一种编码IFNα蛋白的基因、重组载体pELSH-IFNα、重组干酪乳杆菌及应用的制作方法

本发明涉及乳酸菌的改造及其开发应用技术领域，尤其涉及一种编码ifnα蛋白的基因、重组载体pelsh-ifnα、重组干酪乳杆菌及应用。

背景技术：

轮状病毒(rotavirus,rv)感染是临床上5岁以下婴幼儿腹泻就诊的最主要原因，目前尚无特效治疗药物。针对rv胃肠炎，基本只是以口服补液形式暂时缓解因机体脱水、电解质流失引起的呕吐和腹泻等症状。而且，轮状病毒在世界范围内流行，据不完全统计，全球每年有约四五十万儿童死于轮状感染，其中6个月到2岁的年龄段感染率最高(catherineetal2011；刁连东等2018)。由于轮状感染不受社会经济、环境卫生条件的影响，所以发病率在发达国家和发展中国家基本无差(parasharetal2003)。显然，rv腹泻已成为危害婴幼儿健康成长和生命安全的重要公共卫生问题，对各国的经济社会发展都有弊害。

关于轮状病毒腹泻，先后有科学家和医疗工作者为之做出过很多努力和尝试，目前主要依靠接种疫苗对其进行预防和控制。其中，作为美国首个批准的rv疫苗，rotashield在上市1年后被发现与肠套叠存在关联，已停产退出市场(butteryetal2011)。之后虽有rotarix和rotateq这两种疫苗被证明对rv腹泻有较高的预防保护性，但2010年在其中检测到其它病毒的核酸片段不得不令我们担忧疫苗污染存在的安全隐患问题(ruiz-palaciosetal2006；司璐和魏至栋2018)。此外，由我国研制出品的rv疫苗llr虽然证明对轮状腹泻有一定的保护效果，但其安全性和有效性评价仅限于本国市场。值得一提的，中国申请专利cn201711395821.x在2018年5月4日公开了一种可稳定表达猪轮状病毒vp4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株以及它的制备方法。该发明是在upp基因缺失的干酪乳杆菌基础上，通过同源重组插入猪轮状病毒vp4基因得到其稳定表达的乳酸菌基因工程疫苗。这不仅保证了抗原免疫的特异性，更是将疫苗株与益生菌巧妙地联系在一起。然而，就目前已上市或新发明的rv疫苗而言，多是针对某地区某时段的流行株研制而成，在不同地区的保护效果及有效性存在明显差别，不利于国家对广大婴幼儿、养殖户对幼龄禽畜病毒性疾病的大范围规模化防治。因此，预防轮状病毒腹泻新途径的发现应得到学者更加广泛的关注，新型广谱抗病毒剂的研发迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种编码ifnα蛋白的基因、重组载体pelsh-ifnα、重组干酪乳杆菌及应用，所述重组干酪乳杆菌能够分泌人ifnα优化蛋白，且分泌蛋白在体外ma104(猴胎肾细胞)细胞具有很好的抗轮状病毒活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种编码ifnα蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明还提供了一种重组载体pelsh-ifnα，所述重组载体pelsh-ifnα以质粒pelsh为原始载体，携带有上述方案所述编码ifnα蛋白的基因；

所述质粒pelsh的核苷酸序列如seqidno：2所示。

优选的，所述编码ifnα蛋白的基因的插入质粒pelsh中的位点为ncoi和kpni。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体pelsh-ifnα的重组干酪乳杆菌。

