用于子宫内膜癌诊断的试剂盒以及应用的制作方法

本发明涉及基因检测
技术领域：
，具体而言，涉及用于子宫内膜癌诊断的试剂盒以及应用。
背景技术：
：子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，好发于围绝经期及绝经后的妇女，近年来呈年轻化趋势，早期(ⅰ期、ⅱ期)子宫内膜癌患者的五年生存率达70％以上，ⅲ期患者的五年生存率约为40-50％，而ⅳ期患者的五年生存率仅为15-20％。因此，实现子宫内膜癌的早期诊断是改善患者预后的重要举措。子宫内膜癌的早期诊断方法有诊断性刮宫、细胞学检查、经阴道超声和宫腔镜检查等，但这些诊断方法均存在一定的弊端。临床诊断主要依靠诊断性刮宫，该方法取样有创伤，哺乳期或浸润型子宫内膜癌人群子宫壁薄弱，刮宫时可能造成子宫穿孔，给患者造成伤害；细胞学检查最接近筛查策略，但当前缺乏统一的细胞学标准；经阴道超声无法确定子宫内膜病变时内膜厚度的界值；宫腔镜检查费用高昂，且单独运用诊断价值有限。因此，子宫内膜癌早期检测亟需一种准确度高、方便且侵入性小的检测方法。近年来，基因诊断成为体外诊断行业新的发展趋势。基因诊断，又称为dna诊断或分子诊断，是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，继而做出诊断的技术。鉴于目前子宫内膜癌诊断方法存在的以上缺陷，基因诊断可提供一种更为方便和准确的方法。目前临床上使用的肿瘤标志物主要为糖链抗原ca125和人附睾蛋白4，但其灵敏度较低，且在卵巢上皮性肿瘤、子宫内膜异位症、消化系统肿瘤等疾病中均可检测到ca125水平升高，此种检测方法的特异性也较低。dna甲基化是一种常见的表观遗传修饰，在dna甲基转移酶催化下，利用s-腺苷甲硫氨酸提供的甲基，将胞嘧啶的第五位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，其对基因的表达调控发挥至关重要的作用。dna甲基化作为基因诊断的手段之一，与癌症的发生有着密切的关系，在多种癌症中均发现存在dna甲基化异常的现象。dna甲基化具有稳定性的特点，并且是癌症发生的早期事件。近年来许多研究表明，dna甲基化异常可以作为一种癌症诊断的生物标志物。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供用于子宫内膜癌诊断的试剂盒以及应用。本发明的试剂盒是以znf454基因为靶点，通过检测其甲基化，用于子宫内膜癌的诊断，具有更高的灵敏度和特异性，为子宫内膜癌的临床诊断和用药提供更可靠的参考依据。本发明是这样实现的：第一方面，本发明实施例提供一种用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其含有用于检测第一靶基因甲基化的第一试剂；其中，上述第一靶基因为znf454基因。znf454基因编码锌指蛋白，可作为转录因子调控靶基因的转录，znf454基因位于人类第5号染色体上，对应于人类基因组grch38/hg38版本的chr5:178941198-178966433区域，znf454蛋白包含可使靶基因沉默的krab结构域，该结构域的长度为71个氨基酸。本发明的研究发现，以znf454基因作为靶点，通过检测该基因的甲基化来对子宫内膜癌进行诊断，其灵敏度和特异性较现有技术均有提高。本发明提供的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其含有用于检测第一靶基因甲基化的第一试剂；其中，第一靶基因为znf454基因。该试剂盒可以检测znf454基因的甲基化，检测结果可以用于子宫内膜癌的诊断，具有更高的灵敏度和特异性(如，灵敏性和特异性分别为97.87％和97.83％，roc曲线下面积为0.976)，为子宫内膜癌的临床诊断和用药提供更可靠的参考依据。在可选的实施方式中，上述第一试剂所检测的第一靶区域选自znf454基因chr5:178940620-178941724的全长区域或其中的部分区域。本发明的研究还发现，甲基化的区域跟子宫内膜癌的发生有密切关系，以不同区域的甲基化作为检测的靶区域，均可以提高子宫内膜癌诊断的灵敏度和特异性。当以第一靶区域chr5:178940620-178941724的全长区域或部分区域为检测靶标时，灵敏度和特异性较现有技术均有提高。优选地，第一靶区域选自如下区域中的至少一种：chr5:178940652-178940721、chr5:178940714-178940969、chr5:178940947-178941083、chr5:178941052-178941201、chr5:178941184-178941317、chr5:178941298-178941426、chr5:178941411-178941541和chr5:178941524-178941676。以上述区域作为靶区域，对子宫内膜癌进行诊断，灵敏度和特异性较高。更优选地，第一靶区域为chr5:178940947-178941083。基于本发明的前述内容，本领域技术人员容易想到采用多种方法和相应的试剂检测靶区域的甲基化。本发明提供的第一靶区域的甲基化检测方法包括但不限于如下方法：甲基化特异性pcr(msp)、定量甲基化特异性pcr(qmsp)、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量法。优选地，本发明的第一试剂适用于采用msp法检测znf454基因的甲基化。当然，需要说明的是，采用其他甲基化检测方法的相应试剂进行针对chr5:178940620-178941724的全长或部分区域的甲基化检测，也是属于本发明的保护范围。优选地，所述第一试剂包括：第一引物对和第一探针；所述第一引物对的碱基序列如seqidno.7-8所示，所述第一探针的碱基序列如seqidno.9所示。