆菌lgg分别在m17(中国，青岛，海博)和mrs(中 国，青岛，海博)液体培养基中培养8小时，达到平台期。将培养物5,000g离心10min，收 集副血链球菌f278和鼠李糖乳杆菌lgg菌体细胞。将菌体细胞用pbs重悬之后5,000g离 心10min，如此洗涤2次，去除细菌培养基。用pbs将菌体细胞浓度调整为108cfu/ml和 109cfu/ml，65℃水浴20min，对菌体细胞热致死，冻存到-80℃备用。
[0068]
在24孔板中，每孔接种2
×
106个人外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclear cells，pbmc)后，加入20μl的1
×
108cfu/ml或者1
×
109cfu/ml的热杀死的副血链球菌 f278和鼠李糖乳杆菌lgg菌体，最终体积为1ml，构建了细胞与细菌比例分别为1:1和1： 10的共孵育体系。阴性对照组组中不加入细菌细胞，而加入20μl的pbs。。所用细胞培养 基为含10％胎牛血清和1％链霉素和氨苄青霉素的1640细胞培养基。放置到37℃，5％二氧 化碳培养箱中共孵育24h。收集细胞培养上清，用elisa试剂盒测试其中白介素10和白介素 12的浓度。
[0069]
结果如图3显示，副血链球菌f278的菌体细胞能刺激人外周血单核细胞(pbmc)分泌 较多的白细胞介素(il)-12和白细胞介素(il)-10(图3)，而鼠李糖乳杆菌lgg只能促 进少量的il-12和il-10的分泌。
[0070]
实施例4副血链球菌f278的菌体细胞提高线虫的免疫基因的表达水平并延长线虫的 寿命
[0071]
(1)副血链球菌f278的菌体细胞延长线虫的寿命
[0072]
分别用m17培养基(中国，青岛，海博)和mrs(中国，青岛，海博)培养基将副 血链球菌f278和鼠李糖乳杆菌lgg在37℃厌氧工作站(dg500,dws,united kingdom) 培养8小时。大肠杆菌op50在好氧37℃条件下培养过夜。培养后的菌液15000
×
g 10min 离心，去处上清液，收集副血链球菌f278，鼠李糖乳杆菌lgg和大肠杆菌op50菌体， 用无菌m9缓冲液,15000
×
g条件下，离心10min，将细菌菌体洗两次。洗过的菌体用 m9缓冲液调节细菌菌体浓度为10mg/100μl(湿重/体积)，并混匀。在直径为6厘米 不添加蛋白胨的ngm(mngm)平板上滴加100μl含10mg菌体的的细菌重悬液。
[0073]
在添加有蛋白胨的ngm平板上、以大肠杆菌op50为食的线虫生长到l3期后，分 别转移到mngm平板上，分别以副血链球菌f278,鼠李糖乳杆菌lgg和大肠杆菌op50 的菌体为食，并放置到25℃条件下培养。副血链球菌f278，鼠李糖乳杆菌lgg和大肠 杆菌op50分别设置5个平行平板(20-25条/板)，共100-125条线虫测试其寿命并加以 比较。实验过程中，线虫对铂丝轻微刺激无反应即视为死亡。使用oasis 2(online application for survival analysis 2)在线软件进行kaplan-meier生存分析，并用 log-rank检验饲喂不同细菌菌体的线虫平均寿命的差异。
[0074]
结果如图4显示，与线虫的标准食物大肠杆菌op50相比，副血链球菌f278的菌体 细胞和鼠李糖乳杆菌lgg细胞均显著延长了线虫的寿命，说明了副血链球菌f278的安 全性和益生性。
[0075]
(2)食用副血链球菌f278的菌体细胞的线虫的rna的提取
[0076]
饲喂副血链球菌f278、鼠李糖乳杆菌lgg、或大肠杆菌op50第14天后，收集500条线 虫，利用trizol reagent(invitrogen)将线虫裂解后提取rna，利用rneasy mini kit(qiagen) 纯化rna，并用dnasei(invitrogen)试剂盒去除残留的dna。
[0077]
(3)用qpcr的方法测定副血链球菌f278的菌体细胞提高线虫免疫基因的表达水平 纯化后的线虫rna利用superscript
tm first-strand synthesis system for rt-pcr (invitrogen)逆转录试剂盒，以oligo(dt)为引物合成第一条cdna链。用sybr green supermix(bio-rad)对线虫的免疫基因进行定量检测(roche，lightcycler96)。以看家基 因act-1为参照基因，用2-δδct
法计算免疫基因的相对表达量(如图5)。
[0078]
结果显示，与线虫的标准食物大肠杆菌op50相比，副血链球菌f278的菌体细胞显著提 高了线虫免疫基因(cpr-1,cpr-5,lys-5,clec-60,c15c8.3)的表达水平。
[0079]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外， 本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前 提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对 本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种 如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围 内。