本发明还提供了上述方案所述重组干酪乳杆菌在制备防治轮状病毒的药物中的应用。

本发明还提供了上述方案所述重组干酪乳杆菌在制备防治轮状病毒腹泻的疫苗中的应用。

本发明还提供了上述方案所述所述重组干酪乳杆菌在制备发酵食品、保健品或饲料中的应用。

优选的，所述发酵食品包括酸奶和/或含乳饮料。

优选的，所述保健品包括功能性膳食补充剂。

本发明的有益效果：本发明提供了一种编码ifnα蛋白的基因、重组载体pelsh-ifnα、重组干酪乳杆菌及应用。本发明提供了一种编码ifnα蛋白的基因，该基因根据干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)对简并密码子的使用偏嗜性对hifnα成熟多肽编码序列进行密码子优化得到，与其他编码ifnα蛋白的基因相比干酪乳杆菌(宿主菌)对本发明的基因使用频率更高；本发明还提供了一种重组载体pelsh-ifnα以及一种包含重组载体pelsh-ifnα的重组干酪乳杆菌。本发明通过基因工程技术将α干扰素(ifnα)的广谱抗病毒功效与乳酸菌的益生作用结合在一起，利用功能因子的原位表达和益生菌的可黏膜递送实现增效的方式以替代传统的肌注、静注，经检测，所述重组干酪乳杆菌分泌得到的rhifnα在ma104细胞抗轮状病毒的效价达到2.12×10⁵u/mg。本发明的技术方案为儿童病毒性腹泻尤其是轮状病毒腹泻的防治提供了一种新型的解决思路和应用方向，有利于对广大婴幼儿、养殖户对幼龄禽畜病毒性疾病的大范围规模化预防。并且，本发明利用干酪乳杆菌独特的风味物质将其发酵，可开发成功能性的酸奶饮料、膳食补充剂或饲料添加剂，经检测，利用本发明的重组干酪乳杆菌发酵获得的酸奶保质期能够延长。

附图说明

图1为重组载体pelsh-ifnα的质谱图；

图2为实施例2中jm109-pelsh-hifnα重组子菌液pcr验证，其中m为trans2kplusdnamarker，1-10分别为从平皿上挑取的10个转化子；

图3为实施例2中重组载体pelsh-ifnα的双酶切验证结果，其中m为dnamarker，左1-10分别为ecori-pslpa-f/bamhi-t-r双酶切产物电泳图，右1-10为ncoi/kpni双酶切产物电泳图；

图4为实施例3中hifnα重组蛋白在干酪乳杆菌的分泌表达鉴定结果；

图5为实施例4中蛋白最佳分泌表达量测定结果；

图6为实施例6中重组目的蛋白的抗轮状病毒活性定性镜检结果，其中图a为既不加样诱导也不攻毒处理的正常细胞，即空白对照皿；图b为不加样诱导但攻毒处理的病变细胞，即病毒对照皿；图c为加rhifnα重组蛋白样品诱导后rv攻毒处理的实验细胞，即样品皿；图d为加rhifnα蛋白标品诱导后rv攻毒处理的细胞，即标品皿；

图7为实施例7中本发明酸奶在贮藏过程中活乳酸菌数含量变化情况。

具体实施方式

本发明提供了一种编码ifnα蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，具体为：

tgtgatttgccagaaacccatagtttggataatcgccgcaccttgatgttgttggcccaaatgagtcgcattagtccaagtagttgtttgatggatcgccatgattttggctttccacaagaagaatttgatggcaatcaatttcaaaaagccccagccattagtgttttgcatgaattgattcaacaaatttttaatttgtttaccaccaaagatagtagtgccgcctgggatgaagatttgttggataaattttgtaccgaattgtatcaacaattgaatgatttggaagcctgtgttatgcaagaagaacgcgttggcgaaaccccattgatgaatgccgatagtattttggccgttaaaaaatattttcgccgcattaccttgtatttgaccgaaaaaaaatatagtccatgtgcctgggaagttgttcgcgccgaaattatgcgcagtttgagtttgagtaccaatttgcaagaacgcttgcgccgcaaagaa。

本发明中，所述的优化的ifnα蛋白来源于人(即humanifnα)；本发明具体实施过程中基于ncbi上提交的人α干扰素的蛋白序列【(refseq：np_076918.1)，氨基酸序列如seqidno：3所示，具体为：cdlpethsldnrrtlmllaqmsrispssclmdrhdfgfpqeefdgnqfqkapaisvlheliqqifnlfttkdssaawdedlldkfctelyqqlndleacvmqeervgetplmnadsilavkkyfrritlyltekkyspcawevvraeimrslslstnlqerlrrke】，在不改变其氨基酸的前提下，根据干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)对简并密码子的使用偏嗜性对hifnα成熟多肽编码序列进行密码子优化(从编码同一种氨基酸的简并密码子中选择一个宿主菌使用频率高的序列，u→t)，送武汉擎科创新生物技术有限公司全基因合成获得目的基因(编码ifnα蛋白的基因)。本发明中，所述编码ifnα蛋白的基因与其他编码ifnα蛋白的基因相比宿主菌使用频率更高。

