甘蓝型油菜种子油酸含量的主效QTL位点、SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，特别涉及甘蓝型油菜种子油酸含量技术领域，具体涉及甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记及应用。

背景技术：

油菜(brassicanapus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物。因此国家把发展油菜生产作为保证食用油安全供应的重点，具有重要的现实意义。我国甘蓝型油菜由于具有抗病、产量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜增产主要通过期高单位面积菜籽产量、期高菜籽含油量和扩大种植面积三种途径。油菜育种工作者现在的主要目标是努力期高含油量、产量和品质。由于油菜的含油量、产量、品质等性状为复杂的数量性状，受环境的影响较大，依靠传统的育种方法和技术在现有的基础上很难有较大的突破，因此将数量遗传学和分子标记技术相结合，为油菜遗传育种的发展期供了新的机会。

基于snp的分子标记技术被认为是继rflp和ssr之后出现的第三代分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的缺失、突变、插入等，通过基于测序或pcr的dna芯片技术等方法可以实现自动化批量检测，因而在基因定位的研究中有着不可比拟的优越性和潜力。

油菜中油酸和亚麻酸的含量对食用品质、营养品质、存储等方面有着重要的影响。从食用品质方面考虑，高油酸含量的菜籽油中多不饱和脂肪酸含量相对较低，热稳定性强，纯化加热过程中不容易被氧化，而亚麻酸在高温或强光照条件下容易被氧化导致油脂变质，不利于储存。从营养品质方面考虑，菜籽油中油酸(c18：1)等单不饱和脂肪酸更有益人体健康，而亚麻酸(c18：3)含有三个不饱和键，极易氧化形成自由基，出现脂质过氧化反应，损伤细胞与细胞膜的结构和功能。

现有技术中，江建霞等(上海农业学报，2019)指出，综合考虑菜籽油中油酸和亚麻酸含量对人体健康和储存方面的影响，提高菜籽油中油酸含量，降低亚麻酸含量是油菜品质育种中的一个重要育种目标。近年来，随着全基因组测序的完成，分子标记技术的广泛应用，分子标记辅助选择(mas)技术的不断发展，油菜的油酸含量等重要品质性状相关的分子标记和qtl定位的研究成果越来越多，但多数为初步定位阶段。因此，借助分子标记和数量性状位点(qtl)定位，在分子水平对甘蓝型油菜种子油酸含量性状进行进一步研究，将有助于提高菜籽油品质，同时为揭示甘蓝型油菜中油酸含量遗传机理和分子机制奠定基础。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的snp分子标记，所述的甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点位于甘蓝型油菜的a08染色体的第8024751位碱基～第11299788位碱基之间，对甘蓝型油菜种子油酸含量的贡献率高，对甘蓝型油菜种子油酸含量的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

优选地，所述的甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点与snp分子标记紧密连锁，所述snp分子标记为第一snp分子标记、第二snp分子标记和/或峰值snp分子标记。

优选地，所述第一snp分子标记位于甘蓝型油菜的a08染色体的第8024751位碱基，所述第8024751位碱基为c或g，该突变导致多态性。

优选地，所述第二snp分子标记位于甘蓝型油菜的a08染色体的第11299788位碱基，所述第11299788位碱基为a或g，该突变导致多态性。

优选地，所述峰值snp分子标记位于甘蓝型油菜的a08染色体的第10445600位碱基，所述第10445600位碱基为a或g，该突变导致多态性。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的snp分子标记的应用。

优选地，其用于检测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，或用于预测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，或用于对甘蓝型油菜种子油酸含量的高低进行有效选择。

优选地，其用于甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，或用于加速甘蓝型油菜油酸含量育种的进程。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chra08_8024751(c/g)的前后各400bp序列(共801bp)dna片段为模板设计的，所述dna片段如seqidno:1所示。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chra08_11299788(a/g)的前后各400bp序列(共801bp)dna片段为模板设计的，所述dna片段如seqidno:2所示。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chra08_10445600(a/g)的前后各400bp序列(共801bp)dna片段为模板设计的，所述dna片段如seqidno:3所示。

优选地，所述引物或探针标记有荧光基团，所述荧光基团包括fam、hex、vic、rox。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针在检测和/或预测甘蓝型油菜种子油酸含量，或甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点，其与snp分子标记紧密连锁，其对甘蓝型油菜种子油酸含量的贡献率高，对甘蓝型油菜种子油酸含量的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

