人皮肤成纤维细胞及其制备方法与流程

本发明涉及干细胞与再生医学领域，特别是涉及一种人皮肤成纤维细胞及其制备方法。

背景技术：

人皮肤主要分为角质层、表皮层和真皮层，皮肤成纤维细胞(fbs)是皮肤真皮层中的主要细胞，皮肤成纤维细胞能合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层黏蛋白等细胞外基质。这些细胞外基质不仅在细胞间起机械支撑和连接的作用，还起到细胞信号转导桥梁的作用，参与细胞的生理和病理过程。因此，关于人皮肤成纤维细胞的研究越来越受到人们的重视。

目前，分离纯化皮肤成纤维细胞的方法主要是组织块培养法和酶消化法。组织块培养法主要是将新鲜皮肤组织洗净、剪碎、离心，然后用培养基重悬培养。酶消化法主要是将新鲜皮肤组织洗净、剪碎、胰酶消化、清洗，然后用培养基重悬细胞进行培养。

但是，现有的分离纯化方法存在一些缺陷，例如，(1)组织块培养法培养过程中，细胞会爬出并贴壁生长，使得细胞数量不足，而且贴壁生长会受到其他贴壁细胞的影响而导致细胞纯度不够；(2)酶消化法消化过程中，消化液无差别地消化细胞间质，使得细胞脱落，导致大量杂细胞进入培养基，使得细胞系不纯，而且酶消化程度难以把握，容易损伤细胞活性。

因此，研究和开发一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，以获取高数量、高纯度的人皮肤成纤维细胞，具有重要意义。

技术实现要素：

基于此，有必要针对现有分离纯化人皮肤成纤维细胞的方法效率低、纯度低的问题，提供一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，能够得到高数量、高纯度的人皮肤成纤维细胞。

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：

预处理：采集耳后皮肤组织，分离真皮层组织，用组织清洗液清洗干净后剪碎成组织碎块；

第一次消化：将组织碎块与组织消化液i混合，消化，消化后加入组织清洗液清洗并离心，去除上清液，保留沉淀；其中，组织消化液i为包含中性蛋白酶和dna酶的生理盐水，

第二次消化：将第一次消化后保留的沉淀和组织消化液ii混合，消化，加入胰蛋白酶，继续消化；其中，组织消化液ii为包含i型胶原酶和dna酶的dnem培养基；

终止消化：加入终止液终止消化，筛去组织块，离心，去除上清液，保留沉淀；

培养：用选择性培养基重悬沉淀，分装培养，即得人皮肤成纤维细胞。

皮肤组织中基底层连接表皮层和真皮层，分离真皮层组织时或多或少会粘连基底层，可能引入其它种类细胞，本发明使用的组织消化液i中含有中性蛋白酶，中性蛋白酶能有效消化基底层中的桥粒和锚丝成分，使上皮层和皮下层分离，通过清洗可以去除大部分上皮层，同时还可避免后续胰蛋白酶消化给皮下层细胞造成的损伤。

胶原蛋白是皮肤中主要的结构蛋白，人皮肤中有四种胶原蛋白，即i、iii、iv和vi型胶原蛋白，其中i型和iii型胶原蛋白主要分布在真皮层，ⅳ型和ⅵ型胶原蛋白主要分布在基底膜。正常成人皮肤真皮层中i型胶原蛋白的含量约为70％，iii型胶原蛋白的含量约为30％。针对皮肤中胶原蛋白的分布情况，本发明使用含有i型胶原酶的组织消化液ii，i型胶原酶能消化真皮层中的i型胶原，高效地将位于真皮层中的皮肤成纤维细胞分离出来，并且减少其它细胞混入，提高了获得的人皮肤成纤维细胞的数量和纯度，保留了细胞的活性，有利于成纤维细胞扩增及后期临床应用。

上述制备方法，采用两步消化，能有效地分离人皮肤成纤维细胞，减少了其它细胞的混入，提高了细胞的数量和纯度，本发明使用的组织消化液能保护细胞不受过度消化的伤害，保留了细胞的活性。

在其中一个实施例中，所述预处理步骤具体为，采集耳后皮肤组织后，加入组织保护液并冷藏于4±1℃进行运输和保存，使用时，取出，用温度为4±1℃的组织清洗液清洗组织2～3次，剪碎成0.5～2mm³的组织碎块备用。

在其中一个实施例中，所述组织保护液和组织清洗液均为包含硫酸庆大霉素和两性霉素b的生理盐水，其中，硫酸庆大霉素的浓度为20～30μg/ml，两性霉素b的浓度为4～6μg/ml。

在其中一个实施例中，所述第一次消化步骤中：消化时间为25～35min，组织消化液i的加入量为0.5～3.0ml/g组织碎块。优选地，组织消化液i的加入量为1.0ml/g组织碎块。

在其中一个实施例中，所述组织消化液i中，中性蛋白酶的浓度为90～110mg/ml，dna酶的浓度为8～12mg/ml。

在其中一个实施例中，所述第二次消化步骤具体为：向第一次消化后保留的沉淀中加入组织消化液ii，在37±1℃下震荡消化50～70min，转速为140～160rpm，加入胰蛋白酶，继续震荡消化12～18min；其中，组织消化液ii的加入量为0.5～3.0ml/g组织碎块，胰蛋白酶的加入量为0.5～3.0ml/g组织碎块。优选地，组织消化液ii的加入量为0.5ml/g组织碎块，胰蛋白酶的加入量为1.0ml/g组织碎块

