一种来自番茄根际可诱导系统抗性的芽孢杆菌及其筛选方法与应用与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种来自番茄根际可诱导系统抗性的芽孢杆菌及其筛选方法与应用。

背景技术：

番茄黄萎病是番茄生产中的一种重要病害，多发生在番茄生长的中后期，导致植株维管束变浅、变褐，叶片和植株自上而下逐渐枯死，阻碍番茄后期营养物质的积累和运输，严重降低了番茄的产量和品质。番茄黄萎病的病原为大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)，是半知菌亚门真菌，宿主范围广泛，容易传播，可在土壤中长期存活。近年来，由于长期的连作栽培，番茄黄萎病呈逐渐加重的趋势，特别是设施栽培的番茄黄萎病，严重影响了番茄生产。

目前针对番茄黄萎病的控制主要集中在物理方法，如日晒方法、化学处理和微生物防治三个方面。物理方法随安全，但费时费力；化学方法在污染环境、病菌耐药性、食品安全等方面的弊端日益显现。对番茄黄萎病进行生物防治的常见微生物主要包括木霉菌属中的一些真菌、丛枝菌根真菌、链霉菌属中的一些微生物等。但是植物根际促生细菌防治番茄黄萎病的案例却较少。

技术实现要素：

为了有效缓解番茄连作障碍，促进连作番茄生长，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1，其菌种保藏编号cctccno：m2019456。

本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1的筛选方法：采集连作番茄的根际土壤，按1g:9ml的土、水比制备土壤悬浮液，通过连续浓度梯度稀释，得到10^-3稀释浓度的土壤悬液，然后采用平板涂布法对所述土壤悬液中的微生物进行分离培养，获得的单菌落经纯化后进行大丽轮枝菌的平板对峙实验，筛选获得贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1。

本发明还提供了上述的贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1在番茄栽培中促生的应用。

进一步地限定，所述促生是指增加连作番茄幼苗的鲜重、株高或茎粗。

本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1在番茄栽培中生物防治的应用。

进一步地限定，所述生物防治是指降低番茄黄萎病的发病率。

本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1在番茄栽培中诱导番茄系统抗性，增强番茄抵御黄萎病害的应用。

进一步地限定，所述诱导番茄系统抗性是指在番茄受到黄萎病原菌侵染后，bacillusvelezensisp1提高番茄的防御酶活性和防御基因的相对表达量。

更进一步地限定，所述防御酶为苯丙氨酸解氨酶或β-1,3-葡聚糖酶；所述防御基因为病程相关蛋白基因pr1、病程相关蛋白基因pr2、苯丙氨酸氨裂解酶基因pal或脂氧合酶基因lox。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1，已于2019年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2019456。

有益效果

经本发明分离获得具有较高的大丽轮枝菌拮抗活性，可以产iaa、铁载体、蛋白酶和纤维素酶的，具有产抗生素潜力的bacillusvelezensisp1菌株，具有良好的促生性状和田间促生功能。

本发明还验证了上述贝莱斯芽孢杆菌bacillusvelezensisp1在番茄栽培中诱导植物系统抗性的能力，当番茄受到黄萎病原菌侵染后，bacillusvelezensisp1可以降低番茄黄萎病发病率，具体体现在提高番茄相关防御酶活性和相关防御基因的相对表达量；减轻黄萎病病害，在缓解番茄连作障碍方面具有较好的利用前景。

附图说明

图1为分离菌株对大丽轮枝菌的平板抑制率，横坐标中p1、p2、p8、p23、p33、p41、p44代表筛选获得的不同菌株的编号，纵坐标为抑菌率(％)；

图2为bacillusvelezensisp1菌株的系统发育树；

图3为bacillusvelezensisp1菌株的菌落形态；

图4为bacillusvelezensisp1菌株产铁载体能力；

图5为bacillusvelezensisp1菌株产蛋白酶能力；

图6为bacillusvelezensisp1菌株产纤维素酶能力；

图7为bacillusvelezensisp1菌株产抗生素潜力，其中b表示bmyb基因；f表示fend基因；i表示ituc基因；s表示srfa基因；

图8为bacillusvelezensisp1菌株对连作番茄的促生和拮抗功能，其中ck代表未接种菌株的番茄植株，v代表接种黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)的番茄植株，p1代表接种bacillusvelezensisp1菌株的番茄植株，p1&v代表同时接种了bacillusvelezensisp1菌株和黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)的番茄植株；

