一种提高分化细胞中NROB2基因表达量的方法与流程

本发明属于再生细胞分化与制备技术领域，具体地说，涉及一种提高分化细胞中nrob2基因表达量的方法。

背景技术：

人多潜能干细胞可以无限扩增并分化产生肝脏细胞。由于其细胞数量是无限的，产生的肝细胞在疾病模型、药物筛选、药物毒性测试、组织工程、细胞治疗和基因治疗等领域有着非常广泛的应用前景。目前从人多潜能干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞分化得到的肝脏细胞，其细胞不成熟，类似于胎肝状态。相应的，分化产生的肝脏细胞的基因表达和成熟的肝脏细胞存在一定的差异(见图1)。

在这些差异表达的基因中，一个非常重要的功能基因是细胞核受体基因nr0b2(nuclearreceptorsubfamily0groupbmember2，也称作smallheterodimerpartner，shp)。nr0b2的基因表达受nr1h4(nuclearreceptorsubfamily1grouphmember4，也称作farnesoidx-activatedreceptor，fxr)调控。nr0b2这一蛋白在细胞中调节多种核受体的转录活性，调节其目标基因的表达。与nr0b2相互作用的核受体基因包括雄激素受体(androgenreceptor，ar)，雌激素受体(estrogenreceptoralpha，esra)，肝细胞核因子4a(hepatocytenuclearfactor4alpha，hnf4a),肝受体同源物1(liverreceptorhomolog-1，lrh)，肝x受体a(liverxreceptoralpha，lxra)，过氧化物增殖活化受体gama(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma，pparg)，视黄酸受体alpha(retinoicacidreceptoralpha，rara)和视黄素x受体alpha(retinoidxreceptoralpha，rxra)等。调节机体的脂/糖代谢，是维持机体的能量稳态的中心轴成员。

鉴于nr0b2在肝脏脂/糖代谢的重要作用，有必要研究并制备一种含nr0b2表达量高的肝脏细胞，以缩小分化得到的肝脏细胞与成熟肝脏细胞的差异度。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种含nr0b2量高的肝脏细胞，以及一种提高分化细胞中nrob2基因的方法。

为实现上述目的，本发明筛选了脂代谢相关的小分子库，在分化细胞中加入小分子库中的小分子，并每两天换液一次。处理6天后，将细胞继续分化至最后阶段，收样，提取rna，使用rt-qpcr检测细胞中nr0b2基因的表达水平，从而鉴定出能够提高分化细胞中nr0b2基因表达的小分子int-747。

int-747(obeticholicacid；6-ecdca；6-ethylchenodeoxycholicacid)是有效选择性的法尼醇x受体(fxr)激动剂。已知其能够阻止甚至逆转肝纤维化。可作为一种人类胆汁酸模拟物，开发用于pbc、非酒精性脂肪性肝炎及其他肝脏疾病和肠道疾病的治疗。现有技术未发现int-747能够提高肝脏分化细胞中的nr0b2表达量。

在本发明中，基于上述发现，本发明提供了一种提高分化细胞中nr0b2基因表达量的方法，在细胞分化的过程中，在产生内胚层细胞之后的继续分化的一个或多个阶段将int-747添加入细胞分化体系中。

优选地，在细胞分化的第三或第四阶段将int-747添加入细胞分化体系中。

本发明所述分化细胞为人多潜能干细胞或人胚胎干细胞分化产生细胞。

优选地，所述分化细胞为人多潜能干细胞或人胚胎干细胞分化产生的肝脏细胞。

进一步地，本发明经过大量研究发现，int-747添加入细胞分化体系中的量为1-50μmol/l，优选1-10μmol/l。

本发明还提供了一种高表达nr0b2基因的分化细胞，通过以下方法制备得到：在细胞分化的过程中，在产生内胚层细胞之后的继续分化的一个或多个阶段将int-747添加入细胞分化体系中，待分化结束得到高表达nr0b2基因的细胞。