第一引物对和第一探针检测对应检测的第一靶区域为chr5:178940947-178941083。在可选的实施方式中，上述试剂盒还包括用于检测第二靶基因甲基化的第二试剂；其中，上述第二靶基因为cdo1基因。cdo1基因位于人类染色体grch38/hg38版本的chr5:115804733-115816708区域，编码半胱氨酸双加氧酶-1，在哺乳动物中高度保守，参与半胱氨酸水平的调节和牛磺酸的合成。本发明的研究还发现，相较于以单独znf454基因作为子宫内膜癌诊断的甲基化检测靶基因，以znf454基因与cdo1基因联合或组合作为甲基化检测的靶基因，即综合考虑znf454基因与cdo1基因的甲基化检测结果，可以进一步提高子宫内膜癌诊断的灵敏度和特异性(例如，灵敏性和特异性分别为98.18％和97.26％，roc曲线下面积为0.992)。在可选的实施方式中，上述第二试剂所检测的第二靶区域选自cdo1基因的chr5:115815652-115817016的全长区域或其中的部分区域。当以第二靶区域chr5:115815652-115817016的全长区域或部分区域为检测靶标时，灵敏度和特异性较现有技术均有提高。优选地，第二靶区域选自如下区域中的至少一种：chr5:115815669-115815784、chr5:115815768-115815908、chr5:115815885-115816079、chr5:115816060-115816220、chr5:115816195-115816357、chr5:115816338-115816468、chr5:115816448-115816573、chr5:115816536-115816750、chr5:115816687-115816795和chr5:115816779-115816963。以上述区域作为第二靶区域，与前述的第一靶区域组合，可以提高子宫内膜癌检测的灵敏度和特异性。更优选地，第二靶区域为chr5:115816448-115816573。基于本发明的前述内容，本领域技术人员容易想到采用多种方法和相应的试剂检测靶区域的甲基化。本发明提供的第一靶区域包括但不限于适用于采用如下方法进行甲基化检测：甲基化特异性pcr(msp)、定量甲基化特异性pcr(qmsp)、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量法。优选地，所述第二试剂适用于采用甲基化特异性pcr法检测cdo1基因的甲基化。优选地，所述第二试剂包括：第二引物对和第二探针；所述第二引物对的碱基序列如seqidno：43-44所示，所述第二探针的碱基序列如seqidno：45所示。另外，本发明的试剂盒所检测的样本类型包括但不限于子宫内膜组织和子宫内膜细胞，所有包含子宫内膜来源基因组的样本均可以作为该试剂盒的检测样本。第二方面，本发明实施例提供检测靶基因甲基化的试剂在制备用于子宫内膜癌诊断的试剂盒中的应用，上述靶基因包括znf454基因。本发明的研究发现，以znf454基因作为靶点，通过检测该基因的甲基化来对子宫内膜癌进行诊断，其灵敏度和特异性较现有技术均有提高。基于此，检测该znf454基因甲基化的试剂可以用于制备子宫内膜癌诊断的试剂盒，为检测znf454基因甲基化的试剂提供一种新的用途。在可选的实施方式中，上述试剂包括检测znf454基因甲基化的第一试剂，上述第一试剂所检测的第一靶区域选自znf454基因的chr5:178940620-178941724的全长区域或其中的部分区域。在可选的实施方式中，所述第一靶区域选自如下区域中的至少一种：chr5:178940652-178940721、chr5:178940714-178940969、chr5:178940947-178941083、chr5:178941052-178941201、chr5:178941184-178941317、chr5:178941298-178941426、chr5:178941411-178941541和chr5:178941524-178941676。在可选的实施方式中，所述第一靶区域选自chr5:178940947-178941083。在可选的实施方式中，上述第一靶区域适用于采用如下方法进行甲基化检测：甲基化特异性pcr(msp)、定量甲基化特异性pcr(qmsp)、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量法；在可选的实施方式中，上述第一试剂适用于采用msp法检测znf454基因的甲基化。在可选的实施方式中，所述第一试剂适用于采用甲基化特异性pcr检测znf454基因的甲基化。在可选的实施方式中，所述第一试剂包括：第一引物对和第一探针；所述第一引物对的碱基序列如seqidno.7-8所示，所述第一探针的碱基序列如seqidno.9所示。在可选的实施方式中，上述靶基因还包括cdo1基因。在可选的实施方式中，上述试剂包括检测cdo1基因甲基化的第二试剂，上述第二试剂所检测的第二靶区域选自cdo1基因的chr5:115815652-115817016的全长区域或其中的部分区域；优选地，所述第二靶区域选自如下区域中的至少一种：chr5:115815669-115815784、chr5:115815768-115815908、chr5:115815885-115816079、chr5:115816060-115816220、chr5:115816195-115816357、chr5:115816338-115816468、chr5:115816448-115816573、chr5:115816536-115816750、chr5:115816687-115816795和chr5:115816779-115816963在可选的实施方式中，所述第二靶区域选自chr5:115816448-115816573。