图9为bacillusvelezensisp1菌株对连作番茄黄萎病发病率的影响，横坐标中ck代表未接种菌株的番茄植株，v代表接种黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)的番茄植株，p1代表接种bacillusvelezensisp1菌株的番茄植株，p1&v代表同时接种了bacillusvelezensisp1菌株和黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)的番茄植株；纵坐标为发病率(％)；

图10为分根系统中分离菌株对番茄黄萎病发病情况的影响，横坐标中ck代表对照，即一侧不进行植物根际促生菌(pgpr)处理，仅接种无菌水，其他代表不同菌株处理；

图11为bacillusvelezensisp1菌株在分根系统中对番茄根系防御酶活力的影响，横坐标中的时间代表病原菌处理后的时间；h代表对照，仅一侧接种黄萎病原菌，另一侧用无菌水处理；ph代表一侧进行bacillusvelezensisp1处理后，再在另一侧接种黄萎病原菌；

图12为bacillusvelezensisp1菌株在分根系统中对番茄根系防御进行相对表达的影响，横坐标中的时间代表病原菌处理后的时间；h代表对照，仅一侧接种黄萎病原菌，另一侧用无菌水处理；ph代表一侧进行bacillusvelezensisp1处理后，再在另一侧接种黄萎病原菌；

图13诱导植物系统抗性的pgpr菌株的筛选示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1.bacillusvelezensisp1菌株的筛选与鉴定。

本实施例中所用的na培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml，调节ph至7.4-7.6，液体培养基不加琼脂。

1)bacillusvelezensisp1的筛选：

采集黑龙江省哈尔滨市东北农业大学园艺站盆栽实验中、模拟田间连作种植的番茄根际土壤，采用抖根法收集根系表面土壤，按1g:9ml的土、水比制备土壤悬浮液，通过连续浓度梯度稀释，得到10^-3稀释浓度(即将悬浮液再稀释100倍)的土壤悬液。之后，将200μl土壤悬液涂布在20ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(na培养基)上，重复3个板，放于28℃恒温箱内培养48h，待各平板上长出单菌落后，挑取每个平板上的单菌落，进行纯化。之后进行大丽轮枝菌的平板对峙实验，具体方法为：将生长着大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)的6-mm(直径)琼脂块接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)，在距离琼脂块大约4cm处，使用无菌牙签，将纯化后的菌株进行接种，每个pda上接种4个。以不接种待测细菌的平板为对照，每处理重复3次。在28℃暗培养7天后，观测分离物对真菌菌丝的抑制情况。

本发明从番茄根际中共分离出7株菌株，编号分别为p1、p2、p8、p23、p33、p41，p44，在平板对峙实验中对大丽轮枝菌都具有较强的拮抗作用(图1)。

对分离的拮抗菌株进行pcr扩增并进行测序，将序列在ezbiocloud(www.ezbiocloud.net)进行序列相似性比对分析，并将获得的16srdna基因序列提交到genbank数据库获取序列登录号，并选择相关菌株进行系统发育树的构建(图2)。与菌株p8相似度最高菌株属于假单胞菌属，通过其形态、生理生化特性鉴定，初步鉴定为假单胞菌属细菌；而其余菌株的相似菌株都属于芽孢杆菌属，经多相分类鉴定，初步鉴定为芽孢杆菌属细菌(表1)。

从筛选的拮抗菌株中选择拮抗能力强的菌株作为演技对象，由于p1和p2对大丽轮枝菌的拮抗活力相似，此次仅选择p1作为研究对象。

2)bacillusvelezensisp1的鉴定：

对p1菌株进行生理生化测定，显示p1为革兰氏阳性菌，除v-p实验呈阳性外，接触酶实验、柠檬酸盐利用实验、甲基红实验呈阴性反应，结合形态特征观察(表1)，鉴定p1菌株为bacillusvelezensis菌株，命名为bacillusvelezensisp1。

表1分离菌株培养特征观察

注：革兰氏染色，“-”表示呈阴性，“+”表示呈阳性

实施例2.bacillusvelezensisp1实验室促生能力及拮抗潜力测定。

1)iaa产量测定

采用salkowski比色法测定实施例1筛选的p1菌株产iaa能力。在高压灭菌的20ml胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基(tsb：胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，用蒸馏水定容至1000ml，调节ph为7.2±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用)中加入过滤除菌的色氨酸溶液(最终浓度为100mg/ml)，并接种待测定菌株。