(2)本发明的甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的snp分子标记，包括位于甘蓝型油菜的a08染色体的第8024751位碱基的snp分子标记、位于甘蓝型油菜的a08染色体的第11299788位碱基的snp分子标记和位于甘蓝型油菜的a08染色体的第10445600位碱基的峰值snp分子标记，其可以检测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，可以预测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，可以对甘蓝型油菜种子油酸含量的高低进行有效选择，还可以用于种子油酸含量高或低的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜油酸含量育种的进程，适于大规模推广应用。

(3)本发明具体提供了三种甘蓝型油菜种子油酸含量的snp分子标记，其中峰值snp标记为：chra08_10445600(a/g)，对应种子油酸含量表型分组为：当chra08_10445600位置的snp为a时，材料的平均种子油酸含量为19.53％；g时，材料的平均种子油酸含量为52.85％；该峰值snp的贡献率为71.00％；

种子油酸含量的一个边界snp标记为：chra08_8024751(c/g)，对应种子油酸含量表型分组为：当chra08_8024751位置的snp为c时，材料的平均种子油酸含量为50.37％；g时,材料的平均种子油酸含量为25.23％；该边界snp的贡献率为41.14％；

种子油酸含量的另一个边界snp标记为：chra08_11299788(a/g)，对应种子油酸含量表型分组为：当chra08_11299788位置的snp为a时，材料的平均种子油酸含量为50.08％；g时,材料的平均种子油酸含量为25.23％；该边界snp的贡献率为39.52％。

附图说明

图1是本发明的甘蓝型油菜种子油酸含量的分布结果的示意图，即关联群体种子油酸含量表型频率分布图。

图2是本发明的甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点定位示意图，即关联群体种子油酸含量关联分析曼哈顿图。

图3是本发明中利用甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的峰值snp分子标记进行等位分析的示意图，即主效qtl位点的峰值snp(chra08_10445600)分子标记等位分析图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1甘蓝型油菜种子油酸含量的表型的测定

1.关联群体的种子油酸含量表型的测定

(1)对324份来源世界各地的甘蓝型油菜高世代品系构成自然群体，在武汉市阳逻试验基地和扬州市农科院试验基地完成3年2点的种子油酸含量调查。

(2)采用直播定苗,行距33cm,株距15cm，每个小区4行，随机设计三个重复。试验材料田块四周种植保护行。

(3)种子油酸含量：每个小区取10株材料的成熟种子用近红外测定仪测定油酸含量。

(4)用blup方法(http://www.extension.org/pages/61006)对多年多点表型数据进行整合，得到种子油酸含量育种值做为种子油酸含量表型。

将324份材料的所有环境的表型值平均，结果汇总如下：

表1324份材料的所有环境的种子油酸含量表型值(％)

关联群体的种子油酸含量分布结果表明种子油酸含量表现分布呈连续性分布，呈两个峰值，证明种子油酸含量可能存在两个主效基因位点，如附图1所示。

2.关联群体高质量snp数据集的获得

采用ctab方法提取叶片总dna，提取关联群体的每份材料的叶片总dna，具体方法为：

将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨至粉末状，装入2ml离心管中；加入预热dna提取液700μl；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；加入700μl混合液(苯酚：氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀10min；室温下，10000×g离心15min；吸取上清液至新的2ml离心管中；加入等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000×g，离心15min，用枪吸取上清液到新的离心管中；加入2倍体积无水乙醇，混匀后在–20℃静置1h，10000×g，离心10min，弃上清液；再加入500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2次洗涤沉淀后，晾干；加入含有2％rnasea溶液100μl，在37℃静置1h后4℃过夜；用等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提dna溶液，颠倒混匀，静置10min，10000×g，离心15或20min，去除rnasea，吸取上清液(约60μl)，再次离心，1min；利用琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测dna浓度、质量及完整性；确定所有dna样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。然后将dna样品干冰运输至测序公司(华大基因科技有限公司)，每个材料测序深度大约为7×。

根据上文描述获得高质量dna后，测序公司(华大基因科技有限公司)进行7×覆盖深度的测序后返回的数据，先使用fastqc软件进行测序质量评估，然后对测序序列进行adapter和低质量reads过滤。得到每个材料的双端测序的cleandata，然后使用bwa软件进行mapping以及gatk软件进行变异检测，得到关联群体总的snp数据集后，根据最小等位基因频率≥0.05，缺失率≤0.1和杂合率≤0.1进行snp数据集质量过滤，最终得到高质量的群体snp数据集用于后续分析。

