本发明涉及一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术：
恶性肿瘤侵袭/转移是患者治疗后复发与死亡的主要原因，特别是对于化疗抵抗且缺乏明确基因靶向治疗的恶性肿瘤，传统疗法效果不佳。以沙门氏菌为基础的免疫治疗具有“特洛伊木马”式肿瘤攻击特性，被用于这些难治性肿瘤的治疗。研究显示，沙门氏菌在治疗肺癌、乳腺癌、结肠癌等方面取得了一定的研究成果，但目前还处于发展的早期，研究人员仍需进行大量深入研究。
为了适应生产和研究需求，通常需要快速大量的培养沙门氏菌，目前培养沙门氏菌的方法主要是将活化后的菌液在lb培养基中摇床培养，但是，此法培养的沙门氏菌的增菌速度较慢，不能满足生产和研究的需求。为实现沙门氏菌的快速增菌，需要对沙门氏菌的传统培养基和培养方法进行改进。
技术实现要素：
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法。
本发明技术方案如下：
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，包括以下步骤：
s1：挑取单菌落，转至液体培养基中进行活化，得活化菌液；
s2：将活化菌液接种至25～28℃增菌培养基中培养，在第1～2h向增菌培养基中加入12～18mg/l的柠檬酸、2～7mg/l维生素b1和25～30mg/l胆盐；在第4～5h，将培养基温度控制在30～33℃后补加20～30mg/l的l-谷氨酰胺和1.5～3g/l甘油，并继续培养至少2h；
其中，所述增菌培养基包括以下成分：
优选的，所述胆盐为3号胆盐。
优选的，步骤s2的培养基置于空气摇床上培养，空气摇床速度280～300rpm。
优选的，步骤s1为：挑取单菌落，转至lb液体培养基中，置于35～37℃空气摇床上培养12～16h，得活化菌液；空气摇床速度为200～220rpm。
优选的，步骤s2中，将活化菌液稀释至od600值为1～2，按2～3％(v/v)的接种量接种至25～28℃增菌培养基中培养。
优选的，本发明所述的方法适用于野生型鼠伤寒沙门氏菌的培养。
为了克服机体免疫系统对沙门氏菌的清除作用，提高“特洛伊木马”式的沙门氏菌的肿瘤靶向性能，研究者对沙门氏菌进行了基因工程改进，减少其毒性反应，减少中性粒细胞为主的免疫系统对细菌的清除，以便于肿瘤靶区能富积到足够量的沙门氏菌。发明人团队也进行了相关研究，通过基因工程的方法成功构建了“特洛伊木马”s.t-δpglux/pt-clya，s.t-δpglux/pt-clya为存在鸟苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸合成缺陷且携带clya基因和荧光素酶基因的鼠伤寒沙门氏菌。(chenjq,zhanyf,wangw,jiangsn.theengineeredsalmonellatyphimuriuminhibitstumorigenesisinadvancedglioma[j],oncotargetsther,2015,15(8):2555-2563.)。发明人团队前期研究结果显示，沙门氏菌s.t-δpglux/pt-clya具有明显的肿瘤抑制作用，显示该菌在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。为了满足该菌的大量生产和研究需求，需要寻找一种可快速大量生产该沙门氏菌的方法。发明人意外发现，本发明前述的生产方法特别适用于沙门氏菌s.t-δpglux/pt-clya的生产。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
a.本发明主要采用的是间歇补加的方式，在活化菌液培养的第1～2h向增菌培养基中加入12～18mg/l的柠檬酸、2～7mg/l维生素b1和25～30mg/l胆盐；在第4～5h，改变培养基温度为30～33℃后补加20～30mg/l的l-谷氨酰胺和1.5～3g/l甘油，并继续培养至少2h；通过间歇补加的方式，并结合增菌培养基的合理配置，实现沙门氏菌的大量增殖。采用本发明方法，活化菌液培养7-9h左右，od600值达到3.0-3.5，相比于常规方法，菌液浓度明显提高，可见，本发明方法可在较短时间内大量生产沙门氏菌，满足生产和研究需求，非常适合产业化应用。
b.本发明方法不仅适用于野生型沙门氏菌的大量培养，更适用于存在鸟苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸合成缺陷且携带clya基因和荧光素酶基因的鼠伤寒沙门氏菌的大量培养。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例4所述鼠伤寒沙门氏菌由常规分离方法获得，也可采用市售标准菌株atcc14028。
本发明实施例1～3所述鼠伤寒沙门氏菌为文献(chenjq,zhanyf,wangw,jiangsn.theengineeredsalmonellatyphimuriuminhibitstumorigenesisinadvancedglioma[j],oncotargetsther,2015,15(8):2555-2563。)所述s.t-δpglux/pt-clya。