在28℃下，摇床培养48h。将发酵液于8000r.min^-1离心10min。取2ml上清液，加入50μl83％(10mm/l)的正磷酸，加入4mlsackowski’s显色剂，充分混合，于黑暗中25℃显色30min。在530nm波长下的吸光值，并用无菌培养基做对照，重复三次。在无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零，以浓度0、5、10、20、40、60、80、100mg/l的吲哚乙酸标准液同上做标准曲线，计算发酵液中吲哚乙酸的浓度。

2)溶磷测定

在nationalbotanicalresearchinstitutephosphate(nbrip)液体培养基(葡萄糖10g，ca3(po4)25g，mgcl2，6h2o5g，mgso4·7h2o0.25g，(nh4)2so40.1g，kcl0.2g，琼脂20g，去离子水1000ml，ph7.0～8.0)中，用钼锑抗比色法来测定细菌发酵液中的磷含量。

3)铁载体产生测定

使用cas蓝色琼脂培养基检测菌株产铁载体能力，观察细菌周围产生橘黄色菌圈，如图4所示，说明细菌可以产生铁载体。培养基制备方法如下：

溶液a:取0.079gcas溶于50ml去离子水中，并与10ml1mmol/lfecl3溶液混匀；溶液b:取0.069ghdtma溶于40ml去离子水中；染液c(cas)将a液缓慢加入b液中，充分混匀；高压灭菌。先配置好1mmol/l的cacl2溶液，1mmol/l的mgso4·7h2o溶液，10％的酸水解酪蛋白溶液，10％的pipes(sigma)缓冲液10ml。然后分别取10ml的cacl2溶液、mgso4·7h2o溶液，30ml的酸水解酪蛋白溶液，加入适量pipes(sigma)缓冲液(100μl/100ml)，用naoh调节ph至6.8-7.0。加去离子水450ml，总体积到500ml。加10g琼脂，和cas溶液一起高压灭菌。降温至60℃时，以5mlcas/100ml培养基，沿着三角瓶壁缓缓加入培养基(25ml/500ml)。混合均匀，不要产生气泡。将待测菌株接种到cas培养基上。

4)纤维素酶产生测定

使用0.1％w/vcmc-na，1.5％w/v琼脂和0.1m磷酸钠缓冲液(ph6)制备培养基，接种待测细菌，并在30℃下孵育16小时，之后用0.1％w/v刚果红的水溶液充满30分钟，然后倒掉污渍，用蒸馏水冲洗板(10秒)，然后用1m氯化钠洗涤两次(每次5分钟)，最后，将板在5％w/v乙酸中浸泡5分钟，以增强酶活性区和未改变的底物之间的对比度，结果如图5所示，透明圈越大，纤维素酶活性越大。

5)蛋白酶产生测定

为了测定酪蛋白水解，将1l的na培养基高压灭菌后，加入15.0ml高压灭菌过的脱脂牛奶，混合均匀后，以每个培养皿(直径9cm)20ml培养基的体积制备平板，待培养基凝固后，接种bacillusvelezensisp1，48h后向培养皿(平板)中加入2.0ml0.1mol/l的hcl溶液，观察到菌落周围存在的透明晕圈，如图6所示。

6)拮抗潜力测定

以bacillusvelezensisp1的总dna为模板，用引物fndf1/fndr1、bmbf2/bmbr2、srfaf1/srfar1、itucf1/itucr3为引物，检测芽孢杆菌合成fengycin、bacillomycin、surfactin、iturin的情况。pcr采用25μl体系，其中包括模板1μl，上下游引物各1μl，dd水14.7μl，pcrmix7.3μl。srfaf1/srfar1(srfa273bp)，itucf1/itucr3(ituc575bp)，bmbf2/bmbr2(bmyb395bp)三个基因的条件：95℃预变性4min；94℃变性1min，62℃退火1min，70℃延伸1min，30个循环，70℃终延伸持续5min。fndf1/fndr1(fend293bp)的退火温度为52℃，其他条件与另外三个抗生素的电泳条件一致，如图7所示。

