一种胚胎活检样本的转移方法与流程

本发明涉及胚胎活检技术领域，具体而言，涉及一种胚胎活检样本的转移方法。

背景技术：

胚胎植入前遗传学检查(pgt)包括胚胎植人前遗传学诊断(pgd)和胚胎植人前遗传学筛查(pgs)，作为一种更早期形式的产前诊断，pgt通过对辅助生殖周期中体外培养的胚胎细胞进行致病基因突变的检测或染色体异常的筛查，从而筛选优质胚胎，以提高辅助生殖成功率。目前pgt主要应用于单基因病检测、染色体异常、高龄女性、不明原因的反复自然流产、不明原因的反复种植失败等。随着我国“二孩政策”的放开，pgt在我国辅助生殖中的地位显得越来越重要。

pgt由胚胎活检、全基因组扩增、致病变异检测及检测结果判读四个步骤组成，其中胚胎活检是pgt的起始步骤，在决定着pgt技术能否顺利开展，而胚胎活检的难点在于活检产物的转移。如何将肉眼无法看见的几个到十几个细胞转移到pcr管的活检液中，是pgt急需解决的关键问题。目前胚胎活检常规采用icsi培养皿，在培养皿上做微滴，将胚胎放入微滴中，先通过显微操作系统将活检产物吸出后，再将icsi皿转移至体式显微镜下，通过口吸管或手吸管转移至ep管中。

但口吸管或手吸管主要是通过嘴或手加压而将活检玻璃针中活检产物吐出，容易造成随活检产物带入的液体较多。转移过程人为操作(通过手或嘴加压)，不稳定，容易造成活检产物丢失。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种胚胎活检样本的转移方法，该转移方法采用机械系统完成胚胎细胞的转移，全程可视，操作过程稳定可靠，不会造成胚胎细胞样本的丢失。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种胚胎活检样本的转移方法，其包括如下步骤：

步骤a：操作显微注射器以使安装在显微操作臂上的转移针对体视显微镜的载物台上的活检皿中的胚胎细胞样本进行吸取；

步骤b：将所述活检皿从所述体视显微镜的载物台上取下，将装有活检液的胚胎活检容器放至在所述载物台上；

步骤c：操作所述显微操作臂以控制所述转移针的针头浸入至所述胚胎活检容器内的活检液中；

步骤d：操作所述显微注射器以使所述转移针吸取的所述胚胎细胞样本释放至所述活检液中。

本发明提供的胚胎活检样本的转移方法，该转移方法通过操作显微注射器吸取或释放胚胎细胞样本，通过显微操作臂控制转移针的移动，代替现有的采用嘴或手加压方式，该转移过程更加稳定可靠，不易造成胚胎细胞样本的丢失，吸取或释放胚胎细胞样本在体式显微镜下进行，全程可视化操作，能够有效地避免将多余液体代入到活检液中，有利于提高检测结果的准确性。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述显微操作臂取自ri或narishige显微操作系统的显微操作臂。

本发明转移方法中所用的显微操作臂是将ri或narishige显微操作系统的显微操作臂拆下单独使用，使用时，将其放置于体视显微镜旁即可。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述显微注射器为ri显微注射，或者所述显微注射器为带有ri适配器的narishige或eppendorf显微注射器。

本发明转移方法中所用的显微注射器为市面上常规的显微注射器，使用时将其持针器部分安装到显微操作臂的相应安装位置即可。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述转移针通过转换头连接在所述显微注射器的持针器上。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述转移针的针头端内径为100-200μm，所述转移针的连接所述转换头的固定端的外径为0.8-1mm。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述转换头呈圆柱体结构，所述转换头的一端具有第一安装孔，另一端具有第二安装孔，所述转换头的内部具有连通所述第一安装孔和所述第二安装孔的气道；所述持针器的一端插入至所述第一安装孔中与所述转换头连接，所述转移针的固定端插入所述第二安装孔中与所述转换头连接。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述第一安装孔的直径为2-5mm；所述第二安装孔的直径为0.8-1mm。

需要说明的是，转移针可以利用巴斯德吸管或玻璃毛细管改进后制得，具体改进方法为：选用巴斯德吸管或玻璃毛细管，酒精灯上煅烧，待玻璃管软化后快速拉伸玻璃管，将中间烧断，选择合适直径位置，用一侧拉伸毛滴管轻磨另一侧毛细管尖端数次后，轻轻按压尖端至断裂，选取巴斯德吸管细端或玻璃毛细管长端作为本发明转移方法中所使用的转移针，毛细管头部内径为100-200μm。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述转换头的材质为硅胶。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述胚胎活检容器包括：ep管支架和放置在所述ep管支架上的ep管，所述ep管中装有所述活检液。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述ep管以与水平面呈20-40度的倾斜角度放置于所述ep管支架上。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述ep管以与水平面呈35度的倾斜角度放置于所述ep管支架上。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述ep管支架为培养皿经切割边缘后获得。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述活检液为市售的loadingbuffer液。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述活检液的体积为2μl。