本发明还提供了一种重组载体pelsh-ifnα，所述重组载体pelsh-ifnα以质粒pelsh为原始载体，携带有上述方案所述编码ifnα蛋白的基因；所述质粒pelsh的核苷酸序列如seqidno：2所示；所述编码ifnα蛋白的基因的插入质粒pelsh中的位点为ncoi和kpni；所述重组载体pelsh-ifnα的质谱图参见图1。

本发明中，所述质粒pelsh携带有信号肽序列；所述信号肽序列编码的氨基酸序列如seqidno：4所示，具体为：mkkkiisailmstvilsaaaplsgvyadtn。本发明中，所述信号肽序列来源于乳酸乳球菌，由武汉擎科创新生物技术有限公司合成。

本发明中，所述载体pelsh从干酪乳杆菌中分离质粒pmc11改造构建而得，由于质粒本身分离自lactobacilluscaseimcj(lactobacilluscaseimcj△1为不含该质粒的本发明宿主菌，lactobacilluscaseimcj△1与lactobacilluscaseimcj的区别在于：后者缺失了一个pmc11质粒即为前者；所述lactobacilluscaseimcj△1与lactobacilluscaseimcj保藏于华中农业大学农业微生物学国家重点实验室a408)，故其在干酪乳杆菌中可稳定存在并表达。且本质粒表达系统表达宿主范围窄，仅可在大肠杆菌和干酪乳杆菌(或副干酪乳杆菌)中穿梭表达，进一步保证了目标基因表达的定向性与安全性。

本发明中，所述重组载体pelsh-ifnα的制备方法优选的包括以下步骤:编码ifnα蛋白的基因和质粒pelsh双酶切，回收酶切产物，酶切产物酶连，得到重组载体pelsh-ifnα。

本发明中，所述编码ifnα蛋白的基因和质粒pelsh双酶切体系参见表1；所述酶切的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述酶切的时间优选为1.5～3h，更优选为2h。

表1编码ifnα蛋白的基因和质粒pelsh双酶切体系

本发明中，所述回收酶切产物的试剂盒优选为pcr清洁回收试剂盒，购自于omega公司；所述回收酶切产物后优选的还包括除去反应体系中的酶等物质，琼脂糖凝胶电泳验证成功后待连。

本发明中，所述酶切产物(目的片段与载体片段)酶连的体系参见表2；所述酶连的温度优选为15～18℃，更优选为16℃；所述酶连的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h。

表2目的片段与载体片段酶连体系

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体pelsh-ifnα的重组干酪乳杆菌；本发明中所述重组干酪乳杆菌的制备方法优选为将重组载体pelsh-ifnα电转化干酪乳杆菌感受态细胞。

本发明将ifnα的广谱抗病毒功效与乳酸菌的益生功能通过基因工程技术结合起来，实验是以干酪乳杆菌为例进行具体实施和验证的。本发明使用的宿主菌为干酪乳杆菌lactobacilluscaseimcj△1，但不仅仅限于该菌，其它益生菌只要能表达目标蛋白的均可。

本发明还提供了上述方案所述重组干酪乳杆菌在制备防治轮状病毒的药物中的应用方向。本发明中所述重组干酪乳杆菌分泌表达的重组蛋白具有抗轮状病毒活性，故能分泌本目的蛋白的重组干酪乳杆菌也具有相应的抗病毒活性。

本发明还提供了上述方案所述重组干酪乳杆菌在制备防治轮状病毒腹泻的疫苗中的应用方向。本发明中，所述重组干酪乳杆菌分泌表达的重组蛋白具有防治轮状病毒腹泻的功效，故所述重组干酪乳杆菌也相应具有防治轮状病毒腹泻的功效。

本发明还提供了上述方案所述重组干酪乳杆菌在制备发酵食品、保健品或饲料中的应用方向；所述发酵食品优选的包括酸奶和/或含乳饮料；所述保健品优选的包括功能性膳食补充剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1构建重组载体pelsh-ifnα