实施例1
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，包括以下步骤：
s1：挑取单菌落，转至lb液体培养基中，置于35℃空气摇床上培养12h，得活化菌液；空气摇床速度为200rpm；
s2：将活化菌液稀释至od600值为1，按2％(v/v)的接种量接种至28℃增菌培养基中，于空气摇床上培养(速度280rpm)，在第1h向增菌培养基中加入12mg/l的柠檬酸、2mg/l维生素b1和25mg/l胆盐；在第4h，将培养基温度控制在30℃后补加20mg/l的l-谷氨酰胺和1.5g/l甘油，并继续培养2h；
其中，所述增菌培养基包括以下成分：
所述沙门氏菌为存在鸟苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸合成缺陷且携带clya基因和荧光素酶基因的鼠伤寒沙门氏菌s.t-δpglux/pt-clya。
实施例2
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，包括以下步骤：
s1：挑取单菌落，转至lb液体培养基中，置于37℃空气摇床上培养16h，得活化菌液；空气摇床速度为220rpm；
s2：将活化菌液稀释至od600值为2，按3％(v/v)的接种量接种至28℃增菌培养基中，于空气摇床上培养(速度300rpm)，在第2h向增菌培养基中加入18mg/l的柠檬酸、7mg/l维生素b1和30mg/l胆盐；在第5h，将培养基温度控制在33℃后补加20～30mg/l的l-谷氨酰胺和3g/l甘油，并继续培养2h；
其中，所述增菌培养基与实施例1相同。
所述沙门氏菌为存在鸟苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸合成缺陷且携带clya基因和荧光素酶基因的鼠伤寒沙门氏菌s.t-δpglux/pt-clya。
实施例3
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，与实施例2的区别是：所述增菌培养基包括以下成分：
实施例4
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，与实施例2的区别是：
所述沙门氏菌为野生型鼠伤寒沙门氏菌。
对比例1
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，包括以下步骤：
s1：挑取单菌落，转至lb液体培养基中，置于37℃空气摇床上培养16h，得活化菌液；空气摇床速度为200rpm；
s2：将活化菌液稀释至od600值为2，按2％(v/v)的接种量接种至37℃增菌培养基中，于空气摇床上培养(速度300rpm)，在第1h向增菌培养基中加入10mg/l的柠檬酸、10mg/l维生素b1和20mg/l胆盐；在第5h，将培养基温度控制在37℃后补加10mg/l的l-谷氨酰胺和5g/l甘油，并继续培养2h；
其中，所述增菌培养基包括以下成分：
所述沙门氏菌为存在鸟苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸合成缺陷且携带clya基因和荧光素酶基因的鼠伤寒沙门氏菌s.t-δpglux/pt-clya。
对比例2
对比例2与实施例1的区别是：
步骤s2为：
将活化菌液稀释至od600值为1，按2％(v/v)的接种量接种至28℃增菌培养基中，于空气摇床上培养(速度280rpm)；在第4h，将培养基温度控制在30℃后补加20mg/l的l-谷氨酰胺和1.5g/l甘油，并继续培养2h。
对比例3
对比例3与实施例1的区别是：
增菌培养基替换为lb液体培养基。
对比例4
对比例4与实施例1的区别是：
一种生产高产的沙门氏菌菌株的方法，包括以下步骤：
s1：挑取单菌落，转至lb液体培养基中，置于37℃空气摇床上培养12h，得活化菌液；空气摇床速度为200rpm；
s2：将活化菌液稀释至od600值为1，按2％(v/v)的接种量接种至37℃增菌培养基中，于空气摇床上培养(速度280rpm)8h。
对比例5
对比例5与实施例1的区别是：
将维生素b1替换为维生素b12；
将甘油替换为葡萄糖；
将l-谷氨酰胺替换为甘氨酸。
试验例：
取实施例与对比例所得菌液，于600nm处采用分光光度计测定od值，三次重复取均值，结果见表1。
表1
结果显示：本发明方法不仅适用于生产野生型沙门氏菌，更适用于生产存在鸟苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸合成缺陷且携带clya基因和荧光素酶基因的鼠伤寒沙门氏菌，且培养过程中，菌体大量繁殖，活化菌液培养7-9h左右，od600值达到3.0-3.5，相比于对比例，菌液浓度明显提高，可见，本发明方法可在较短时间内大量生产沙门氏菌，满足生产和研究需求，非常适合产业化应用。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。