在其中一个实施例中，所述组织消化酶ii中，i型胶原酶的浓度为2.5～3.5mg/ml，dna酶的浓度为0.2～0.4mg/ml。

在其中一个实施例中，所述终止消化步骤具体为：加入终止液终止消化，过100μm滤网去除组织块，收集细胞悬液，离心4～6min，离心转速为900～1100rpm，去除上清液，保留沉淀，加入rpmi1640清洗沉淀，离心4～6min，去除上清液，保留沉淀。

在其中一个实施例中，所述培养步骤中具体为，用选择性培养基将第二次消化后的沉淀重悬，分装至培养瓶中，培养至融合度为75％～85％，进行传代培养，其后每2.5～3.5天传代一次，传代比例为1:(3.5～4.5)。

在其中一个实施例中，所述选择性培养基为包含bfgf和egf的rpmi1640培养基。其中，bfgf和egf的浓度分别为20ng/ml和25ng/ml。

本发明一方面还提供一种由上述方法制备得到的人皮肤成纤维细胞。本发明得到的人皮肤成纤维细胞数量高、纯度高、活性好。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的制备方法，采用两步消化，能有效分离人皮肤成纤维细胞，减少了其它细胞的混入，提高了细胞的数量和纯度，本发明使用的组织消化液能保护细胞不受过度消化的伤害，保留了细胞的活性。

附图说明

图1为实施例1制备得到的p3代人皮肤成纤维细胞图；

图2为对比例1制备得到的p3代人皮肤成纤维细胞图；

图3为对比例2制备得到的p3代人皮肤成纤维细胞图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)采集：采集青壮年人耳后皮肤组织，加入组织保护液，冷藏于4℃的无菌环境下运输至实验室；其中，组织保护液为包含硫酸庆大霉素和两性霉素b的生理盐水，硫酸庆大霉素的浓度为25μg/ml，两性霉素b的浓度为5μg/ml；

2)预处理：在无菌环境下，取出1g皮肤组织，尽量分离真皮层组织，用预冷至4℃的组织清洗液清洗组织3次，剪碎成0.5～2mm³的组织碎块备用；其中，组织清洗液为包含硫酸庆大霉素和两性霉素b的生理盐水，硫酸庆大霉素的浓度为25μg/ml，两性霉素b的浓度为5μg/ml；

3)第一次消化：向组织碎块中加入30ml组织消化液i，在4℃消化30min，消化后加入组织清洗液清洗，离心5min，离心转速为800rpm，去除上清液，保留沉淀，用组织保护液清洗沉淀2次；其中，组织消化液i为添加中性蛋白酶和dna酶的生理盐水，中性蛋白酶的浓度为100mg/ml，dna酶的浓度为10mg/ml；

4)第二次消化：向第一次消化后保留的沉淀中加入30ml组织消化液ii，37℃下震荡消化1h，转速为150rpm，然后加入0.05vt％胰蛋白酶继续震荡消化15min；其中，组织消化液ii为添加i型胶原酶和dna酶的dnem培养基，i型胶原酶的浓度为3mg/ml，dna酶的浓度为0.3mg/ml；

5)终止消化：加入与胰蛋白酶等量的终止液终止消化，过100μm滤网筛去组织块，收集细胞悬液，离心5min，离心转速为1000rpm，去除上清液，保留沉淀，加入40mlrpmi1640重悬，离心5min，离心转速为1000rpm，去除上清液，保留沉淀；

6)培养：向上一步得到的沉淀中加入选择性培养基，分装至培养瓶中进行培养，培养7～10天达到融合度80％，进行传代培养，其后每三天传代一次，传代比例为1:4；其中，选择性培养基为包含bfgf和egf的rpmi1640培养基；

7)观察细胞形态：取p3代的人皮肤成纤维细胞，观察细胞形态。

实施例2

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，组织消化液i中，中性蛋白酶的浓度为90mg/ml，dna酶的浓度为12mg/ml；组织消化液ii中，i型胶原酶的浓度为2.5mg/ml，dna酶的浓度为0.4mg/ml。

实施例3

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，组织消化液i中，中性蛋白酶的浓度为110mg/ml，dna酶的浓度为8mg/ml；组织消化液ii中，i型胶原酶的浓度为3.5mg/ml，dna酶的浓度为0.2mg/ml。

对比例1

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，第二次消化步骤中，使用的组织消化液ii为包含ii型胶原酶和dna酶的dmem培养基，ii型胶原酶的浓度为3mg/ml，dna酶的浓度为0.3mg/ml。

对比例2

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，培养步骤中，使用dmem培养基代替选择性培养基培养细胞。

对比例3

一种人皮肤成纤维细胞的制备方法，与实施例1的区别在于，第二次消化步骤中，使用的组织消化液ii为包含iv型胶原酶和dna酶的dmem培养基，iv型胶原酶的浓度为3mg/ml，dna酶的浓度为0.3mg/ml。

实验例1

用细胞计数仪对实施例和对比例制备的p3代人皮肤成纤维细胞进行计数结果如表1所示：

表1人皮肤成纤维细胞数量

从表1可见，相比于对比例，采用本发明的方法得到的人皮肤成纤维细胞数量更多。

实验例2

用显微镜观察实施例和对比例制备的p3代人皮肤成纤维细胞的细胞形态，结果如图1～3所示。人皮肤成纤维细胞的胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。图1～3中，图1的细胞形态最好，纯度最高，图2中细胞数量相对较少。对比例2培养细胞时使用的是dmem培养基，细胞容易结团生长，加速细胞老化(如图3所示)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。