1.目的片段和质粒pelsh双酶切

双酶切体系参见上述方案表1。37℃酶切2h。利用pcr清洁回收试剂盒对酶切产物进行回收，除去反应体系中的酶等物质，琼脂糖凝胶电泳验证成功后待连。

2.目的片段与载体片段的酶连

酶连体系参见上述方案表2。酶连反应16℃、1h，得到重组载体pelsh-ifnα。

实施例2构建重组干酪乳杆菌

将实施例1得到的重组载体pelsh-ifnα电转化干酪乳杆菌感受态细胞，37℃静置复苏后涂布含有红霉素的mrs平皿，于37℃恒温倒置培养2d后筛选、验证、获得阳性重组子。验证结果参见图2和图3，其中图2为jm109-pelsh-hifnα重组子菌液pcr验证，m为trans2kplusdnamarker，1-10分别为从平皿上挑取的10个转化子。pelsh空载大小为640bp，pelsh-hifnα重组质粒pcr产物大小为1105bp。由琼脂糖凝胶核酸电泳结果图可知，条带单一明亮，10个泳道的pcr产物片段大小一致，均与预期相符。图3表示重组载体pelsh-ifnα的双酶切验证结果，m为dnamarker，左1-10分别为ecori-pslpa-f/bamhi-t-r双酶切产物电泳图，右1-10为ncoi/kpni双酶切产物电泳图。重组质粒经ecori-pslpa-f/bamhi-t-r双酶切后产物预期大小分别为1096bp和5623bp，经ncoi/kpni双酶切后产物预期大小分别为498bp和6221bp。由琼脂糖凝胶核酸电泳结果图可知，所有质粒双切结果与预期一致，条带大小相符，进一步说明初步获得了正确的pelsh-hifnα阳性克隆。

实施例3hifnα重组蛋白在干酪乳杆菌的分泌表达鉴定

划线并挑取实施例2中阳性克隆重组干酪乳杆菌(l.casei-pelsh-hifnα)转接至5ml含em的mrs培养基中，37℃静置培养过夜。以l.caseimcjδ1及携带空载pelsh的重组菌l.casei-pelsh为阴性对照，将菌体培养至相同od。收集各菌菌液1ml，10000×g离心1min，取其上清作为待检样品进行westernblot鉴定。鉴定结果参见图4，其中m为蛋白marker，泳道1-3分别为受体菌(l.caseimcjδ1)、质粒载体转化子(l.caseimcjδ1-pelsh)和重组菌(l.caseimcjδ1-pelsh-hifnα)。

由wb结果可知，空菌和空载均未检测到蛋白，只有重组菌检测到蛋白大小与预期21kda相符，说明重组目的蛋白可在干酪乳杆菌l.caseimcjδ1中成功分泌表达。

实施例4蛋白最佳分泌表达量测定

活化实施例2中重组干酪乳杆菌，1％(体积比，例如100ml培养基接种1ml菌液)接种至mrs培养基，收集不同生长时期(如od600＝1.0、2.0、3.0等)的培养液上清，即重组干酪乳杆菌体不同生长时期培养液上清总蛋白，取15μl样品进行westernblot分析，以在其最佳生长时期收菌分离纯化蛋白，待做细胞实验检测其抗轮状病毒活性。检测结果参见图5，m为蛋白marker(实验中所使用蛋白marker均为同一种，thermo货号26616)，泳道1-9分别代表od600＝0.942，1.42，2.09，2.87，3.44，5.04，5.67，5.79和5.95的含pelsh-hifnα的重组子上清液样。

分析结果可得，当细胞浓度od600≤2.87时，上清液中hifnα蛋白量随细胞生长而增高，在od600＝2.87时达到最高。之后，上清液中hifnα蛋白量则随着细胞浓度的增高逐渐降低。

实施例5重组目的蛋白的分离纯化

活化培养实施例2中重组干酪乳杆菌至蛋白分泌量最大时收集菌液，4℃、7500r/min离心30min，上清液过0.22μm滤膜除杂除菌后，进行镍柱亲和层析。上样前，先用20％乙醇、超纯水冲洗镍柱，再用buffera平衡镍柱。柱平衡后，将离心、过滤处理后的样品以1ml/min的流速通过衡流泵加载到ni柱上。挂柱完成后，依次用含不同浓度咪唑的buffera/bufferb混合液开始梯度洗脱目的产物。根据洗脱过程实时出峰情况，当流出液的紫外吸光度开始明显上升时收集流出液，至流出液的紫外吸光度下降至最低值时停止收液体。将收集的各管样品进行12％sds-page检测分析。根据电泳结果，选择相应收集管中的洗脱蛋白在4℃环境下透析除去咪唑，通过蛋白标曲测定浓度。