3.全基因组关联分析

使用plink软件对上一步产生的高质量snp数据集的vcf文件进行格式转换，然后使用emmax软件将得到的种子油酸含量表型和snp数据集进行全基因关联分析，得到每个snp位点的p值，当p值小于7.2×10^-7的snp即为显著snp，p值最小的snp即为峰值snp，将峰值snp在群体中的不同等位基因类型将材料进行分组，进行方差分析，组间方差与总方差的比值的百分比，即为该峰值snp的贡献率。

通过分析，将甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点的区间限定在甘蓝型油菜的a08染色体的第8024751位碱基～第11299788位碱基之间，对应的snp为chra08_8024751(c/g)，chra08_11299788(a/g)，峰值snp为：chra08_10445600(a/g)，该qtl对甘蓝型油菜种子油酸含量的贡献率为71.00％(根据峰值snp的不同等位基因类型将材料分组，进行单因素方差分析，组间方差除以总方差的百分比即为贡献率)。

种子油酸含量的峰值snp为：chra08_10445600(a/g)，对应种子油酸含量表型分组为：当chra08_10445600位置的snp为a时，材料的平均种子油酸含量为19.53％；g时，材料的平均种子油酸含量为52.85％；该峰值snp的贡献率为71.00％；

种子油酸含量的其中一个边界snp为：chra08_8024751(c/g)，对应种子油酸含量表型分组为：当chra08_8024751位置的snp为c时，材料的平均种子油酸含量为50.37％；g时,材料的平均种子油酸含量为25.23％；该边界snp的贡献率为41.14％；

种子油酸含量的另一个边界snp为：chra08_11299788(a/g)，对应种子油酸含量表型分组为：当chra08_11299788位置的snp为a时，材料的平均种子油酸含量为50.08％；g时,材料的平均种子油酸含量为25.23％；该边界snp的贡献率为39.52％。

甘蓝型油菜的全基因组序列已经公布，包含chra08_8024751(c/g)的前后各400bp序列(共801bp)如seqidno:1所示，包含chra08_11299788(a/g)的前后各400bp序列(共801bp)如seqidno:2所示，包含chra08_10445600(a/g)的前后各400bp序列(共801bp)如seqidno:3所示。本领域技术人员可以采用常规方法根据已知序列设计检测snp位点的特异性引物或探针，所述引物或探针还可通过本领的常规技术标记有荧光基团，如fam、hex、vic、rox等，以及淬灭基团如bhq1或tamra，从而可以通过本领域的常规方法如测序或pcr等方法检测上述snp位点的基因型，由此可以检测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，预测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，进而对甘蓝型油菜种子油酸含量的高低进行有效选择，用于种子油酸含量的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜油酸含量育种的进程。

因此，本发明通过种子油酸含量的表型分析和全基因组重测序，然后进行全基因组关联分析，在甘蓝型油菜第a08号染色体上检测到一个甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点，对甘蓝型油菜种子油酸含量的贡献率为71.00％。该甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点位于甘蓝型油菜的a08染色体的第8024751位碱基～第11299788位碱基之间，边界显著snp为chra08_8024751(c/g)，chra08_11299788(a/g)，峰值snp为chra08_10445600(a/g)，根据该与主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，可以用于检测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，可以用于预测甘蓝型油菜种子油酸含量的高低，可以用于对甘蓝型油菜种子油酸含量的高低进行有效选择，还可以用于种子油酸含量的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜油酸含量育种的进程。

通过本发明公布的snp分子标记进行分子标记辅助选择，鉴定方法简单，选择效率高，可预测甘蓝型油菜种子油酸含量。选择目标明确，不受环境的影响。可在甘蓝型油菜生育早期鉴定出种子油酸含量早的甘蓝型油菜单株，淘汰其它单株。综上，本发明的甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点对甘蓝型油菜种子油酸含量的贡献率高，对甘蓝型油菜种子油酸含量的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>甘蓝型油菜种子油酸含量的主效qtl位点、snp分子标记及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>801

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus,l.)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(801)

<223>包含chra08_8024751（c/g）的前后各400bp序列的基因组序列

<400>1

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus,l.)

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus,l.)

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<220>

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