结果如下：bacillusvelezensisp1的iaa产量为23.70μg/ml，对磷酸铝的溶解能力最高，为77.65mg/l，对磷酸铁的溶解度次于对磷酸铝的溶解，为29.46mg/l，其次为磷酸钙为21.48mg/l，且经pcr测定，显示bacillusvelezensisp1具有合成fengycin、bacillomycin、surfactin、iturin四种抗生素的潜力。

实施例3.bacillusvelezensisp1菌株的田间促生和拮抗功能的应用。

1)种子育苗及处理

将待种番茄种子农大708消毒后播种于番茄连作土中，模拟正常生长状态下的田间条件种植，进行以下几个处理(表2)，“ck”代表未接种菌株的番茄，“黄萎”代表接种黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)的番茄，p1代表接种bacillusvelezensisp1菌株的番茄，“p1&黄萎”代表同时接种了bacillusvelezensisp1菌株和黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)的番茄。

表2随机区组设计

2)bacillusvelezensisp1和病原菌的处理

将pda培养基在121℃，高压灭菌15min。将黄萎病病原菌(verticilliumdahliae)接种至培养基中。在黑暗中28℃下培养7天。将培养物通过双层纱布过滤。将分生孢子计入血红计数板，浓度调至10⁷分生孢子ml^-1。将上述分离物接种在灭菌的lb培养基中，于黑暗中28℃下培养48h，用酶标仪调节，使其吸光值(od600)为1。为了观察细菌分离物对植物生长的影响，定植后，在每株番茄根部浇灌吸光值(od600)为1的10ml细菌接种物，以接种同体积无菌水的处理为对照；7天后，接种病原菌孢子悬浮液10ml。每个处理3次重复，每次重复20盆。

3)发病率调查

自出现黄萎病病症时(接种后20天)，开始调查发病率并计算病情指数。每个重复随机调查10株，每株随机调查15片叶。发病率＝(发病叶数/调查总叶数)×100％

4)数据分析

原始试验数据采用office2016版本的系列软件(word、excel)进行整理；数据分析使用sas9.1版，方差分析采用tukey’shsd，在p<0.05水平下进行分析；图表制作使用office2016版本的word软件及graphpadprism7。

结果分析如下：

1)bacillusvelezensisp1菌株对连作番茄幼苗生长的影响

接菌处理20天后，测定对番茄生长的影响，接种bacillusvelezensisp1菌株的处理，如表2所示，增加最大的为地上部鲜重，增加了51％，其次为地上部干重增加了33％，株高增加了26％，茎粗增加15％，地下部鲜重也增加了10％，地下部干重与对照相比没有显著差异。由此可见，bacillusvelezensisp1菌株的处理促进了连作番茄的生长，具有显著提升番茄地上部生长的能力，如图8所示。

表3bacillusvelezensisp1菌株对番茄生长的影响(p<0.05)

2)bacillusvelezensisp1菌株对连作番茄黄萎病发病率的影响

接种bacillusvelezensisp1菌株离物的处理都降低黄萎病的发生。图8显示，与对照相比，p1处理降低了16％的发病率，与接种黄萎病处理相比，同时接种p1和黄萎病病原菌处理的发病率降低了23.6％。

以上结果表明，本发明从植物根际土中分离出的bacillusvelezensisp1菌株具有较高的促生能力，并能够分泌iaa、溶解磷酸盐、产生铁载体、产纤维素酶、产蛋白酶。连作番茄幼苗施用此菌后，显著提高了植株的地上部干鲜重、株高、茎粗和地下部鲜重，同时降低了黄萎病的发病率。因此，本发明筛选获得的贝莱斯芽孢杆菌能够有效缓解番茄的连作障碍，在番茄连作栽培中具有较好的应用前景。

实施例4.bacillusvelezensisp1诱导番茄系统抗性的能力。

1)诱导番茄系统抗性菌株的筛选

为了对比bacillusvelezensisp1诱导番茄系统抗性能力，选择了同时分离的其他菌株一起进行筛。选为避免pgpr与v.dahliae间的直接相互作用，采用分根法(split-root)，设置分根装置，以便在同一株番茄的不同根系上分别接种pgpr与v.dahliae。为促进番茄幼苗侧根生长以便进行分根，将番茄种子进行催芽，种子萌发露白后，将露出的种子胚根用消毒过的手术刀切除顶尖部分，获得番茄分根幼苗，然后将种子种植于装有灭菌土壤的营养钵中。待番茄长至4片真叶时，番茄幼苗定植于分根种植系统中：将番茄幼苗根系分为等量的两部分，分别种植于两个装有700g灭菌土壤的塑料盆中。