实施例6实施例5获得的重组目的蛋白的抗轮状病毒活性检测

1.定性镜检，方法如下：

(1)37℃、5％co2环境培养ma104细胞至长成单层；

(2)弃去培养液，pbs洗几次；

(3)样品处理：稀释蛋白样品和标品至相同浓度，分别加入相应皿中，37℃、5％co2培养箱诱导孵育20h。同时做其它条件等同处理但不加样品、不加毒的正常细胞空白对照和不加样品，20h后只加病毒的rv对照皿，37℃、5％co2培养；

(4)攻毒：先用胰酶活化病毒30min，然后吸弃原培养液加入rv皿、样品皿和标品皿，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h。弃去病毒液，再加入含胰酶的维持液放37℃、co2环境孵育24h，每日观察病变，记录重组分泌蛋白体外对rv侵染的保护程度。结果参见图6。由图6可知和空白对照皿正常细胞相比，病毒b皿细胞发生明显典型病变：细胞呈圆成簇，簇间空隙显著，有空窝形成。而和rv对照皿病变细胞相比，样品皿和标品皿细胞未观察到典型显著的轮状病毒cpe或者说是微乎其微，其细胞状态和正常细胞相似。这充分说明了由干酪乳杆菌分泌表达的hifnα蛋白在ma104细胞上确实具有一定的抗轮状病毒活性。

2.效价测定，方法如下：

(1)37℃、5％co2培养ma104细胞至长成单层；

(2)将纯化并已测定浓度的hifnα进行5倍递次稀释，按0.1ml/孔的量加入到标记相应浓度的细胞培养板孔中，37℃、5％co2诱导培养20h；

(3)吸弃培养液，按100μl/孔加入轮状病毒液进行攻毒，同时设不加病毒的对照和不加干扰素的对照，37℃、5％co2继续培养；

(4)逐日观察cpe，连续3d。按照reed-muench法用病变抑制孔代替毒价测定孔中的病变孔计算出hifnα在ma104细胞上抑制轮状病毒复制的活性即效价。测算结果参见表3。由表3计算得到rhifnα在ma104细胞抗轮状病毒的效价可达2.12×10⁵u/mg。

表3hifnα在ma104细胞上抑制轮状病毒复制的活性测算结果

按照reed-muench法计算rhifnα蛋白在ma104细胞上抗轮状病毒活性：

经测算，rhifnα在ma104细胞抗轮状病毒的效价为2.12×10⁵u/mg。

实施例7功能性酸奶发酵实验及活菌数检测

将60g脱脂乳粉溶解于455ml蒸馏水配成脱脂乳液搅拌均匀、与20ml重组干酪乳杆菌生长对数期菌液、25ml平菇汁混合得到混合液，置37℃环境恒温发酵20h，当观察到有层析现象，即有乳清析出时，摇晃后质地均匀，说明状态良好，发酵成功，检测其活乳酸菌数是否达标。

将发酵好的酸奶放4℃冰箱贮藏，分别在贮藏第3d、6d、第9d、第12d等取出，用灭菌蒸馏水做10倍倍比稀释后涂布含红霉素抗生素的mrs琼脂平板，倒置在37℃恒温培养箱培养36h左右，计数计算分析，检测本发明酸奶的保质期并与市场比较。结果见图7。由图7可知利用本重组干酪乳杆菌发酵的酸奶，产品在4℃条件下贮存21天后，干酪乳杆菌重组菌的活菌数量数量级仍达10⁸cfu/ml，超过国标两个数量级，说明其具有良好的应用基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种编码ifnα蛋白的基因、重组载体pelsh-ifnα、重组干酪乳杆菌及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>498

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtgatttgccagaaacccatagtttggataatcgccgcaccttgatgttgttggcccaa60

atgagtcgcattagtccaagtagttgtttgatggatcgccatgattttggctttccacaa120

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<210>2

<211>6254

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctgaaaagtggttcgaaatgacaatcgtgtcattttggcaaagaatcaaagtctagaagt60

ctagtagtaaacaccgatgtcgttgggcatcggtgtttttgcttggcaaaaaagcgggga120

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