在可选的实施方式中，上述第二靶区域适用于采用如下方法进行甲基化检测：甲基化特异性pcr(msp)、定量甲基化特异性pcr(qmsp)、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量法。在可选的实施方式中，所述第二试剂适用于采用甲基化特异性pcr法检测cdo1基因的甲基化。在可选的实施方式中，所述第二试剂包括：第二引物对和第二探针；所述第二引物对的碱基序列如seqidno：43-44所示，所述第二探针的碱基序列如seqidno：45所示。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为利用znf454的8个甲基化区域区分子宫内膜癌组织和癌旁正常组织的roc曲线；图2为利用znf454的8个甲基化区域区分子宫内膜癌脱落细胞和子宫内膜正常脱落细胞的roc曲线；图3为利用znf454与bhlhe22、cdo1和celf4及其组合区分子宫内膜癌组织和癌旁正常组织的roc曲线；图4为利用znf454与bhlhe22、cdo1和celf4及其组合区分子宫内膜癌脱落细胞和子宫内膜正常脱落细胞的roc曲线；图5为利用znf454与cdo1的10个甲基化区域分别组合区分子宫内膜癌组织和癌旁正常组织的roc曲线；图6为利用znf454与cdo1的10个甲基化区域分别组合区分子宫内膜癌脱落细胞和子宫内膜正常脱落细胞的roc曲线；图7为znf454基因中各靶区域的位置关系示意图；图8为cdo1基因中各靶区域的位置关系示意图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其包括含有用于检测第一靶基因甲基化的第一试剂和检测第二靶基因甲基化的第二试剂；其中，第一靶基因为znf454基因(chr5:178940620-178941724)，第一靶基因其中一条dna单链的碱基序列如seqidno.58所示。第二靶基因为cdo1基因(chr5:115815652-115817016)，第二靶基因其中一条dna单链的碱基序列seqidno.59所示。需要说明的是，无论是用何种方法检测上述znf454和cdo1基因任意一条链的全长或其中部分区域的甲基化用于子宫内膜癌的诊断，均属于本发明的保护范围。第一试剂为适用于采用msp法检测znf454基因甲基化的试剂，第一试剂检测的第一靶区域为选自chr5:178940620-178941724的部分区域，具体为chr5:178940652-178940721、chr5:178940714-178940969、chr5:178940947-178941083、chr5:178941052-178941201、chr5:178941184-178941317、chr5:178941298-178941426、chr5:178941411-178941541或chr5:178941524-178941676。各部分区域的位置结构关系见图7。第二试剂为适用于采用msp法检测cdo1基因甲基化的试剂，第二试剂检测的第二靶区域为选自chr5:115815652-115817016的部分区域，具体为chr5:115815669-115815784、chr5:115815768-115815908、chr5:115815885-115816079、chr5:115816060-115816220、chr5:115816195-115816357、chr5:115816338-115816468、chr5:115816448-115816573、chr5:115816536-115816750、chr5:115816687-115816795或chr5:115816779-115816963。各部分区域的位置结构关系见图8。第一试剂包括第一引物对和第一探针，检测上述各种第一靶区域的第一引物对和第一探针的序列见表1。第二试剂包括第二引物对和第二探针，检测上述各种第二靶区域的第二引物对和第二探针的序列见表2。表1.检测znf454各甲基化区域的第一引物对和第一探针的碱基序列表2.检测cdo1各甲基化区域的第二引物对和第二探针的碱基序列其中，本实施例检测上述靶区域的所用检测试剂是本领域任何能够实现上述靶区域甲基化检测的试剂。另外，在其他的实施例中，试剂盒还包括如下组分：pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps和mg2+离子等。实施例2本实施例提供的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其包括含有用于检测第一靶基因甲基化的第一试剂和检测第二靶基因甲基化的第二试剂；其中，第一靶基因为znf454基因，第二靶基因为cdo1基因。第一试剂为适用于采用msp法检测znf454基因的甲基化试剂，其检测的甲基化区域为chr5:178940947-178941083。第一试剂包括如下第一引物对和第一探针：正向引物：aagcgaacggaacggaat(seqidno：7)；反向引物：aatactaccttacgcctacga(seqidno：8)；探针：ccctccacgccgacctcaac(seqidno：9)。第二试剂为适用于采用msp法检测cdo1基因的甲基化试剂，其检测的甲基化区域为chr5:115816448-115816573。第二试剂包括如下第二引物对和第二探针：正向引物：gagttgagcgagttaagga(seqidno：43)；反向引物：tactatctctacgacgacatc(seqidno：44)；探针：taacgatctaacgaactatt(seqidno：45)。