本发明涉及生物技术检测领域，尤其是涉及一种用逆转录定量聚合酶链反应(rt-qpcr)技术对生物制品进行杯状病毒(calicivirus)的检测。
背景技术：
随着生物医药技术的飞速发展，人们越来越重视疫苗等生物制品的安全性，加强了对其的质量控制。生物制品的质量控制不仅仅是对终产品的质量控制，还是对整个生产过程的质量控制。因此，全球各国监管当局要求生产企业在临床试验被批准前及生物药和疫苗终产品释放前，生产流程的各个环节都必须通过繁复的安全测试以证明产品的一致性、稳定性及纯度。
杯状病毒(calicivirus)是直径约为26～35nm的小圆结构病毒，无包膜，含病毒vpg蛋白和rna，其基因组为单股正链rna。已知calicivirus不能在细胞或组织中培养，可经粪-口途径传播，是引起急性无菌性胃肠炎的重要病原。因此，提供一种合适的检测calicivirus的方法，从而拥有一个高效的细胞基质、原液病毒感染的排除机制，变得非常必要。
目前存在的检测calicivirus方法有电镜法、酶联免疫法和生物素-亲和素免疫法，但这些方法都存在设备昂贵、操作复杂、检测时间长、特异性太强等缺点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种检测杯状病毒的方法，具有检测时间短、操作简单、检测特异性高、重复性好的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种采用rt-qpcr技术检测杯状病毒的方法，包括步骤：
1)提取待测样品总rna，并将rna模板的浓度调整为0.1μg/μl；
2)制备反应体系，包括一步法预混液、引物和探针；
所述一步法预混液为taqmanfastvirus1-stepmastermix；
上下游引物为：正向引物fp，核苷酸序列为：gggactcaatccagtttcgt(如seqidno:1所示)，和反向引物rp，核苷酸序列为：ttcatgatcaaggccagtgt(如seqidno:2所示)；
所述探针为probe：ctcatttgcctggcggacca(如seqidno:3所示)；
3)梯度稀释标准曲线样品；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)rt-qpcr反应；
6)结果分析。
具体的，所述步骤1)中，采用qiagen
具体的，所述步骤2)中，引物的终浓度为900nm。
具体的，所述步骤2)中，探针的终浓度为200nm。
具体的，所述步骤3)中，标准曲线中各个稀释样品的浓度为：105copie/5μl，104copie/5μl，103copie/5μl，102copie/5μl，10copie/5μl。
具体的，所述步骤4)中，分子生物级别水作为试剂阴性对照，已知的动物细胞rna作为阴性rna对照。
具体的，所述步骤5)中，rt-qpcr反应采用abi7500实时pcr系统。
具体的，所述步骤5)中，rt-qpcr反应体系包括：
taqmanfastvirus1-stepmastermix，6.25μl；
正向引物fp(如seqidno:1所示)，0.225μl；
反向引物rp(如seqidno:2所示)，0.225μl；
探针(如seqidno:3所示)，0.05μl；
水，8.25μl；
模板，10μl；
总体积，25μl。
具体的，所述步骤5)中，rt-qpcr反应条件为48℃，30分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环。
具体的，所述步骤6)中，在sds软件的“分析设置”框里，选择“自动ct”和“自动基线”，点击“分析”，生成标准曲线，并获取试验的线性r2值，计算出pcr反应效率的标准曲线斜率；通过对标准曲线的线性回归分析，计算高于背景的、阳性信号的rna拷贝数。
本发明采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasequantitativepolymerasechainreaction，rt-qpcr)，rt-pcr是用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测pcr过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的，同时以对照设计有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。与其它的检测calicivirus方法(电镜法、酶联免疫法和生物素-亲和素免疫法)比较，采用rt-qpcr法不仅可缩短检测所用时间，而且有操作相对简单、检测的特异性重复性好等优点，适合于生物生产过程中繁复的检测要求。
在检测有关的细胞或原液是否被外源性calicivirus污染时，由于没有合适的培养细胞系统，培养法不可行；通常外源性calicivirus病毒滴度很低，常规分子杂交技术难以检出calicivirusrna；此外，calicivirus病毒的电镜观察技术依赖于特定的设备和经验丰富的技术人员，实验结果的判读容易产生偏差。本发明提供的rt-qpcr方法简单高效、结果稳定，重复性好，适用于生物生产过程中检测有关的细胞或原液是否被calicivirus污染/感染。
本公司采用taqman探针的逆转录定量聚合酶链反应(rt-qpcr)技术检测杯状病毒(calicivirus)是一个成熟完善的检测体系。本申请的rt-qpcr方法的优点还在于：1.taqman比sybrgreen的特异性好，有特异性探针，结果特性强；2.采用一步法rt-qpcr，rna逆转录和pcr反应在全封闭状态下的同一管内完成，避免了对环境的污染和由此导致的假阳性。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明采用rt-qpcr技术检测杯状病毒(calicivirus)，可用于生物生产流程的各个阶段的测试，包括动物来源的原辅料、原液和临床试验产品批次。特别是原料测试中包含的主细胞库(mastercellbank,mcb)、最终生产细胞(endofproduction,epc)等等。
实施例1
本实施例采用rt-qpcr技术检测杯状病毒(calicivirus)的方法，具体包括以下步骤：
1.提取待测样品总rna
生物制品生产检定用动物细胞，细胞总量1x107，采用qiagen
2.制备反应体系，包括一步法预混液、上下游引物、探针；
rt-pcr反应体系为25微升，引物的终浓度为900nm，探针的终浓度为200nm；
3.梯度稀释标准曲线样品；
标准曲线中各个稀释样品的准备如下
4.试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
分子生物级别水作为试剂阴性对照，已知的动物细胞rna作为阴性rna对照。在已含15μl反应液的96孔板里，将分子生物级别水加入到相应的“阴性对照”孔中。为确保最后的体积一致，会用分子生物级别水补足，至所有孔内的反应体系终体积为25μl。
5.rt-qpcr反应(采用abi7500实时pcr系统)；
开机，将加样板放在托盘架上。
设置程序参数，将热循环条件设为：rt-pcr反应条件为：48℃30分钟；95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。
点击开始，运行程序。
6.结果分析
在sds软件的“分析设置”框里，选择“自动ct”和“自动基线”，点击“分析”。通过标准品系列，软件会生成标准曲线，并获取试验的线性r2值；也会计算出pcr反应效率的标准曲线斜率。通过对标准曲线的线性回归分析，软件将计算高于背景的、阳性信号的rna拷贝数。选择适当的报告设置，并打印报告。
本公司用于calicivirus检测的rt-qpcr技术，采用了高灵敏稳定检测rna的实时定量rt-pcr检测试剂盒，该试剂盒组分很少，所有反应集于一管，最大程度降低样本处理错误，缩短设置时间，可灵敏稳定地扩增rna靶点；试剂盒缓冲液中含有的参比荧光rox，结合特异性taqman探针，实现定量荧光信号的标准化，可快速简单地设置反应，2小时内获得检测结果。这些技术特点节约时间，提高实验室的运作效率；同时方法灵敏度高，经济节约，性价比高。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110>苏州药明检测检验有限责任公司
<120>采用rt-qpcr技术检测杯状病毒的方法
<130>cpc-np-18-101286
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>引物
<400>1
gggactcaatccagtttcgt20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>引物
<400>2
ttcatgatcaaggccagtgt20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>探针
<400>3
ctcatttgcctggcggacca20