本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种适用于cho细胞培养用无蛋白培养基及其培养方法。
背景技术：
基因重组治疗性抗体(包括受体-fc融合蛋白等抗体样分子)的研发和产业化，是其发展的关键。由于基因重组治疗性抗体上游构建技术和大量生产抗体的动物细胞大规模培养技术的落后，我国现在最高生产水平非常低，产量低导致生产成本高居不下，项目难以产业化。适宜的培养基和大规模培养工艺是目前制约重组抗体类药物表达水平的两大瓶颈。而其中找到适合培养的细胞培养基对整个生产的作用尤为重要。
20世纪80年代初期，在世界卫生组织(who)明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，哺乳动物细胞在生物技术药物的研发中获得了长足发展。目前，用于生物制药的真核表达系统中，中华仓鼠卵巢细胞系(chinesehamsterovarycellline，cho)是应用最为广泛的，在美国和欧盟已批准的以哺乳动物细胞生产的生物药品中，利用cho系统的占60％以上，且比例不断上升。
谷氨酰胺是细胞生长代谢过程中很重要的氮源物质，在细胞培养基中它是维持细胞生长必不可少的组分，为细胞的生物合成提供能源。而生产蛋白类药物的动物细胞(如cho细胞)对谷氨酰胺的利用具有消耗快、代谢率低的特点。谷氨酰胺在细胞培养基中会发生自发分解，细胞培养基的储存温度越高，存放时间越久，谷氨酰胺分解的越快。谷氨酰胺分解后导致氨的形成，1分子谷氨酰胺经过代谢进入三羧酸(tca)循环要产生2分子的铵离子，铵离子的累积对细胞生长会产生毒害作用。
目前，商业化的基础培养基在dhc细胞的大规模培养中，多采用批次流加培养方式不断的补充谷氨酰胺以维持培养基内细胞生长所需氮源浓度，同时谷氨酰胺会不断分解产生铵离子，铵离子的生成约为0.2～0.6mm/106cells/天，易造成铵离子累积。
因此，为解决在动物细胞培养过程中谷氨酰胺易被耗竭及其代谢副产物铵离子严重累积这一关键技术难题，中国专利cn104894055a公开了一种优化的细胞培养基，其通过在基础培养基中同时添加谷氨酰胺和谷氨酸，并控制其浓度，以满足细胞在生产培养的前期，主要代谢消耗谷氨酰胺的需求，当谷氨酰胺消耗尽时，细胞会转而利用谷氨酸，这样有力的保证了谷氨酰胺的耗尽对细胞的生长代谢没有影响，同时又能很好的将铵离子控制在细胞耐受范围内。但在动物细胞培养过程中，对于一些特定的细胞，谷氨酰胺的浓度也有相应的浓度要求。例如对于dhfr-cho细胞(二氢叶酸还原酶缺陷型)，谷氨酰胺的浓度要达到4mmol/l时，方可满足细胞的正常生长。在上述专利中细胞生长前期快速消耗谷氨酰胺，随着谷氨酰胺浓度逐渐降低，会影响细胞的正常生长。
技术实现要素：
针对上述背景技术中的问题，本发明目的在于提供一种适用于cho细胞培养用无蛋白培养基，在细胞培养过程中维持谷氨酰胺的浓度水平，避免谷氨酰胺出现耗尽现象的同时避免铵离子浓度积累过高，保证细胞的生长性能。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种适用于cho细胞培养用无蛋白培养基，所述培养基由基础培养基和流加培养基组成，所述基础培养基内不含有谷氨酰胺，且所述基础培养基内含有二肽形式的谷氨酰胺与半胱氨酸；所述流加培养基含有谷胺酰胺与半胱氨酸；其中所述基础培养基内半胱氨酸的浓度在0.08-0.15g/l，二肽形式的谷氨酰胺的浓度在2.8-8.0mmol/l；所述流加培养基中半胱氨酸的浓度在0.05-0.12g/l，谷氨酰胺的浓度在4.0-6.5mmol/l。
进一步地，所述二肽形式的谷氨酰胺包括甘氨酰谷氨酰胺或丙氨酰谷氨酰胺中的一种或多种。
进一步地，所述基础培养基内半胱氨酸的浓度在0.10-0.12g/l，二肽形式的谷氨酰胺的浓度在6.0-8.0mmol/l；所述流加培养基中半胱氨酸的浓度在0.08-0.12g/l，谷氨酰胺的浓度在5.5-6.5mmol/l。
进一步地，所述基础培养基选自一下商用培养基：ex-cell302choserum-freemedium、ex-cell325pfcho、ex-xellcdfusion、sfm4cho、cdm4cho、hycellchomedium或cdm4mab中的一种或多种。