当胚胎细胞样本释放到上述ep管后即完成了转移过程，接着，操作人员可将ep管取下进行后续步骤如进行基因组扩增、致病变异检测及检测结果判读等等。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述活检皿中具有至少一个显微操作滴，每个所述显微操作滴含有待活检的胚胎样本，胚胎样本为可以为受精卵、卵裂期胚胎或囊胚。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述显微操作滴盖有矿物油。

矿物油的作用防止水分蒸发，有利于维持胚胎细胞的活性。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，每个所述显微操作滴呈长条形。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，每个所述显微操作滴的体积为14-16μl。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述显微操作滴的数量为4个。

需要说明的是，显微操作滴的数量可以根据实际情况来配制。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述显微操作滴为市售的vitrolife’sgmops培养液。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，每个所述显微操作滴的一则具有呈圆形的两个洗针滴。

位于显微操作滴的旁边的两个圆形洗针滴的作用在于，转移针在吸取活检产物后，对转移针进行清洗，这时主要是用于去除黏附在转移针上的上一个活检胚胎的残存细胞，经过多次的清洗，可以避免不同胚胎间活检产物的交叉污染。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述圆形的洗针滴的体积为5-7μl。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述活检皿还具有一个长条形的洗针滴。

长条形的洗针滴的作用在于活检前清洗转移针，并在每次进行下一个胚胎活检前，将转移针在此滴中吸取少量pvp液，以减缓显微注射器抽吸液体的冲力。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述长条形的洗针滴。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述长条形的洗针滴的体积为10-16μl。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述圆形的洗针滴和所述长条形的洗针滴均为pvp溶液。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述pvp溶液的pvp浓度为0.8％-1.2％。

进一步地，进行步骤a之前，在吸取所述显微操作滴中的胚胎细胞样本之前，先将所述活检针的针头置于所述长条形的洗针滴中进行预洗涤，然后所述活检针的针头置于将所述显微操作滴一侧的两个所述圆形的洗针滴中的一个洗针滴中进行第一次洗涤，第一次洗涤后再吸取所述显微操作滴中的胚胎细胞样本，吸取所述胚胎细胞样本后，再将所述活检针的针头置于两个洗针滴中的另一个洗针滴中进行第二次洗涤。

经过充分的洗针后，可以尽可能地避免不同胚胎间活检产物的交叉污染。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述转移方法还包括：在进行步骤a之前，将所述活检皿置于37℃、不含co2的培养箱中进行平衡4小时以上。

平衡的作用在于，保证活检液的温度，尽量降低温度对胚胎发育的影响。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，平衡8-16小时。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，在进行步骤a之前，所述转移方法还包括：将转移皿置于所述载物台上，再操作所述显微操作臂以控制所述转移针的针头浸入所述转移皿上的由pvp液制作的洗针滴中，吸取0.1-0.5μlpvp液；然后再将所述转移皿从所述载物台下取下，将所述活检皿置于所述载物台上以进行后续步骤。

进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述转移皿中具有4列洗针滴，每列洗针滴中具有4个呈圆形的洗针滴；第一列和第二列的洗针滴的pvp浓度为6％-8％，第三列和第四列的洗针滴的pvp浓度为0.8％-1.2％。优选地，所述转移皿中的每个呈圆形的洗针滴的体积为5-7μl。

第一列洗针滴的作用在于清洗转移针头上的矿物油，避免矿物油杂质代入到ep管，避免杂质影响后续的pcr扩增结果，第二列洗针滴作用在于减缓显微注射器抽吸液体的冲力，第三列和第四列的洗针滴的作用是降低过高浓度pvp对后续扩增结果的影响。

需要注意的是，在使用过程中，转移皿即配即用，不加盖矿物油。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例中的硅胶转换头的第一视角的结构示意图。

图2为实施例中的硅胶转换头的第二视角的结构示意图。

图3为实施例中的硅胶转换头的剖面结构示意图。

图4为实施例中的活检皿上的显微操作滴和洗针滴的位置关系示意图。

图5为实施例中的转移皿上的洗针滴的位置关系示意图。

图6为普通培养皿经改造后的作为ep管支架的照片。

图7为图6放置ep管后的照片。

图中标记：硅胶转换头-100；第一安装孔-110；第二安装孔-120；气道-130。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的胚胎活检样本的转移方法，其包括如下步骤：

1、准备步骤

(a)显微操作臂：

采用ri或narishige显微操作系统，将显微操作系统单侧显微操作臂拆下，备用。

(b)显微注射器：

采用ri、narishige或eppendorf等市售油压或气压显微注射器，将注射器持针器头部卸下，加装硅胶转换头，备用。

其中，硅胶转换头的结构如图1-图3所示，硅胶转换头100的一端具有第一安装孔110，另一端具有第二安装孔120，硅胶转换头100的内部具有连通第一安装孔110和第二安装孔120的气道130(参考图3)。持针器的一端插入至第一安装孔110中与述转换头连接，第二安装孔120用于安装转移针。