定植7d后，于分根装置的其中一侧的番茄根部浇灌20ml浓度为10⁷cfu/ml(od600值约为1)的pgpr悬浮液，以接种20ml无菌水为对照；5d后，在根部另一侧浇灌20ml浓度为10⁷cfu/ml的v.dahliae孢子悬浮液。共设2个处理：a)对照，一侧接种无菌水(h2o)，另一侧为病原菌处理(v.d)，b)处理，一侧接种pgpr悬浮液，另一侧为病原菌处理(v.d)病原菌处理。每处理3次重复，每重复20盆。按照实施例3所述方法，测定番茄的发病率，计算病情指数。示意图如图13所示。

2)番茄防御酶活性

前期植株处理如本例1)所述，共设2个处理：对照，一侧接种无菌水(h2o)，另一侧为病原菌处理(v.d)；处理，一侧接种bacillusvelezensisp1悬浮液(pgpr)，另一侧为病原菌处理(v.d)病原菌处理。每处理3次重复，每重复20盆。分别于接种v.dahliae后0、12、24、48、96h取番茄根系样品。将番茄两侧根系迅速洗净，并用蒸馏水冲洗3次。同一个处理的3株混在一起，每处理3次重复。一部分鲜样用于测定植株根系防御酶活性。一部分用锡纸包好，放于液氮中速冻后，-80℃保存，用于rna提取(trizol法)。

番茄防御酶活性的测定分别按照wang等(wangm，wuc，chengz，etal.growthandphysiologicalchangesincontinuouslycroppedeggplant(solanummelongenal.)uponrelayintercroppingwithgarlic(alliumsativuml.)[j].frontiersinplantscience，2015，6(262).)的方法测定苯丙氨酸解氨酶；按lever(leverm.anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates[j].analyticalbiochemistry，1972，47(1)：273-9.)的方法用dns显色方法进行β-1,3-葡聚糖酶酶活性测定。

3)根系防御基因的测定

用trizol提取番茄根系总rna，rna提取完成后进行反转录。经反转录后，将反转录的产物置于-20℃保存，用于根系防御基因的荧光定量测定。结合前文所述，本实验以actin基因为内参，进行定量pcr分析防御相关基因pr1、pr2、pal、lox等的表达情况。定量pcr反应于iq5real-timepcrsystem(bio-rad)上进行。具体引物及条件见表4。pcr循环反应完成之后进行熔解曲线分析，pcr终产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。每次pcr扩增均设不含模板的阴性对照。

表4引物设计

结果分析如下：

图10显示，分根实验中，与对照相比，6株菌株都可以降低黄萎病的发病率，bacillusvelezensisp1处理的番茄发病率，为47.67％，仅次于p2，说明bacillusvelezensisp1菌株可以提高番茄对黄萎病病原菌的抗性。萎病原菌进行侵染后，经bacillusvelezensisp1处理的番茄根系β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)在接菌后48hpi，显著高于仅接种黄萎病的处理，其他时间处理并没有显著差异。从接菌24hpi开始，p1处理的苯丙氨酸解氨酶(pal)活性均显著高于接种黄萎病菌的处理。

图11显示，接菌前，bacillusvelezensisp1处理(ph)的番茄根系与对照间的相关防御基因无显著差异。从12hpi到96hpi，p1处理的番茄根系中pr1和pr2两个基因的表达均显著高于对照，且分别于24hpi和96hpi达到最大。从24hpi到96hpi，p1处理番茄根系的pal基因的表达量一直显著高于对照，并在24hpi达到高峰。bacillusvelezensisp1处理lox基因的表达在12hpi、24hpi时显著高于对照，其他时间内无显著差异。

以上结果说明bacillusvelezensisp1菌株可在番茄受到外界病原体的侵染时，诱导番茄相关防御酶和基因相对表达增加，这有利于番茄抵御病害。

核苷酸序列表

<110>东北农业大学

<120>一种来自番茄根际可诱导系统抗性的芽孢杆菌及其筛选方法与应用

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