实施例3本实施例采用实施例1或2的试剂盒进行子宫内膜癌诊断的方法，其包括如下步骤：(1)dna提取和转化：提取患者子宫内膜细胞或组织中的dna，对获得的dna进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐转化处理，具体操作步骤参照武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂盒(货号aa09)说明书；(2)msp检测：对经步骤(1)提取并转化后获得的dna，采用msp方法对znf454或其与cdo1的组合的甲基化敏感位点进行检测，β-actin作为内参基因，其中β-actin的引物和探针如seqidno：55-57所示：正向引物：caagatgagattggcatggct(seqidno：55)；反向引物：tgtgaactttgggggatgctc(seqidno：56)；探针：ccagtttttaaatcctgagtcaagc(seqidno：57)。优化的pcr条件见表3。znf454的8个甲基化区域(表1)和cdo1的10个甲基化区域(表2)中的任何一个区域均可作为检测靶点，特异性引物和探针参照实施例1中该区域对应的碱基序列，优化的pcr体系见表4。以znf454和cdo1的组合的甲基化敏感区域作为检测靶点时，特异性引物和探针参照实施例2中该区域对应的碱基序列，优化的pcr体系见表5。表3.msp反应条件表4.以znf454的甲基化区域作为检测靶点时的msp反应体系组分规格体积(μl)缓冲液5×5dntps各2.5mm2znf454正向引物10μm1znf454反向引物10μm1znf454探针10μm1β-actin正向引物10μm1β-actin反向引物10μm1β-actin探针10μm1dna酶5u/μl0.5待测样本dna/5纯化水/补至25表5.以znf454和cdo1的组合作为检测靶点时的msp反应体系(3)质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照要无明显指数增长期，ct值为undet/noct或ct>40，阳性对照要有明显的指数增长期，且ct值满足20≤ct≤33。除阴性对照、阳性对照以外，内参基因ct值需满足15≤ct≤35；若ct值<15，则表明加入的样本dna过量，需减少dna加入量后重新检测；若ct值>35，则表明加入的样本dna含有pcr抑制剂或dna加入量过少，需重新制备dna或增加dna上样量再进行检测。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测；(4)结果判定：通过阳性判断值确定待测样本的ct值阈值，待测样本znf454基因ct值若满足ct≤38，则该样本为znf454甲基化阳性(znf454+)；若ct>38，则该样本为znf454甲基化阴性(znf454－)。待测样本cdo1基因ct值若满足ct≤38，则该样本为cdo1甲基化阳性(cdo1+)；若满足ct>38，则该样本为cdo1甲基化阴性(cdo1－)。若待测样本仅以znf454为检测靶点，znf454为甲基化阳性(znf454+)则该样本检测结果为阳性，反之则为阴性。若以znf454和cdo1的组合作为检测靶点，znf454和cdo1均为甲基化阴性(cdo1－/znf454－)，则该样本检测结果判定为阴性；若待测样本cdo1和znf454中有一个或一个以上基因为甲基化阳性(cdo1+/znf454－、cdo1－/znf454+和cdo1+/znf454+)，则该样本检测结果判定为阳性。若待测样本检测结果为阳性，表示受检者取样时患有子宫内膜癌的可能性较高，建议进行临床确诊；若待测样本检测结果为阴性，表示受检者取样时患有子宫内膜癌的可能性较低，建议定期进行筛查。实验例1收集西安交通大学附属第一医院临床确诊为子宫内膜癌的癌症组织和癌旁组织各78例，通过dna提取、重亚硫酸盐转化、msp检测与分析(见实施例3)，选用实施例1中的针对znf454基于8个靶区域的特异性引物和探针组合进行检测，检测结果如表6所示，对这8个区域的检测灵敏度和特异性的roc特性也进行了分析。统计分析方法：根据znf454或其与cdo1的组合作为靶点的检测结果，按照如下公式计算得到敏感性和特异性，应用spss23.0软件进行统计分析，针对子宫内膜癌组织或细胞样本检测结果利用roc(receiveroperatingcharacteristic)曲线对znf454或其与cdo1的组合的分群效能进行评估，计算roc曲线下面积、临界值、敏感性和特异性，p<0.05为有统计学意义，并绘制roc曲线。敏感性(sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；特异性(specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。表6.znf454的8个区域对子宫内膜癌组织样本的检测结果结果表明，znf454的8个甲基化区域检测子宫内膜癌组织样本的敏感性和特异性均大于96％，roc曲线下面积均大于0.970(图1，表6)，表明这8个区域区分子宫内膜癌组织和癌旁正常组织的效果较好，其中znf454的chr5:178940947-178941083区域检测效果最好，敏感性和特异性分别为100％和98.72％，roc曲线下面积为0.981。上述结果在来自西安交通大学附属第一医院的185个子宫内膜脱落细胞样本中进行了验证，其中47个样本所属病人经诊断罹患子宫内膜癌，其余138个为正常样本，通过dna提取、重亚硫酸盐转化、msp检测与分析(见实施例3)，选用实施例1中znf454的8个区域的特异性引物和探针组合进行检测，检测结果如表7所示。表7.znf454的8个区域对子宫内膜脱落细胞样本的检测结果结果表明，znf454的8个甲基化区域检测子宫内膜脱落细胞样本的敏感性和特异性均大于95％，roc曲线下面积均大于0.960(图2，表7)，表明这8个区域区分子宫内膜癌脱落细胞和子宫内膜正常细胞的效果较好，其中znf454的chr5:178940947-178941083区域检测效果最好，敏感性和特异性分别为97.87％和97.83％，roc曲线下面积为0.976。