所述分化细胞为人多潜能干细胞或人胚胎干细胞分化产生的肝脏细胞。

本发明提供的高表达nr0b2基因的分化细胞以及本发明上述方法获得的分化细胞能够在制备或筛选调节机体脂肪或糖代谢药物中发挥模型作用，因此本发明提供了上述分化细胞在制备或筛选调节机体脂肪或糖代谢药物中的应用。

本发明提供了所述的分化细胞在作为肝脏脂肪或糖代谢模型中的应用。

更进一步，本发明提供了int-747在提高肝脏分化细胞中nr0b2基因表达量中的应用。

本发明通过多潜能干细胞分化产生的肝脏细胞，筛选脂代谢相关小分子库，鉴定出能够提高分化细胞中nr0b2基因表达的小分子int-747，将该小分子应用于肝脏细胞，从而诱导出能够高表达nr0b2基因的肝脏细胞。这些肝脏细胞具有高的nr0b2基因表达，鉴于nr0b2在肝脏脂/糖代谢的中心作用，高表达nr0b2基因的分化细胞可以用于研究肝脏的脂/糖代谢机理，并筛选调节机体脂/糖代谢的药物，具有优异的临床应用价值，在药物研发领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为分化细胞和肝脏细胞基因表达的rna-seq数据显示分化细胞nr0b2基因表达偏低。

图2为实施例2的筛选流程示意图。

图3为实施例2的典型的筛选结果。图中纵坐标是相对基因表达量，横坐标是各个小分子检测的位置，即图3是各个小分子对nr0b2基因表达的相对量，位置3-a4是添加了lnt-747，其表达量非常明显。

图4为int-747可以提高分化细胞中nr0b2基因的表达。左图是正常肝细胞的alb标记蛋白，可见到三个细胞分化效率差别不明显；右图是基因改性的细胞提高了nr0b2标记蛋白的分化效率表达，加int747量10μmol时与不添加int747(即只有溶剂dmso)时的分化效率提高上百倍。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例以人诱导多潜能干细胞ips18(购自clonetech)为例，肝分化方案修改自caijetal.protocolfordirecteddifferentiationofhumanpluripotentstemcellstowardahepatocytefate.stembookharvardstemcellinstitute；2008。在分化的第三阶段进行小分子库的筛选，在分化的第四阶段末进行基因表达检测。筛选策略示意图见图2，代表性的筛选结果见图3。本发明实施例只是作为一个实例来说明int-747对于提高分化细胞中nr0b2基因表达的作用(见图4)，在实际应用中可以应用到其他的ips分化到肝脏细胞的体系，包括但不限于使用不同的ips细胞系或者es细胞系、采用不同的分化策略和使用不同的浓度及作用时长等。本方案使用的试剂和材料均为商业化产品，并且多种来源的产品均具有相同的功效。

实施例1ips细胞复苏、培养和传代

包被geltrex：将geltrex(thermofisherscientific)放置在冰上融化，然后用冰冷的df12(thermofisherscientific)稀释到2mg/ml。加入5ml到10cm培养皿里，37℃放置30分钟到4小时。配制pgm1：pgm1培养基购自赛贝生物，将添加物在4℃融化，加入基础培养基中，得到pgm1培养基。取12mlpgm1，加入5μm小分子y27632(selleck)。将水浴锅加热到37℃。取出冻存的ips细胞，购自clonetech公司，迅速放入水浴锅，轻轻摇晃，知道冰块完全融化。擦干冻存管。将细胞轻轻转移到15ml离心管中。逐滴加入5ml含有y27632的pgm1，边加边轻轻摇晃。1000转/分离心3分钟。弃去上清，加入7ml含有y27632的pgm1，重悬细胞。取出geltrex包被的培养皿，吸去上清。将细胞接种到培养皿中，摇晃培养皿使细胞均匀分布在培养皿中。将细胞放入含有5％co2的细胞培养箱中，37℃培养。每天给细胞换液。4-5天后，细胞涨到80％-90％汇合度时，将细胞传代。