其中，第一安装孔的直径约为2-5mm；第二安装孔的直径约为0.8-1mm。

(c)转移针

选用玻璃毛细管，酒精灯上煅烧，待玻璃管软化后快速拉伸玻璃管，将中间烧断，选择合适直径位置，用一侧拉伸毛滴管轻磨另一侧毛细管尖端数次后，轻轻按压尖端至断裂，选取玻璃毛细管长端备用，作为转移针，长度40-80mm，固定端的外径0.8-1mm，与硅胶转换头第二安装孔相匹配，针头端内径100-200μm，备用。

在其他的实施例中，可使用巴斯德吸管按上述方法制作。

(d)胚胎活检容器

取35mm胚胎培养皿一个，将皿底和皿盖一侧切除至刚好插进ep管，通过控制切除培养皿边沿高度来控制插入ep管后角度，插入后角度为20-40度，优选为35度。改进后的培养皿充当ep管支架的作用。ep管内用移液枪加入2μl活检液，备用。改进后的培养皿的照片见图6和图7。

(e)活检皿

取icsi皿(falcon3001小皿)一个，在皿底、皿盖上标记患者姓名、培养液种类和日期，用微量加样枪在中央做数列长条形显微操作滴(市售的vitrolife’sgmops培养液，体积为15μl)，每个长条形显微操作滴的右侧设置两个圆形pvp洗针滴(pvp浓度为1％，体积为6μl)，活检皿最上方做一长条形pvp洗针滴(pvp浓度为1％，体积为15μl)，盖上矿物油，置于在37℃无二氧化碳培养箱中平衡4小时以上。

准备好的活检皿的各滴的位置示意图如图4所示。根据实际需要，显微操作滴中加载胚胎活检产物即受精卵、卵裂期胚胎或囊胚，即需要活检的样本。

(f)转移皿

取icsi皿(falcon3001小皿)一个，在皿底、皿盖上标记患者姓名、培养液种类和日期，用微量加样枪在皿中央数行圆形pvp洗针滴，共4行，每行4个，无矿物油，即配即用。转移皿左侧两列洗针滴的pvp浓度为7％，右侧两列洗针滴的pvp浓度为1％，各洗针滴大小为6μl，所述转移皿即配即用，不加盖矿物油。

准备好的转移皿的各滴的位置示意图如图5所示。

(g)转移系统的组装

移动显微操作臂至体视显微镜旁边，将转移针的固定端插入到硅胶转换头的第二安装孔中，进而将其安装在显微注射器的持针器上，持针器安装于显微操作臂上，调节合适的高度和位置，使转移针针尖正好位于体视显微镜正中央，通过调节显微操作臂可以使转移针针尖将至体视显微镜观察面最底部。

2、转移步骤

(1)将转移皿放置在体视显微镜的载物台上，通过显微操作臂降低转移针至转移皿的含7％pvp的洗针滴中，通过斜向调节和移动显微操作臂，进一步确定转移针针尖正好位于体视显微镜正中央，吸取少量pvp液后，升起显微操作臂。

(2)将转移皿从体视显微镜取下，将活检皿放置于在体视显微镜的载物台下，胚胎活检在活检皿的显微操作滴中进行。高倍镜下找到显微操作滴中的胚胎活检产物，并通过移动活检皿，将胚胎活检产物移动至视野中央。

低倍镜下，操作显微操作臂降低转移针针尖至活检皿上方的长条形洗针滴中，进行洗针；然后操作显微操作臂使转移针针尖移动至目标显微操作滴旁边的一个圆形洗针滴中，进行洗针；

然后，高倍镜下，调节显微操作臂上下和斜向移动持针器来进一步调节至转移针针尖位于胚胎活检产物旁，轻轻旋转显微注射器的旋钮，使胚胎活检产物回吸至转移针中，注意尽可能少的带进液体。

然后，低倍镜下，调节显微操作臂使转移针针尖移动至目标显微操作滴旁边的另一个圆形洗针滴中，进行洗针。

(3)将活检皿从体视显微镜取下，将上述胚胎活检容器放置在体视显微镜的载物台上，调节显微视野可以清晰看到ep管内活检液，低倍镜下，通过上下调节显微操作臂，配合左右移动ep管支架，以使将转移针针尖浸入pcr管活检液中，轻轻旋转显微注射器，视野下，使转移针中的胚胎活检产物释放至活检液中，操作时尽可能少的带进液体。一个ep管放置一个胚胎活检产物。

(4)如果需要继续转移活检皿中的其他胚胎活检产物，可重复上述步骤(2)-(3)，并注意更换新的转移针和使用新的ep管来装新的胚胎活检产物。

(5)转移完成后的ep管，可用于到后续的pcr扩增、致病变异检测及检测结果判读等步骤。

综上，本发明实施例提供的胚胎活检样本的转移方法，该转移方法通过操作显微注射器吸取或释放胚胎细胞样本，通过显微操作臂控制转移针的移动，代替现有的采用嘴或手加压方式，该转移过程更加稳定可靠，不易造成胚胎细胞样本的丢失，吸取或释放胚胎细胞样本在体式显微镜下进行，全程可视化操作，能够有效地避免将多余液体代入到活检液中，有利于提高检测结果的准确性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。