实验例2实验例1表明znf454的8个甲基化区域均可用于子宫内膜癌的早期检测，其中chr5:178940947-178941083区域检测效果最好，敏感性和特异性分别为97.87％和97.83％。进一步地，本实验例将znf454与bhlhe22、cdo1和celf4以及其组合进行比较分析。收集西安交通大学附属第一医院临床确诊为子宫内膜癌的癌症组织和癌旁组织各57例，通过dna提取、重亚硫酸盐转化、msp检测与分析(见实施例3)，选用znf454最佳区域chr5:178940947-178941083的特异性引物和探针组合进行检测(见实施例1)，并反复优化确定bhlhe22、cdo1和celf4的最佳引物和探针，其中cdo1的引物探针序列seqidno：43-45所示，bhlhe22和celf4基因的引物探针序列如下：bhlhe22正向引物：gcggtttatggtgagttttagtagt(seqidno：60)；bhlhe22逆向引物：gaactaaactccgaaactaatacgc(seqidno：61)；bhlhe22探针：cctaatactaccgaaaaccctctcc(seqidno：62)；celf4正向引物：tttcgttagttatcgggggattagt(seqidno：63)；celf4逆向引物：ccaaaccacctaccaaaataaaac(seqidno：64)；celf4探针：aaaaataaaaatccccgtcccgaac(seqidno：65)。检测结果如表8所示，对这些基因及其组合的检测灵敏度和特异性的roc特性也进行了分析。表8.znf454、bhlhe22、cdo1和celf4对子宫内膜癌组织样本的检测结果的比较结果表明，znf454检测子宫内膜癌组织样本的敏感性和特异性分别为100％和98.25％，bhlhe22、cdo1和celf4分别进行检测时，cdo1的效果最好，敏感性和特异性分别为84.21％和96.49％，bhlhe22、cdo1和celf4任意两个基因组合以及三个基因的组合的敏感性最高达94.74％，特异性最高达96.49％，znf454的roc曲线下面积也优于bhlhe22、cdo1和celf4及其组合(图3，表8)，综合表明单用znf454的检测效果优于bhlhe22、cdo1和celf4及其组合。上述结果在来自西安交通大学附属第一医院的166个子宫内膜脱落细胞样本中进行了验证，其中41个样本所属病人经诊断罹患子宫内膜癌，其余125个为正常样本，通过dna提取、重亚硫酸盐转化、msp检测与分析(见实施例3)，选用znf454最佳区域chr5:178940947-178941083的特异性引物和探针组合进行检测(见实施例1)，检测结果如表9所示，对这些基因及其组合的检测灵敏度和特异性的roc特性也进行了分析。表9.znf454、bhlhe22、cdo1和celf4对子宫内膜癌细胞样本的检测结果结果表明，znf454检测子宫内膜癌细胞样本的敏感性和特异性分别为97.56％和97.60％，bhlhe22、cdo1和celf4单独进行检测时，cdo1敏感性和特异性最高，分别为85.37％和96.00％，bhlhe22、cdo1和celf4任意两个基因组合以及三个基因的组合的敏感性最高达95.12％，特异性最高达95.20％，znf454的roc曲线下面积也优于bhlhe22、cdo1和celf4及其组合(图4，表9)，综合表明单用znf454的检测效果优于bhlhe22、cdo1和celf4及其组合。实验例3本实验例在znf454的基础上结合cdo1基因作为甲基化检测的靶基因，比较znf454结合cdo1的cpg岛中10个不同甲基化区域的检测效果，采用znf454最佳检测区域(chr5:178940947-178941083)的特异性引物和探针(见实施例1)，cdo1的10个甲基化区域的特异性引物和探针见表2。收集西安交通大学附属第一医院临床确诊为子宫内膜癌的癌症组织和癌旁正常组织各85例，通过dna提取、重亚硫酸盐转化、msp检测与分析(见实施例3)，检测结果如表10所示，对这些基因及其组合的检测灵敏度和特异性的roc特性也进行了分析。表10.znf454和cdo1的10个甲基化区域分别组合检测子宫内膜癌组织样本的结果结果表明，znf454分别结合cdo1的10个甲基化区域检测子宫内膜癌组织样本的敏感性和特异性均大于92％，roc曲线下面积均大于0.980(图5，表10)，表明znf454分别结合cdo1的10个甲基化区域的组分区分子宫内膜癌组织和癌旁正常组织的效果较好，其中znf454结合cdo1的chr5:115816448-115816573区域检测效果最好，敏感性和特异性均为98.82％，roc曲线下面积为0.993。上述结果在来自西安交通大学附属第一医院的201个子宫内膜脱落细胞样本中进行了验证，其中55个样本所属病人经诊断罹患子宫内膜癌，其余146个为正常样本，通过dna提取、重亚硫酸盐转化、msp检测与分析(见实施例3)，znf454和cdo1的特异性引物和探针同上述子宫内膜癌组织样本，检测结果如表11所示。表11.znf454和cdo1的10个甲基化区域分别组合检测子宫内膜癌细胞样本的结果结果表明，znf454分别结合cdo1的10个甲基化区域检测子宫内膜脱落细胞样本的敏感性和特异性均大于94％，roc曲线下面积均大于0.980(图6，表11)，表明znf454分别和cdo1的10个区域组合进行区分子宫内膜癌脱落细胞和子宫内膜正常细胞的效果较好，其中与cdo1的chr5:115816448-115816573区域结合时检测效果最好，敏感性和特异性分别为98.18％和97.26％，roc曲线下面积为0.992。综上，本发明实施例的试剂盒或试剂具有如下优点：1.目前子宫内膜癌临床诊断主要依靠诊断性刮宫，取样过程中患者较痛苦，且取样有创伤，可能导致患者子宫穿孔、大出血、刮宫不全损伤及宫腔粘连、感染等。