把要传代的细胞皿的上清吸掉，用dpbs洗一次。加入3mlversene(thermofisherscientific)，37℃放置2分钟。弃去versene，用含有5μmy27632的pgm1培养基将细胞轻轻吹打下来。取1/10-1/15的细胞，接种到geltrex包被的培养皿中。每个培养皿加入7ml含有y27632的pgm1培养基。摇晃培养皿使细胞均匀分布在培养皿中，放回37℃培养箱，至少2-3小时不动。

实施例2ips细胞分化为肝脏细胞和小分子筛选

筛选流程示意图见图2。在传代后4-5天，待ips细胞长到80％-90％汇合度时，将ips细胞用accutase消化下来，以3×10⁶/孔接种到geltrex包被的6孔板中；在大约18小时后，用1640培养基洗一遍，然后换为1640+2％b27(不含insulin，购自thermo-fisher)+100ng/mlactivina(peprotech)+3μmchir99021(selleck)；24小时后，将培养基换为1640+2％b27(不含insulin)+100ng/mlactivina。这时候会出现大量细胞死亡，属正常现象。如果死细胞太多，可以用1650培养基洗一遍后再换液。每天换液，连续两天；48小时后，在分化的第三天，将分化细胞用accutase消化下来，以5×10⁵/孔接种到geltrex包被的24孔板中；贴壁培养基为：1640+2％b27+20ng/mlbmp4+10ng/mlbfgf+5μmy-27632；24小时后，细胞贴壁，将培养基换为1640+2％b27+20ng/mlbmp4+10ng/mlbfgf。每两天换液一次，换5次；5天后，将培养基换为1640+2％b27+1/10000体积的小分子。小分子来自小分子库l-7000(购自陶素生化公司)，对照为相同体积的dmso。每2天换液一次，换3次；6天后，将培养基换为hcm+20ng/mlosm。每天换液一次，换5次。5天后，将细胞收样，定量pcr检测分析，分析结果见图3，表示各个小分子对于nr0b2基因的影响，其中显示小分子int-747的影响最大(图中比率柱最高位置)，添加量10μmol时的分化效率与不加int747时要高上百倍。从图3能够看出来，以成熟肝细胞相对表达量1计算，本发明能够达到0.58,但不添加int747时仅在0.0x的水平。

实施例3rna制备和rt-qpcr

将细胞用trizol(thermo-fisher)裂解，然后用rna提取试剂盒(zymo)提取rna。rna的od260/230>1.5，od260/280在1.95-2.05之间。取1μgrna反转录(promega试剂盒)为20μlcdna，然后稀释到100μl，用qpcrmix(appliedsystem)，在qpcr仪器(诺禾致源)检测基因表达量。qpcr引物由擎科合成，其产物大小为120-250bp之间。alb是用于衡量分化效率的一种蛋白。pcr使用引物序列为：

表1qpcr引物序列

pcr反应体系为：cdna2μl，引物(10μm)各0.2μl，水2.6μl，qpcrmastermix5μl。

pcr反应条件为：95℃10min；95℃15sec，60℃60sec，40个循环。

获得扩增的ct值。使用gapdh作为内参，肝脏组织里相应基因的表达设为1。

通过在分化体系中加入int747，使得分化对nr0b2基因的表达提高上百倍，见图4。使nr0b2表达量接近正常人体肝细胞，从而改善现有技术获得的分化肝细胞的脂代谢和糖代谢功能不成熟的情况，提高细胞分化质量。

本发明分化的肝细胞具有更好的脂代谢和糖代谢性能，经本发明的肝细胞与普通a蛋白介入分化的方式分化的肝细胞进行葡萄糖氧化法检测，在1.0g/l的葡萄糖培养液中培养24h检测培养液内葡萄糖的含量，在初始浓度相同的情况下，明显本发明细胞培养液中葡萄糖浓度为0.45g/l，普通a蛋白介入分化的肝细胞培养液葡萄糖浓度0.69g/l。显然本发明方法分化的细胞具有更好的糖代谢能力。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京协同创新研究院

<120>一种提高分化细胞中nr0b2基因表达量的方法

<130>khp191113164.7

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccacctttgacgctggg17

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cataccaggaaatgagcttgaca23

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tggcacaatgaagtgggtaa20

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<213>人工序列(artificialsequence)

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