进一步地，所述流加培养基采用培养基feeda或feedb中的一种或多种。
更进一步地，所述流加培养基中添加有5.5-8.0mmol/l葡萄糖。
本发明的另一个目的在于，提供一种使用上述的无蛋白培养基对cho细胞进行生产培养的培养方法。
所述培养方法首先用所述基础培养基培养cho细胞24h-48h，当细胞生长至2.5～3.0×106cells/ml时，开始补加流加培养基，进行流加培养，之后每隔48h-72h补加一次流加培养基。
进一步地，所述流加培养基分3-5次进行补加，在流加培养过程中，控制葡萄糖浓度维持在2.5-3.0g/l，谷氨酰胺浓度在1.8-2.5mmol/l，半胱氨酸的浓度在0.03-0.05g/l。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明中在基础培养基中使用二肽形式的谷氨酰胺代替谷氨酰胺，二肽形式的谷氨酰胺十分稳定，不容易发生水解和氨的毒性堆积，又可被细胞所利用。在细胞的培养过程中，因细胞内的氨基肽酶能裂解二肽，逐渐释放丙氨酸和谷氨酰胺，为细胞生长提供氮源；使用二肽形式的谷氨酰胺解决了谷氨酰胺容易被快速分解造成谷氨酰胺易被耗竭的问题，且通过流加方式分批补加谷氨酰胺，维持谷氨酰胺的浓度在较低限度，避免发生铵离子严重累积问题；通过大量实验发现在cho细胞的无蛋白质培养基配方中，添加适量的半胱氨酸使细胞生长展现出令人满意的生长性能，因此，添加半胱氨酸作为cho细胞培养过程中的另一氮源，满足细胞生长过程中所需的氮源浓度要求，以保证细胞的稳定生长。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例中所用的基础培养基、流加培养基及标准品均可以通过商业途径获得。cho(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株购自lonza公司。
实施例1
按照表1中的配方，在基础培养基中添加不同浓度的二肽形式的谷氨酰胺与半胱氨酸，作为cho细胞培养的基础培养基，采用分批流加方式补充流加培养基，所述流加培养基中添加不同浓度的谷氨酰胺与半胱氨酸。按照表1配方制备不同编号的培养基，在相同的细胞培养工艺条件下进行cho细胞培养。
基础培养基为市售培养基hycellchomedium；所述的流加培养基选自商用补料培养基feeda(如gibco公司，货号a10234-01)。
培养工艺：首先使用添加不同浓度二肽形式的谷氨酰胺与半胱氨酸的基础培养基培养cho细胞48h，当细胞生长至2.5～3.0×106cells/ml时，开始补加添加有不同浓度谷氨酰胺与半胱氨酸的流加培养基，进行流加培养，之后每隔48h补加一次流加培养基；
所述流加培养基分5次进行补加，在最后一次补加流加培养基后，继续培养48h，停止培养。在流加培养过程中，控制葡萄糖浓度维持在2.3±0.2g/l，谷氨酰胺浓度在2.3±0.2mmol/l，半胱氨酸的浓度在0.04±0.1g/l。
表1
实施例2
在细胞培养过程中采用台盼蓝(0.2％)染色法对培养过程中活细胞密度和细胞活力进行检测。在补充流加培养基之前进行取样检测。
使用磷酸缓冲液(pbs)将样品细胞浓度稀释至合适的范围，使用0.2％台盼蓝进行活细胞染色，吹打均匀后，用血球计数板计算细胞数，并测定细胞活率，计数三次，取平均值。检测结果如表2、3所示。
表2活细胞密度变化趋势(106/ml)
表3细胞活性变化趋势(％)
本发明中在基础培养基中使用二肽形式的谷氨酰胺代替谷氨酰胺，二肽形式的谷氨酰胺十分稳定，不容易发生水解和氨的毒性堆积，又可被细胞所利用。在细胞的培养的初期，因细胞内的氨基肽酶能裂解二肽，逐渐释放丙氨酸和谷氨酰胺，为细胞生长提供氮源,同时半胱氨酸作为补充氮源，有助于降低谷氨酰胺的添加量，保证细胞生长的同时，最大程度降低铵离子的积累；
另外通过流加方式分批补加谷氨酰胺，维持谷氨酰胺的浓度在较低限度，避免发生铵离子严重累积问题；如表2、3的实验结果所示，发现在cho细胞的无蛋白质培养基配方中，添加适量的半胱氨酸使细胞生长展现出令人满意的生长性能，因此，添加半胱氨酸作为cho细胞培养过程中的另一氮源，满足细胞生长过程中所需的氮源浓度要求，以保证细胞的稳定生长。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。