本发明可以只需使用一次性子宫内膜细胞采集器进行子宫内膜细胞的取样，创伤小、操作简便、患者依从性好；2.传统的诊断方法不易检测出早期的子宫内膜癌，而dna甲基化是癌症发生中的早期事件且具有一定的稳定性，可以作为子宫内膜癌诊断的生物标志，本发明提供了一种基于dna甲基化的子宫内膜癌早期筛查方法，能准确快速判断受试者是否罹患子宫内膜癌，通过诊断或早期诊断可明显改善患者的预后状况；3.现有技术需要至少两个分子标志才能取得较好的检测效果，且部分分子标志不能同时用于子宫内膜组织和子宫颈抹片细胞的检测，本发明仅需一个分子标志(即一个基因)即可用于各种常规子宫内膜样本的检测，并且能达到较高的灵敏性和特异性，两个分子标志联用时效果更好；4.现有技术仅公开了用于子宫内膜癌早期筛查的一组分子标志，未提供具体的引物和探针序列，临床使用操作难度较大，本发明解决了上述问题，提供了一套完善的检测方法，即一管式子宫内膜癌检测试剂盒，包括引物、探针、dna聚合酶、dntps和mg2+离子等，简便快速，可用于临床的大批量样本检测；5.现有技术灵敏性和特异性最高分别能达到91.8％和95.5％，本发明利用单个标志物znf454灵敏性和特异性均能达到97％以上，znf454和cdo1联合使用灵敏性和特异性分别为98.18％和97.26％，效果突出。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>武汉艾米森生命科技有限公司<120>用于子宫内膜癌诊断的试剂盒以及应用<160>65<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ttagtggttgtggcgtcgttat22<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gcccgacacttccaacctaac21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ctacgaacgaaccaacgtat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tgtcgggcgtttgttaggtt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5aatcgattccgttccgttcg20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6cgacgcccgatcgctaacg19<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7aagcgaacggaacggaat18<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8aatactaccttacgcctacga21<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ccctccacgccgacctcaac20<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10gggttttgttttcgtaggc19<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<400>11aaccgaactacgcttacg18<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12aactactacaattccgccg19<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13cgtaagcgtagttcggtt18<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14ttaaccaccgtacctaatca20<210>15<211>18<212>dna<213>人工序列<400>15aacctctaccgacgacga18<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tgattaggtacggtggttaa20<210>17<211>18<212>dna<213>人工序列<400>17cattcgatcaacgtcctc18<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列<400>18aacgacctcacgaccgctc19<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列<400>19ggacgttgatcgaatgtt18<210>20<211>18<212>dna<213>人工序列<400>20actccatctcctccacaa18<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<400>21aactcgaccctcaacccaa19<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列<400>22ttgtggaggagatggagtt19<210>23<211>18<212>dna<213>人工序列<400>23actacgcaacgactacct18<210>24<211>19<212>dna<213>人工序列<400>24acgtatatctatcacctaa19<210>25<211>18<212>dna<213>人工序列<400>25aggcgtagtgatggagaa18<210>26<211>19<212>dna<213>人工序列<400>26ccgtctaaccgaactaaca19<210>27<211>19<212>dna<213>人工序列<400>27aacaaatcacccgcgtcaa19<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列<400>28ttagttcggttagacggttt20<210>29<211>18<212>dna<213>人工序列<400>29accaccaatcctcctacc18<210>30<211>19<212>dna<213>人工序列<400>30accgcactcaaattcgaac19<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列<400>31gttaggggtaggaggattgg20<210>32<211>19<212>dna<213>人工序列<400>32aactaacacgactcgctta19<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列<400>33cttactaacctccgaccgaa20<210>34<211>19<212>dna<213>人工序列<400>34ttaagcgagtcgtgttagt19<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列<400>35cgctacaacttcaataccaa20<210>36<211>19<212>dna<213>人工序列<400>36cctcgctaaccaaccgcga19<210>37<211>20<212>dna<213>人工序列<400>37cgtcgtttggtattgaagtt20<210>38<211>20<212>dna<213>人工序列<400>38atctaatccgcatcctacac20<210>39<211>20<212>dna<213>人工序列<400>39caactctttaccgacgataa20<210>40<211>20<212>dna<213>人工序列<400>40gtgtaggatgcggattagat20<210>41<211>19<212>dna<213>人工序列<400>41actccttaactcgctcaac19<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列<400>42aacgcgcgcgcaaccaactc20<210>43<211>19<212>dna<213>人工序列<400>43gagttgagcgagttaagga19<210>44<211>21<212>dna<213>人工序列<400>44tactatctctacgacgacatc21<210>45<211>20<212>dna<213>人工序列<400>45taacgatctaacgaactatt20<210>46<211>21<212>dna<213>人工序列<400>46gagtgtcgaaacgtaaggatg21<210>47<211>18<212>dna<213>人工序列<400>47aataactctccgcctcgt18<210>48<211>19<212>dna<213>人工序列<400>48atacaccgcgtctccaacg19<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列<400>49agcgtttggagttattagga20<210>50<211>18<212>dna<213>人工序列<400>50gtaaaccgtacccgcaaa18<210>51<211>20<212>dna<213>人工序列<400>51tctccgcctcgtcctccctc20<210>52<211>18<212>dna<213>人工序列<400>52ttgcgggtacggtttacg18<210>53<211>18<212>dna<213>人工序列<400>53gcgaaccacaacgacgaa18<210>54<211>19<212>dna<213>人工序列<400>54aaacccacgcgatccctaa19<210>55<211>21<212>dna<213>人工序列<400>55caagatgagattggcatggct21<210>56<211>21<212>dna<213>人工序列<400>56tgtgaactttgggggatgctc21<210>57<211>25<212>dna<213>人工序列<400>57ccagtttttaaatcctgagtcaagc25<210>58<211>1105<212>dna<213>人工序列<400>58cgacatccttgtcctcccgcaccgcacacgcgttagtggctgtggcgtcgccaccccagc60acacgctggcccgcccgcagtgccaggctggaagtgtcgggcgcttgccaggccaagggg120caattctgttgccttccaggccttttcggcgcggtcccagtcaggaacgcgccctgtcgc180ctcccactccgtcttccggaccctcccgatcctctctcgtcagcgatcgggcgtcgctcc240cctggactaacctcccttgccccatcttcagcttttcgctgatctgcatcttcctgcgcc300ttagtgcaaggcagagacctggttctaaagcgaacggaacggaaccgattctgtaagttg360caatgagcgcgctgaggtcggcgtggaggggtctctgggaaaggtagtttccgcgcctaa420agcgccggggccgggccctgttcccgcaggcgcaaggcagcactgtctccgccgattgtc480cctctgggaagtggagtctggccggcggaactgcagcagccctgagacttgtgggaattc540ggcccaagggttcccagggcaacgcgcaagcgcagttcggctcccggctgcagactccag600ctcattgtgttctgactgcgatgtggcgcttgcgatctctcgccgccggcagaggctcct660cgaagagcgacacggggctgaccaggcacggtggtcaaagccgcagagggagagcgggag720cggtcgtgaggtcgtctggggagaagggcggaggcaaagccgaggaggtgcgggttgtgg780tccattctggaggacgctgatcgaatgccccaaacttcccggaatgtatgtctgagattt840gatcccagagagggaggacggccaggggtggtcatcctgggctgagggtcgagtctgtga900gtgcctgtggaggagatggagccagggcctctggcatgtgtcttggagcggactccgaga960agcccagggtttcctctcaggtgatagatacacgcctggcgtggttccgagtcctgcgcc1020aggaactcgccaaggccggaggcagccgctgcgcagcccctgccacagcccccgagggac1080ctggcgaagcggcaggggcgggacg1105<210>59<211>1365<212>dna<213>人工序列<400>59cggttgcaggcgaccgaaggcgcagtgatggagaactgacgcgggtgacttgtcttcttc60aacatcacacacttctcccgatggctgatgtagtgctcccctgggagcaccctctgctag120tccggccagacggttccttaaggtgtcaggagggcccgaacctgagtgcggtctctccgc180atctccgcgcccggggttaacgatggcttgggagtgtgggcattgctcccgaggccaggg240gcaggaggactggtggtttagaagcagaggggtttgcgggagagaagagaacagaaaatc300tcgcagacgcgcggtggcctcccttcccggcgcctgtccgccgttcccggccggaggtca360gcaaggccagtaggatccaccttccgcctgcgctgtggccgcggagccccaagcgagtcg420tgccagccccgcggctggccagcgagggggcgagcggcggacgcagcgcggcccgagctt480cccgagccagtcactttgggctgcgtcccccacgtccattcctcctcagacggggcgagt540gggcgccgcctggcattgaagctgcagcgcgctcacctgtactggtcgaacttggcgtac600attgcccactcggtggggtcgctctcgtaggcttccatgatggcctgcacctcctctaca660ttgacctcatcgccggcaaagagctggtgcaggatgcggatcagatcagccagggtccgt720ggcttcagcacttcggtctgttccatctcgtggggagctggctgcgcgcgcgtctcactg780ctgggctgcggtggaggagctgagcgagccaaggagctgggggcgagggagcctaacagc840ccgctagaccgctaagcagacacacacgcacaaacccagcattagagtgccgaaacgtaa900ggatgtcgtcgcagagacagcaagagacccacccccaggcccctggcagcgcagtggatc960cgggatcgctggagacgcggtgcacacacaaatcaggttcagatctgtggggttcatcct1020cccgggccccttttaagcgcttggagtcactaggaatgtaccaacggccctcggagggag1080gacgaggcggagagccacccaagaaaggtggcggaggcggggagaccctgcgggcacggc1140tcacgcgcacatccccggcttccccgggctccgcgccttcccaagagccccgttgtctcc1200ggcgtcccagggatcgcgtgggctccgcgcaatctctcccccactttaacggcgcgtttt1260agccgcccggcctaacgcctctccccgctccacctccgccgctgtggttcgcgacgctgg1320gacgtagacaaaaagggtcggaggagatggctgcggggactgacg1365<210>60<211>25<212>dna<213>人工序列<400>60gcggtttatggtgagttttagtagt25<210>61<211>25<212>dna<213>人工序列<400>61gaactaaactccgaaactaatacgc25<210>62<211>25<212>dna<213>人工序列<400>62cctaatactaccgaaaaccctctcc25<210>63<211>25<212>dna<213>人工序列<400>63tttcgttagttatcgggggattagt25<210>64<211>24<212>dna<213>人工序列<400>64ccaaaccacctaccaaaataaaac24<210>65<211>25<212>dna<213>人工序列<400>65aaaaataaaaatccccgtcccgaac25当前第1页12